Prima identificazione in Italia del cannabinoide sintetico AM-694 quale additivo in un sequestro di Cannabis da fibra

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1 Prima identificazione in Italia del cannabinoide sintetico AM-694 quale additivo in un sequestro di Cannabis da fibra Renata Borriello 1, Anna Carfora 1, Raffaella Petrella 1, Paola Cassandro 1 1 Laboratorio di Tossicologia Forense - Dipartimento di Medicina Sperimentale Facoltà di Medicina e Chirurgia - Seconda Università di Napoli (SUN) - Italia La recente diffusione delle droghe sintetiche attraverso il web ha fatto emergere il fenomeno dell uso dei cannabinoidi di sintesi. Tali molecole, molto numerose e con struttura chimica differenziata, spesso sono presenti in piccola concentrazione in preparati eterogenei cosiddetti naturali (soluzioni, miscugli di erbe, polveri, profumatori di ambiente, etc.) ma non sono identificabili mediante i test di routine applicati per il rilevo del Δ 9 THC e dei relativi metaboliti. Nel presente studio vengono riportate le metodologie analitiche adottate per l identificazione quali-quantitativa in GC/MS ed LC-MS/MS dell AM-694 [1-[(5-fluoropentyl)-1H-indol-3-yl]-(2-iodophenyl)methanone] sequestrato, sotto forma di polvere, in un laboratorio clandestino, contestualmente a circa 59 Kg di foglie di Cannabis da fibra, contenuti in sacchi ed in piccole confezioni già termo sigillate. Le indagini applicate sul materiale vegetale in sequestro hanno dimostrato che l AM-694, al momento del sequestro non ancora tabellato in Italia come stupefacente, risultava presente come additivo solo nelle piccole confezioni già predisposte per lo spaccio, in concentrazione media dell 1,8%. Tale rilievo, risalente all Agosto 2010, è stato comunicato al Sistema Nazionale di Allerta Precoce del, come prima segnalazione in Italia di sequestro di AM-694, sia allo stato puro che presente in preparati vegetali destinati al mercato clandestino. A seguito di questa e di altre segnalazioni, tale principio attivo nel Dicembre 2011, è stato incluso nella Tabella I del DPR 309/90. Parole chiave: Cannabinoidi sintetici, AM-694, GC/MS, LC-MS/MS First identification in Italy of the AM-694 synthetic cannabinoid in a seized sample of Cannabis fibers The recent spread of synthetic drugs over the web has given rise to the phenomenon of synthetic cannabinoids. Differences in the chemical structure of these molecules are manifold and their presence is often detected - in small concentrations- in heterogeneous preparations socalled natural (solutions, mixtures of herbs, powders, environment perfumes, etc.). However they cannot be detected by routine drug test for the identification of Δ9THC and its metabolites. The study focused on the analytical methods adopted for either the identification and the quantitative analyses of GC/MS and LC/ MS/MS of AM-694 [1- [(5-fluoropentyl)-1H-indol-3-yl]-(2-iodophenyl)methanone] detected in seized powder and collected in a clandestine laboratory, together with about 59 Kg of leaves of Cannabis fibers, contained in bags and in small thermo sealed packages. The analyses showed that AM-694 was not yet scheduled in the Italian official drugs list and its presence was detected as additive in small packs previously prepared for smuggling and with a concentration of 1.8%. The findings dated August 2010 were communicated to the National Early Warning System of the Department of Drug Control Policy and registered as first seized AM-694 samples in Italy, collected both in the pure form and in herbal preparations for the black market distribution. As a result of this report and other reports, in December 2011 the active ingredient was included in Schedule I of the DPR 309/90 in Italy. Keywords: Synthetic Cannabinoids, AM-694, Smart drug, LC-MS/MS or GC/MS analysis of AM-694 Contatti: Prof.ssa Renata Borriello Facoltà di Medicina e Chirurgia - Seconda Università di Napoli (SUN) Laboratorio di Tossicologia Forense - Dipartimento di Medicina Sperimentale Via L. Armanni n Napoli (Italy) tel.: fax: renata.borriello@unina2.it 92

2 cannabinoide sintetico AM-694 quale additivo Premessa La diffusione delle droghe sintetiche ha subito, negli ultimi decenni, una continua evoluzione, misurabile attraverso il riscontro di sempre nuove sostanze psicotrope nei sequestri delle droghe da strada (fentanyl anni 80; fenetilamine 80/ 90; triptamine 90; piperazine 05; catinoni 06). In particolare dal 2008 la molteplicità delle molecole cannabimimetiche, di natura sintetica, diffuse sul mercato attraverso i siti Internet e commercializzati negli Smart Shop, ha rappresentato una continua sfida per i laboratori di tossicologia forense, che sono stati costantemente impegnati a sviluppare nuove metodologie analitiche atte a definire, sotto il profilo sia qualitativo che quantitativo, nuovi e diversi principi attivi, presenti in sequestri di preparati eterogenei (soluzioni, miscugli di erbe, polveri, profumatori di ambiente, etc.) cosiddetti naturali ed apparentemente legali. In tale contesto si ritiene pertanto opportuno segnalare le attività analitiche svolte in relazione al primo rilievo in Italia (agosto 2010) del principio attivo AM-694, individuato come additivo in preparati di Cannabis da fibra. Al momento del sequestro infatti, tale cannabinoide non risultava classificato come stupefacente in Italia né in altri paesi europei, ma il Sistema Nazionale di Allerta Precoce del Dipartimento Politiche Antidroga, in connessione col sistema di allerta europeo, ne aveva già segnalato la presenza in Irlanda e in Inghilterra nel Luglio Descrizione del caso Nel mese di agosto 2010, nel corso di un sopralluogo effettuato in una abitazione in cui era allestito un laboratorio clandestino, furono sequestrati 10 g di polvere biancastra confezionati in una bustina sigillata, proveniente dall Olanda, etichettata come 1-[(5-fluoropentyl)-1h-indol-3-yl]-(2-iodophenyl)metanone (Fig.1-2). Contestualmente alla polvere venivano sequestrati anche 8 sacchi di foglie di Cannabis dal peso di 7 kg ciascuno (kg 56 totali), ancora integri, proveniente dalla Germania (Fig.3). Tale Cannabis risultava vendibile senza restrizioni legali in quanto già certificata da fibra, con THC inferiore allo 0,5%. Nel laboratorio furono inoltre sequestrati bilancini, alcol metilico, soda caustica, n. 2 confezioni di Cannabis proveniente da una coltivazione autorizzata (da fibra), sita nella Regione Campania (totali kg 2) e n. 30 piccole bustine termo sigillate contenenti ciascuna circa 300 mg di foglie di Cannabis. Su richiesta dell Autorità Giudiziaria, parte del materiale in sequestro (polvere e Cannabis) è pervenuto al laboratorio di Tossicologia Forense della Seconda Università di Napoli, per approfondimenti analitici rispetto alle prime indagini già effettuate presso il Laboratorio di Analisi per le Sostanze Stupefacenti (LASS) dei Carabinieri. Materiale e metodi Estrazione Sui reperti in esame, per l identificazione del contenuto in Cannabinolo (CBN), Δ 9 Tetraidrocannabinolo (Δ 9 THC) e Cannabidiolo (CBD) e per la ricerca sistematica di eventuali altri principi attivi, sono stati applicati i seguenti metodi: a) estrazione del materiale vegetale in cicloesano (I.S. C 26 ) b) estrazione del materiale vegetale e della polvere con sistema TOXI LAB - A (Varian) (sistema tampone a ph = 9 con miscela cloroformio/isopropanolo (9:3) (I.S. Scopolamina). c) estrazione del materiale vegetale e della polvere con Alcol Metilico, previa sonicazione per 40 minuti in bagno termostatato a 30 C; Analisi strumentale Fig. 2 - Etichetta della bustina di polvere Gli estratti sono stati sottoposti ad analisi strumentale in spettrometria di massa (GC/MS e LC-MS/MS), nelle condizioni Fig. 1 - Polvere biancastra proveniente dall Olanda Fig. 3 - Foglie di Cannabis da fibra 93

3 Fig. 4 Separazione e spettro di massa dell AM-694 in GC/MS in alcol metilico (150 μg/ml) 94

4 cannabinoide sintetico AM-694 quale additivo Fig. 5 Separazione e spettro di massa dell AM-694 in LC-MS/MS (1,5μg/mL) di seguito indicate in prima istanza con lettura in SCAN contro standard certificati di JWH-018; JWH-200; JWH-250; JWH-073; CP-47,497; AM-694. Dopo valutazione dei tracciati ed il riconoscimento dello spettro di massa, la successiva determinazione quantitativa del cannabinoide AM-694 è stata eseguita sia in GC/MS con acquisizione in SIM che in LC-MS/MS. Condizioni GC/MS su Spettrometro Agilent 5973N Colonna: MS5 (0,25 id x 30 m) operante in Temperatura programmata a 70 C (2min.); rate 40 /min fino a 160; rate 8 min fino a 290 C (10 min.) Injector: 270 C in Splitless mode; Acquistion Mode: SCAN e SIM ( ioni m/z ) Condizioni LC-MS/MS su AB Sciex 3200 Scan type MRM; Scan time (sec) 0.01; Scan width (m/z) 0. 2; Polarity positive Condizioni strumentali specifiche per AM-694: Transizioni DP EP CE CXP Separazione cromatografica su Agilent 1200 COLONNA: Agilent Eclipse XDB-C18 (4,6 mm x 50 mm particle size 1,8 μm) Eluenti: A: H 2 O + 0.5% Ac. Formico; B: Acetonitrile + 0.5% Ac. Formico; Flusso 0.9 ml/min Gradiente LC: T (min) Fase A Fase B 0 95% 5% 5 0% 100% 7 0% 100% % 5% 10 95% 5% La curva di calibrazione allestita in GC/MS nel range di concentrazioni μg/ml di AM-694 ha esibito un Coefficiente di correlazione pari a 0,999; in LC-MS/MS è stata ottenuta una correlazione di 0,998 nel range 0-15 μg/ml. Risultati e Discussione Il Cannabinoide AM-694 (con denominazione IUPAC:1-[(5- fluoropentyl)-1h-indol-3-yl]-(2-iodophenyl)metanone, CAS Number: , Formula bruta :C 20 H 19 FINO e Peso 95

5 molecolare: ) viene riportato in un brevetto (Patent US A1) 4 riguardante la sintesi e la caratterizzazione di diversi altri derivati indolici con proprietà cannabis mimetiche e caratteristiche potenzialmente utili nel trattamento del dolore, del glaucoma, dell epilessia e della nausea associata alla chemioterapia. L AM-694 viene descritto come molecola molto potente e con più elevata selettività verso il recettore endogeno CB 1 rispetto al CB 2. Le rispettive costanti di binding sono infatti, per il CB 1 Ki=0,08 nm e per il CB 2 Ki=1,44nM. Considerate tali caratteristiche farmacodinamiche la molecola è stata utilizzata, dopo marcatura isotopica (utilizzando il 18 F come marcatore radioattivo, per ottenere il [ 18 F]AM694), come radio tracciante per esperimenti di mappatura dei recettori CB 1 nelle diverse aree dell organismo, incluso il cervello 5 Tale Cannabinoide mimetico possiede una catena alchilica fluorurata potenzialmente in grado di produrre, in vivo, metaboliti tossici quali l acido 5-fluoropentanoico e l acido 3-fluoropropanoico, le cui tossicità non sono elevate, ma è stata ipotizzata anche la formazione di derivati maggiormente tossici 6-7. Pertanto il rischio connesso all assunzione di tale sostanza non risulta ancora perfettamente definibile poiché dei metaboliti ipotizzati non sono ancora noti i tempi di permanenza in vivo ed inoltre possono essere molto variabili le dosi assunte e le vie di somministrazione. Nel caso giunto alla nostra osservazione, considerato che attraverso il web vengono spesso offerti in vendita prodotti con falsa etichettatura, è stato necessario in prima istanza procedere alla caratterizzazione quali-quantitativa della polvere onde verificare l effettiva presenza dell AM-694 e solo successivamente si è proceduto all analisi degli altri materiali in sequestro onde verificarne l eventuale potenziale attività stupefacente. Le indagini eseguite sulla polvere proveniente dall Olanda, in GC/MS ed in LC-MS/MS, come evidenziato nelle Fig. 4 e 5, hanno dimostrato che effettivamente l AM-694 rappresentava l unico principio attivo in essa presente per il 97%. Inoltre tale cannabinoide mimetico è risultato presente in concentrazione media del 1,8%, solo nelle bustine già confezionate e contenenti ciascuna circa 300 mg di foglie di Cannabis. Viceversa i sacchi di Cannabis da fibra, provenienti dalla Germania e dalla Campania risultavano negativi sia per l AM-694 che per altri cannabinoidi mimetici. La ricerca del Δ 9 Tetraidrocannabinolo (Δ 9 THC), principio attivo stupefacente della Cannabis, in tutti i reperti contenenti materiale vegetale, ha fornito sempre risultati inferiori allo 0,3%. Tale esito ha consentito di confermare che il materiale contenuto sia nei sacchi di provenienza estera che in quelli coltivati in regione Campania e nelle singole bustine, proveniva effettivamente da piante da fibra. Pertanto è stato supposto che, nel laboratorio clandestino, il Cannabinoide mimetico AM-694 venisse utilizzato come additivo con proprietà stupefacenti in un prodotto privo di attività, al fine di garantire al consumatore un effetto psicotropo e contemporaneamente sfuggire ai test preliminari, che le forze dell ordine eseguono sui reperti sequestrati sul mercato illecito. In particolare va segnalato che, al momento del sequestro, tale procedura, rappresentava una alternativa non perseguibile legalmente sia al reato di coltivazione illecita di Cannabis che al reato di spaccio in quanto la presenza dell AM-694 sarebbe certamente sfuggito ai controlli di laboratorio, se non fossero state applicate metodologie specifiche, idonee al riconoscimento di tale principio attivo (GC/MS o LC-MS/ MS) o in caso di indisponibilità di uno standard di riferimento certificato o di uno spettro di massa consultabile in letteratura. Ulteriore criticità sotto il profilo tossicologico forense era rappresentata dal fatto che l AM-694 non risultava all epoca sotto controllo in nessuno dei paesi europei nonostante vi fossero state due precedenti segnalazioni, una in Irlanda e l altra nel Regno Unito (Luglio 2010), relative alla presenza di tale principio attivo rispettivamente in un blend di erbe denominato Shamrock ed in un altro etichettato Loco Elite. Il caso da noi segnalato al sistema di allerta rapida del Dipartimento Nazionale Antidroga (SAPD) riguardava il mese successivo ed è stata la prima segnalazione in Italia per l AM- 694, sequestrato non in prodotti provenienti da Smart Shop ma come principio attivo allo stato puro. Tale rilievo ha confermato la estrema rapidità di diffusione di tali prodotti attraverso il Web e l esigenza di porre sotto controllo normativo in genere tutti i cannabinoidi mimetici. A seguito di questa e di altre segnalazioni, in Italia l AM-694 è stato classificato nella Tabella I del DPR 309/90 e succ. mod. con il D.M. 29/12/2011 (G.U. n. 3 del 4/1/2012). Bibliografia 1. EMCDDA (2010), EDND database, AM Journal of organic chemistry (1956), Vol. 21, 739 cited by EMCDDA (2010) 3. Nature (1953) Vol. 172, Pg cited by EMCDDA (2010). 4. Makriyannis A., Deng H., (1956), Cannabimimetic indole derivatives. Patent S A1. 5. Wills P.G., Katoch - Rouse R., Horti A.G. (2003), Regioselective F-18 radiolabeling of AM694, a CB1 cannabinoid receptor ligand, Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, 46 (9): Millington J. E., Pattison F. L. M., (1956), Toxic fluorine compounds: xii. esters of ω-fluoroalcohols, Canadian Journal of Chemistry, 34(11): Pattison F. L. M., Howell W. C., Woolford R. G., (1957), Toxic fluorine compounds: xiii. ω-fluoroalkyl ethers, Canadian Journal of Chemistry, 35(2):