CHIMICA BIOLOGICA. Seconda Università degli Studi di Napoli. Metodologie 2. DiSTABiF. Corso di Laurea in SCIENZE BIOLOGICHE.

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1 Seconda Università degli Studi di Napoli DiSTABiF Corso di Laurea in SCIENZE BIOLOGICHE Insegnamento di CHIMICA BIOLOGICA Anno Accademico Metodologie 2

2 Purificazione e studio di proteine/enzima Lo studio delle proteine richiede spesso di avere a disposizione una popolazione di molecole (proteine) omogenea, pura

3 Proteoma Genoma Glioma Lipidoma etc Estratto di E. coli (circa 1000 proteine)

4 Le proteine sono macromolecole che hanno: Un determinato grado di solubilità Un peso molecolare Una carica totale negativa o positiva (anche un pi) Caratteristiche proprietà biologiche Devo poterla riconoscere tra le migliaia saggio di attività

5 Sviluppo di un metodo di saggio adeguato per il riconoscimento della proteina da purificare. Esempio: isolamentodella latticodeidrogenasi da fegato. + 2e- + 2H + NAD + + 2e- + 2H + NADH+H +

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7 IL SAGGIO 1. Deve essere eseguibile rapidamente su molti campioni; 2. Deve indicare in modo affidabile la quantità della proteina desiderata presente ai vari stadi di purificazione (specificità, sensibilità, riproducibilità);

8 Purificazione delle proteine: Il PRINCIPIO - ROMPERE L ORGANIZZAZIONE CELLULARE - REINTRODURRE UN NUOVO ORDINE SULLA BASE DELLE SEGUENTI PROPRIETÀ: 1) Solubilità (in soluzioni saline; in solventi organici; ph della soluzione; temperatura, ecc.); 2) Proprietà acido-basiche (cromatografia a scambio ionico; elettroforesi; focalizzazione isoelettrica; ); 3) Grandezza molecolare (setaccio molecolare/gel-filtrazione; ultracentrifugazione;..); 4) Proprietà idrofobiche (cromatografia ad interazione idrofobica; cromatografia a fase inversa); 5) Proprietà biologiche (cromatografia di affinità)

9 Attività preliminari

10 Controllo di Temperatura e ph Soluzione tampone : soluzione che si oppone alla variazione del ph per aggiunte moderate di acidi o basi. Si tratta generalmente di soluzioni di un acido debole e il suo sale con una base forte (per esempio il sistema acido acetico - acetato di sodio) o, viceversa, di una base debole e il suo sale con un acido forte (per esempio il sistema ammoniaca - cloruro d'ammonio) o ancora di un sale, di una base debole e di un acido debole di acidi e basi forti concentrate. SISTEMI TAMPONE DI USO COMUNE pk Acido acetico - acetato di sodio 4,75 Carbonato d'ammonio 10,22 6,10 e Na fosfato di sodio mono e bibasico 1,93, 6,70 e 12,30 Tricina (N-tris(idrossimetil)metil-glicina) 10,0 HEPES (acido N-2-idrossietilpiperazina-N -2-etansulfonico) 7,50 Tris-Cl (2 ammino-2-idrossimetil propano 1,3-diolo) 8,14

11 Soluzioni fisiologiche Le soluzioni fisiologiche comprendono soluzioni tampone impiegate per incubazioni di breve durata e medium di crescita a lungo termine di colture cellulari, piante o tessuti animali. Le proprietà chimico fisiche delle soluzioni sono pensate per minimizzare gli artefatti e la loro composizione tende a mimare quella dei fluidi corporei. Fattori cruciali delle soluzioni fisiologiche sono la isotonicità del medium rispetto alle cellule e la capacità tamponante ad un ph fisiologico. Una soluzione fisiologica di riferimento è una soluzione contenente 0,9% Peso/Volume di NaCl (cioè circa 9 g/l). Quanto Molare (M)????? 9 g sono 9/58,45 che da 0,154 moli che per litro (0,154 M)

12 Omogenati di organi, tessuti e cellule L omogeneizzazione distrugge il tessuto e rilascia i componenti intracellulari in sospensione. L omogeneizzazione viene anche usata come fase preliminare per la purificazione parziale di organuli cellulari per gli studi sulla compartimentazione metabolica. Per il successo della omogeneizzazione sono molto importanti: i) la scelta del tessuto, ii) le proprietà fisiche e chimiche della soluzione fisiologica usata e, iii) il metodo impiegato per la distruzione delle cellule. Il materiale biologico deve essere ricco di organuli specifici e molto attivo nei processi metabolici di interesse (es. fegato per mitocondri, timo per nuclei). La soluzione impiegata è fondamentale per preservare gli organuli, l integrità metabolica e, se necessario, prevenire alcune attività enzimatiche. Essa deve mantenere le condizioni isoosmotiche, un adatto ph e gli livelli ottimali di ioni inorganici. Di seguito sono elencati alcuni componenti delle soluzioni e la loro funzione.

13 Saccarosio Componente Funzione Impiego Agente osmotico Prevenire il rigonfiamento e l esplosione degli organuli 2-mercaptoetanolo DTT cisteina Agenti riducenti Riduzione dei ponti disolfurici degli enzimi Citrato Etilendiamminotetracetato (EDTA) o Etilenglicoltetracetato (EGTA) Mg ++ Disattivante della desossiribonucleasi neutra Agenti chelanti (rimozione di cationi) Catione bivalente Preservare i nuclei Inattivazione delle proteasi di membrana Preservare l integrità del nucleo e dei ribosomi

14 Distruzione delle cellule Le procedure di omogeneizzazione (così come quelle di purificazione delle proteine!) implicano necessariamente una fase di distruzione cellulare. La scelta del metodo dipende dalla natura della parete/membrana cellulare da distruggere. Cellule di mammifero. 10 µm. Membrana plasmatica Cellule vegetali. 100 µm. Parete rigida (complessi di carboidrati, lignina o cera) Cellule batteriche. 1-4 µm. Parete estremamente rigida (peptidoglicani) Cellule di funghi e lieviti. vario. Parete estremamente rigida (polisaccaridi)

15 Omogeneizzatori. Waring-Blender ed il Polytron. Metodi di distruzione delle cellule Meccanici, chimici ed enzimatici. Mortaio con pestello di ceramica Altri metodi meccanici La French Press è il sistema più impiegato per cellule con parete estremamente rigida (microbi). Gli omogeneizzatori Dounce e Potter-Elvehjem distruggono le cellule forzandone il passaggio (mediante pressione esercitata manualmente o automaticamente) attraverso il ristretto spazio tra pestello e parete. Sonicatori. Bagni o sonde ad immersione capaci di generare onde sonore ad alta frequenza (ultrasuoni). La distruzione delle cellule avviene per il fenomeno denominato cavitazione.

16 Metodi enzimatici. Le pareti cellulari possono essere degradate utilizzando enzimi specifici. Il lisozima ad esempio taglia i peptidoglicani e può essere quindi utilizzato per i batteri mentre zimolasi e liticasi esercitano la medesima funzione sulle pareti dei lieviti. La chitinasi viene invece impiegata per i funghi filamentosi. Shock osmotico. L utilizzo di una soluzione ipotonica determina l esplosione delle membrane cellulari a causa della penetrazione del solvente nelle cellule. Il metodo può essere impiegato per le cellule non dotate di parete oppure congiuntamente ad altri metodi. Congelamento/Scongelamento. L integrità delle cellule può essere anche danneggiata da rapidi cicli di congelamento/scongelamento. L acqua presente all interno della cellula, formando cristalli di ghiaccio, aumenta di volume e rompe le membrane. Anche in questo caso il trattamento è adatto alle cellule prive di parete. Detergenti e solventi organici. Rottura delle membrane SDS, Triton X 100, Tween 20, Nonidet P40

17 Effettuata la omogenizzazione, come procedere? Quantità? Preparativa o analitica? Grado di purezza? Forma? Nativa o denaturata? Fattori che influenzano la scelta Costo Tempo

18 Esempi Produzione di anticorpi. Produzione di enzimi. Studi di cristallografia o strutturali. Quantità: elevate; Purezza: non elevata; Quantità: elevata; Purezza: non eccessiva; Per utilizzo biotecnologico Quantità: non elevata; Purezza: elevata;

19 Strategia di purificazione Sviluppo di un metodo di saggio adeguato; Selezione del materiale di partenza migliore; Estrazione (solubilizzazione) della proteina; Sviluppo della serie di passaggi di frazionamento, concentrazione e conservazione. Quantizzazione della proteina e calcolo della resa durante la purificazione. Indispensabile: Procedere velocemente, a freddo (se possibile!) ed inattivare le proteasi

20 Selezione del materiale di partenza migliore Se sono disponibili materiali di partenza diversi, scegliere la migliore combinazione dei seguenti parametri: Maggiore quantità di proteina Costi meno elevati Estrazione più agevole

21 Estrazione (solubilizzazione) della proteina Per estrarre una proteina occorre solubilizzarla per i successivi passaggi di purificazione. proteine proteine proteine extracellulari intracellulari di membrana separazione disintegrazione disintegrazione dalle cellule cellulare cellulare separazione da materiale insolubile (chiarificazione dell estratto) isolamento della frazione cellulare isolamento della frazione di membrana, solubilizzazione tecniche cromatografiche (logica nella sequenza)

22 Centrifugazione, tecnica di routine Una particella sottoposta ad un campo centrifugo tende a sedimentare

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25 Il rapporto tra la velocità di sedimentazione di un corpo ideale e della particella in studio soggetto a campo campo centrifugo è detto coefficiente di sedimentazione (è adimensionale).

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27 Centrifugazione in gradiente di densità Nella centrifugazione zonale o a banda si fa pre-formare un gradiente di densità in una provetta mediante il mescolamento in proporzioni diverse di una soluzione a bassa densità con una ad alta densità. Si stratifica il campione da centrifugare sopra la miscela e durante la centrifugazione le proteine si muoveranno attraverso il gradiente e si separeranno secondo i loro coefficienti di sedimentazione. DNA in gradiente CsCl-Etidio bromuro

28 E fondamentale bilanciare le provette!!! Devo bianciare la forza centrifuga

29 Disintegrazione cellulare

30 Ultraturrax Potter

31 Pistone French Press Camera di compressione Valvola a spillo

32 Waring Blendor Sonicatore

33 Chiarificazione dell estratto (1) Allontanamento del particolato: filtrazione (garza o carta) centrifugazioni; Allontanamento degli acidi nucleici: protammina solfato o streptomicina al 2% (p/v); Allontanamento delle proteine con caratteristiche differenti: salting in, salting-out; precipitazione isoelettrica; precipitazione con acetone o alcool; denaturazione al calore.

34 Chiarificazione dell estratto (2) La proteina desiderata ha caratteristiche differenti dalla maggior parte delle proteine presenti nell estratto! E molto acida o molto basica? PRECIPITAZIONE ISOELETTRICA Precipita ad una particolare concentrazione di sali? SALTING-IN, SALTING-OUT Protein solubility Precipita selettivamente in presenza di solventi organici? PRECIPITAZIONE CON ACETONE O ALCOOL. Resiste a temperature elevate? DENATURAZIONE AL CALORE. Protein denaturation C

35 Isolamento della frazione cellulare Centrifugazione frazionata

36 Solubilizzazione delle proteine di membrana

37 Purificazione - tecniche cromatografiche (Logica nella sequenza) 1. Passaggio iniziale ad alta capacità ed alta purificazione (cromatografia affinità); 2. Sequenza di passaggi disposta in modo da utilizzare direttamente il materiale ottenuto da un passaggio per quello successivo, senza troppe manipolazioni (scambio ionico, prima di RP, o gel filtrazione quando c è anche bisogno di un cambio di tampone); 3. Non impiegare mai più passaggi che sfruttano le medesime proprietà della proteina.

38 Cromatografia Tswett 1906 Colonna di vetro riempita con particelle di argilla e lavando successivamente il campione. Fece poi colare, attraverso la colonna, dell'etere di petrolio. Fase mobile e fase stazionaria K r = [A mobile ] [A stazionaria ] devono essere immiscibili tra di loro!, ovviamente

39 Il profilo cromatografico Volume di eluizione

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41 Scambio ionico gel-filtrazione

42 Setaccio molecolare Ve= V0 + kvi Gel-filtrazione o setaccio molecolare Volume di eluizione (ml)

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44 Cromatografia a scambio ionico Eluisco poi variando il ph e/o la forza ionica (concentrazione di Sali) pi e ph di esercizio + - Carica netta della proteuina pi ph

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46 Le resine: una matrice (supporto con uno scambiatore legato covalentemente

47 A PD-L1 3 2 Assorbimento a 280 nm ( ) PD-L4 3 PD-L3 PD-L2 B C X 1 Conduttività( ms/cm) ( ) Picco 1 PD-L1 Picco 2 PD-L3/2 Picco 3 PD-L4 Picco X Chitinasi Numero di frazione (5 ml) Resine diverse differente capacità di separazione

48 Cromatografia di Affinità

49 Cromatografia di Affinità

50 Cromatografia di Affinità

51 Le cromatografia d affinità quindi possono usare anche gli anticorpi, glicoproteine

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53 Profilo cromatografico e saggio d attività

54 La risoluzione delle colonne cromatografiche aumenta all aumentare dei piatti teorici Eluente Fase stazionaria Poca superficie di interazione con l analita, se diminuisco il diametro. Eluente

55 La risoluzione delle colonne cromatografiche aumenta all aumentare dei piatti teorici La zona più piccola lungo la resina in colonna sufficiente all analita per istaurare un equilibrio completo tra le due fasi è chiamata: PIATTO TEORICO. (Ogni colonna ha N-piatti teorici)

56 HPLC (Cromatografia liquida ad alta prestazioni). Per aumentare la risoluzione della cromatografie si è aumentata la possibilità di equilibri lungo la colonna (i piatti teorici) per unità di lunghezza. Sono diminuiti i diametri delle sfere della matrice, per aumentare le superfici di interazione. Meno spazi tra le sfere e maggiori difficoltà di passaggio dell eluente, per ovviare l eluente si applica sotto pressione. L HPLC è tra i metodi più usati nei LAB per separare qualsiasi cosa -> analita e/o proteine.

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58 1000 piatti teorici piatti teorici litri di campione

59 Quali principi di separazione? tutti, ma in particolare la cromatografia a fase inversa

60 Il saggio può essere quantitativo e quindi posso definire delle Unità di Misura L'unità enzimatica (U, nota anche come Unità internazionale di attività enzimatica) è un'unità di misura della quantità di un particolare enzima.

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62 Come seguire l andamento della purificazione di proteina? Ad ogni passaggio determinare: 1- Attività specifica= Unità enzimatiche mg di proteine totali 2-Resa = U di proteina di interesse nella frazione U di proteina di interesse nella preparazione originale X Grado di purificazione= attività specifica della frazione attività specifica iniziale

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66 MOVIMENTO DI MOLECOLE IN UN CAMPO ELETTRICO O ELETTROFORSI

67 Elettroforesi: movimento di molecole o macromolecole in un campo elettrico In condizioni native o in presenza di SDS (nota come SDS-PAGE) + pi - Carica netta della proteuina ph perché in un picco ci possono stare più proteine

68 Poso seguire la purificazione, aumenta solo la mia proteina

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70 Eletttroforesi SDS-PAGE

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73 SDS-PAGE metodica analitica per verificare la purezza di una proteina

74 Proteina omogenea a quantità crescenti

75 Isoeletrofocalizzazine Anfoline, formano un gradiente di ph

76 Focalizzazione isoelettrica

77 Elettroforesi bidimensionale

78 2D-PAGE

79 Sviluppo dei passaggi per il cambiamento di tampone e la concentrazione del campione - Precipitazione (entrambi) - Filtrazione (entrambi) TECNICHE AUSILIARIE - Cromatografia per gel filtrazione (cambio tampone) - Dialisi (cambio tampone) Ultrafiltrazione Dialisi Provetta di recupero Camera di caricamento Campione concentrato Membrana Supporto inerte Guarnizione Ultrafiltrato Campo centrifugo

80 Ultrafiltrazione TECNICHE AUSILIARIE Celle Amicon

81 Sulla proteine pura si potranno determinare: - Spettro di assorbimento - Composizione amminoacidica - Sequenza amminoacidica (struttura primaria) vediamo. - Peso molecolare - Punto isoelettrico; - Struttura secondaria, terziaria e quaternaria - Proprietà biologiche Struttura e Funzione!!!!!

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83 La determinazione della struttura primaria prevede di lavorare con un singolo polipeptide/proteina, quindi se lo struttura quaternaria dei separare i differenti polipeptidi e se sono legati da ponti disolfuro ridurli.

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86 Determinazione della sequenza di una proteina struttura primaria: degradazione di Edman La degradazione di Edman permette di staccare chimicamente un amminoacido alla volta dall N-terminale. La reazione tra amminoacidi e fenilisotiocianato permette anche di rendere gli amminoacidi staccati più facilmente monitorabili, aggiungendo un gruppo fenilico. L ambiente iniziale è basico poiché.

87 Ambiente acido senza acqua derivato fenilidantoil

88 PTH amminoacidi

89 La reazione non ha una resa del 100%, quindi non si può ottenere la struttura primaria completa di una proteina

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93 Enzimi per proteolisi specifici: Tripsina, taglia a K ed R

94 Frammentazione chimica con CNBr: frammenta a Met

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96 Rappresentazione schematica della determinazione della sequenza di una proteina: il procedimento della sovrapposizione.

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98 Spettrometria di Massa

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100 Citocromo C (100aa, E. Smith - E. Margoliash analisi della sequenza di 80 specie, particolarmente conservate regioni che sono in contatto con eme e Gly, Cyt ossidasi umana reagisce con Cyt c di germe di grano)

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103 Nanometri, distanza tra gli atomi

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105 Per ottenere cristalli ci voglio sistemi ordinati

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107 Diffrazione ai raggi X Struttura terziaria

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