ABX Pentra. HbA1c WB. Reagente diagnostico per la determinazione in-vitro dell'emoglobina A1c (HbA1c). A11A01702

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1 (Sangue intero) Rif. : A11A01702 Volume R1 : 1 x 23 ml Volume R2 : 1 x 23 ml Volume R3 : 1 x 110 ml Volume R4 : 2 x 21 ml Volume R5 : 1 x 25 ml Reagente diagnostico per la determinazione in-vitro dell'emoglobina A1c (HbA1c). ABX Pentra 2006/03/30 A93A01022H IT A11A01702 Sangue intero 1 x 23 ml Aspetti di interesse clinico(1,7): L'HbA1c è il risultato della fissazione non enzimatica del frammento N- terminale della catena β dell'emoglobina A0. Il tasso di HbA1c proporzionale al tasso di glucosio nel sangue rispecchia la concentrazione media quotidiana del glucosio nei mesi precedenti al prelievo. Studi recenti hanno dimostrato che un dosaggio regolare di HbA1c può comportare modifiche alla terapia del diabete e un più efficace controllo metabolico, come rivela la diminuzione dei valori di HbA1c. Questo metodo diagnostico in vitro è quindi utilizzato per la determinazione quantitativa dell'emoglobina A1c (HbA1c), un marcatore del diabete, nel sangue umano. Le quantità rilevate attraverso questa procedura possono essere utilizzate per il controllo a lungo termine dei diabetici. 1 x 23 ml 1 x 110 ml 2 x 21 ml 1 x 25 ml HORIBA ABX BP Montpellier - cedex 4 - France Form-0846 Rev. 2 Metodo L'HbA1c viene espresso come percentuale della concentrazione di emoglobina totale. Per determinare la concentrazione di THb mediante spettrofotometria, è necessario trasformare le diverse forme di emoglobina in un'unica forma con spettro di assorbimento uniforme. I valori dell'hba1c e dell'emoglobina totale (THb) in µmol dati dal test di HbA1c vengono utilizzati per il calcolo del rapporto HbA1c/THb e non devono essere utilizzati singolarmente per la diagnosi. Principi di analisi (8): Le concentrazioni di HbA1c e di emoglobina totale vengono determinate; il rapporto fornisce come risultato finale la percentuale di HbA1c. La determinazione dell'hba1c in percentuale comporta l'utilizzo di cinque reagenti: l'antibody Reagent (R1) diluito con il Diluent I (R5), l'agglutinator Reagent (R2), l'hemolysis Reagent (R3) e il Total Hemoglobin Reagent (R4). Il campione di sangue intero viene miscelato all'hemolysis Reagent (R3) con l'analizzatore: gli eritrociti vengono lisati e la catena dell'emoglobina viene idrolizzata mediante l'azione di una proteasi presente nel reagente. Il Total Hemoglobin Reagent (R4) viene utilizzato per determinare l'emoglobina totale. Il metodo si basa sulla trasformazione di tutte le forme di emoglobina in ematina alcalina all'interno di una soluzione alcalina di detergente non ionico, secondo quanto descritto nella procedura originale di Wolf et al. La reazione viene scatenata dall'aggiunta del campione di sangue trattato al Total Hemoglobin Reagent (R4) e la soluzione acquisisce una colorazione verde. La trasformazione di tutte le forme di emoglobina in ematina alcalina con uno spettro di assorbimento definito permette il calcolo della concentrazione di emoglobina totale. La concentrazione di emoglobina viene determinata attraverso un metodo del punto finale a 600 nm. La concentrazione di emoglobina è direttamente proporzionale all'aumento della DO osservato. Per misurare l'hba1c specifico si utilizza un test di inibizione dell'agglutinazione al lattice. Un agglutinante (polimero sintetico contenente più esemplari della frazione immunoreattiva dell'hba1c) causa l'agglutinazione delle particelle di lattice rivestite di anticorpi monoclonali di topo specifici dell'hba1c. In mancanza di HbA1c nel campione, l'agglutinante dell'agglutinator Reagent (R2) e le microparticelle rivestite di anticorpi dell'antibody Reagent (R1) si agglutinano. Tale agglutinazione causa a sua volta un aumento dell'assorbanza della sospensione. La presenza di HbA1c nel campione riduce il tasso di agglutinazione dal momento che l'hba1c entra in competizione con l'agglutinator Reagent (R2) a livello dei siti di legame degli anticorpi delle microparticelle. Maggiore è la quantità di HbA1c nel campione e più debole sarà il tasso di agglutinazione. La reazione è determinata tramite assorbanza a 600 nm e il tasso di agglutinazione viene utilizzato per il calcolo della concentrazione in base ad una curva di taratura. La percentuale di HbA1c viene quindi calcolata utilizzando i valori dell'hba1c e dell'emoglobina totale in µmol.

2 Reagenti ABX Pentra è un kit multireagente. Contenuto del kit: Reagente 1: Antibody Reagent 1 x 23 ml Reagente 2: Agglutinator Reagent 1 x 23 ml Reagente 3: Hemolysis Reagent 1 x 110 ml Reagente 4: Total Hemoglobin Reagent 2 x 21 ml Reagente 5: Diluent I 1 x 25 ml Hemolysis Reagent reagente 3 Total Hemoglobin Reagent reagente 4 Agglutinator Reagent reagente 2 Antibody Reagent reagente 1 (diluito) Antibody Reagent (R1) Contiene: particelle associate agli anticorpi dell'hba1c (topo), albumina di siero bovino, tampone, tensioattivo, conservanti. Agglutinator Reagent (R2) Contiene: antigene incompleto a legame covalente con il polimero, albumina di siero bovino, tampone, conservante, tensioattivo. Hemolysis Reagent (R3) Contiene: pepsina suina, tampone, conservante. Il reagente viene venduto anche separatamente con il riferimento A11A Total Hemoglobin Reagent(R4) Contiene: idrossido di sodio, tensioattivo. Diluent I (R5) Contiene: conservante, NaCl. Utilizzare il reagente ABX Pentra secondo le indicazioni specifiche del reagente. HORIBA ABX non garantisce le prestazioni qualora il reagente venga utilizzato in modo non conforme. Manipolazione Antibody Reagent (R1): 1. Miscelare 3 volumi di Antibody Reagent (R1) con 2 volumi di Diluent I (R5) 2. Prima di utilizzare, la miscela per la prima volta, lasciarla stabilizzare per circa un ora nel comparto frigorifero dell ABX Pentra 400. Per il sangue intero, campioni, calibratore e controllo non necessitano di alcun trattamento preventivo. Per il prelievo del sangue intero, si consiglia l'uso di una pipetta volumetrica. Nota: è possibile analizzare 5 campioni simultaneamente. Se è necessario analizzarne più di 5, attendere che sullo strumento si ripristini lo stato Analysing prima di collocare i nuovi campioni al termine dell omogeneizzazione. Calibratore Ai fini della calibrazione, utilizzare gli elementi descritti di seguito. ABX Pentra Cal, rif. A11A01703 (non incluso) 1 x 8 ml + 5 x 2 ml L'emoglobina totale viene calibrata con l'abx Pentra Cal (CAL 1) mediante un valore di riferimento dell'emoglobina totale. I calibratori e i reagenti non dipendono dai lotti e sono soggetti al controllo di qualità interno di ABX. La calibrazione del metodo HbA1c si effettua con l'abx Pentra HbA1c WB Cal, che contiene sei livelli di calibratore HbA1c. Queste procedure di calibrazione sono conformi alla certificazione NGSP/DCCT. Posizione dei calibratori nel rack calibratore: Tutti gli altri reattivi Agglutinator Reagent (R2), Hemolysis Reagent (R3), Total Hemoglobin Reagent (R4) vengono forniti sotto forma di soluzioni pronte per l'uso. 1. Miscelare meticolosamente i reattivi con movimento rotatorio, quindi versarli in un contenitore reattivo. 2. Lasciare stabilizzare i reagenti nel comparto frigorifero dell ABX Pentra 400 prima dell uso. Vedere lo schema riportato in cui viene preso come esempio il settore A, B e C: 1. CAL 1 (200 µl) 2. soluzione fisiologica 3. CAL 2 (150 µl) 4. CAL 3 (150 µl) 5. CAL 4 (150 µl) 6. CAL 5 (150 µl) 7. CAL 6 (150 µl) Nota: la posizione CAL 1 viene presa ad esempio e CAL 1 puó anche essere collocato nelle posizioni 8, 9 o 10.

3 Controllo Ai fini del controllo qualità interno, utilizzare gli elementi descritti di seguito. ABX Pentra HbA1C WB Control, rif. A11A01704 (non incluso) Controllo normale: 2 x 0,25 ml (liofilizzato) Controllo patologico: 2 x 0,25 ml (liofilizzato) Analizzare ogni controllo quotidianamente e/o dopo ogni calibrazione. Adeguare la frequenza dei controlli e gli intervalli di confidenza alle esigenze di laboratorio e alle direttive nazionali specifiche. I risultati devono essere compresi entro i limiti di confidenza definiti. Ogni laboratorio dovrà stabilire la procedura a cui attenersi nel caso in cui i risultati non siano compresi nei limiti di confidenza. Materiali necessari non in dotazione Analizzatore automatico di chimica-clinica. Attrezzature standard per laboratorio. soluzione fisiologica Campione (9) È possibile utilizzare campioni di sangue venoso o di sangue capillare in base alla metodica descritta di seguito. Gli anticoagulanti accettati sono l'acido etilenediaminetetracetico di potassio (K2-EDTA) e l'ammonio eparina (NH 4 -eparina). I campioni di sangue intero prelevati su K 2 -EDTA e NH 4 -eparina possono essere conservati a -70 C fino a sei mesi, a 5 C fino a due settimane o a 25 ºC e oltre fino a una settimana. I campioni congelati devono essere scongelati a temperatura ambiente e quindi miscelati meticolosamente prima dell'uso. Miscelare con cura i campioni di sangue poco prima dell'esecuzione del test al fine di garantire risultati esatti di THb. Intervallo normale (4,11,13,14) Ogni laboratorio è tenuto a verificare che i propri valori usuali siano compatibili con i valori di riferimento NGSP. Tale tecnica certificata NGSP ha come valori normali dell'hba1c il 4-6% per i non diabetici; l'obiettivo terapeutico è infatti quello di ottenere un valore < 7% come prescritto dall'ada (American Diabete Association). Tutti i risultati relativi al paziente dovranno essere interpretati in relazione all'insieme dei suoi esami clinici. Limiti del metodo (10): La maggior parte dei pazienti ha valori dell'emoglobina compresi tra 4,4 mmol/l e 14,4 mmol/l. Tuttavia, alcune pubblicazioni specializzate mostrano che i pazienti affetti da anemie gravi possono presentare concentrazioni di emoglobina inferiori a 4,4 mmol/l che i pazienti affetti da policitemia possono presentare concentrazioni di emoglobina superiori a 14,4 mmol/l. Se i valori dell'emoglobina dei pazienti noti per questi sintomi sono al di fuori dell'intervallo determinato, è necessario analizzarli con un altro metodo. Qualsiasi causa ingenerante conseguenze per la durata della vita degli eritrociti (ad esempio l'anemia emolitica o altre patologie emolitiche, la gravidanza, una perdita significativa di sangue ecc.) comporterà una diminuzione dell'esposizione dei globuli rossi al glucosio e, di conseguenza, una riduzione dei valori dell'emoglobina glicosilata in percentuale (Ghb). I risultati in percentuale di Ghb non possono ritenersi affidabili per pazienti interessati da perdite di sangue croniche e, conseguentemente, da una durata variabile della vita degli eritrociti. I campioni contenenti le forme dell'emoglobina C e S, se trattati con questa metodica, possono portare a un aumento (fino al 40%) del valore previsto in HbA1c. Nei campioni contenenti quantità rilevanti di emoglobina F (superiore al 10%), la stessa metodica può dare un risultato di Hba1c inferiore a quello previsto. In conclusione, i risultati dell'emoglobina A1c ottenuti con questo test per dei campioni di sangue contenenti forme S, C ed F (superiori al 10%) non devono essere confrontati ai valori normali o anormali pubblicati. È stato dimostrato che un campione contenente emoglobina E non interferisce con la determinazione dell'hba1c mediante questa metodica. Non sono stati svolti studi sull'interferenza delle emoglobine carbamilate e acetilate per questo reagente. La frazione labile dell'emoglobina glicata (sito di legame Schiff del glucosio all'emoglobina A o A1c) non influisce sui risultati poiché l'anticorpo è specifico della chetoamina stabile. Conservazione e stabilità Tenere lontano dal calore estremo, dalla luce o dal gelo. Stabilità dei reagenti (chiusi e dopo l'apertura) Se conservati a una temperatura compresa tra 2 e 8 C nella confezione originale e al riparo da eventuali contaminazioni, i reagenti sono stabili fino alla data di scadenza riportata sull'etichetta. Procedura di analisi È possibile richiedere istruzioni per test eseguiti con sistemi automatici diversi da ABX Pentra 400. Gestione dei rifiuti Attenersi alle disposizioni locali in vigore.

4 Precauzioni di carattere generale 1. Il reagente può essere utilizzato esclusivamente a fini diagnostici in-vitro. 2. Antibody Reagent (R1): per la preparazione del prodotto sono stati utilizzati componenti di origine umana. Ogni unità di donazione è stata sottoposta ai test per la determinazione dell'antigene di superficie dell'epatite B (HBsAg), degli anticorpi dell'epatite C (HCV) e del Virus della Immunodeficienza Umana (HIV-1 e HIV-2); la ricerca ha dato risultati negativi (senza reattività ripetuta). Attenzione. Poiché nessun test è in grado di garantire in modo assoluto l'assenza dei virus HIV, dell'epatite B o C o di altri agenti infettivi, la manipolazione di tali prodotti dovrà effettuarsi tenendo conto che si tratta di campioni di sangue umano potenzialmente infettivi. In caso di esposizione, attenersi alle direttive dell'autorità sanitaria competente. Irritante. S24: evitare il contatto con la pelle. S37: usare guanti adatti. R43: può causare una sensibilizzazione mediante contatto con la pelle. 3. Agglutinator Reagent (R2): irritante. S24: evitare il contatto con la pelle. S37: usare guanti adatti. R43: può causare una sensibilizzazione mediante contatto con la pelle. 4. Antibody Reagent (R1), Agglutinator Reagent (R2), Hemolysis Reagent (R3) e Total Hemoglobin Reagent (R4): evitare il contatto con gli occhi, la pelle e gli indumenti. Dopo avere maneggiato il prodotto, lavarsi accuratamente le mani con acqua. Non ingerire. 5. Diluent I (R5): irritante. R36/38: irritante per gli occhi e la pelle. R43: può causare una sensibilizzazione mediante contatto con la pelle. 6. Eliminare le fiale dei reagenti dopo l uso. 7. Consultare la scheda di sicurezza specifica del reagente. Prestazioni con ABX Pentra 400 Le prestazioni elencate di seguito sono state determinate sull'analizzatore ABX Pentra 400. Numero di test: 345 test Stabilità della soluzione di lattice ricostituita Se conservata a una temperatura compresa tra 2 e 8 C dopo la ricostituzione, la stabilità della soluzione di lattice ricostituita è di 2 mesi. Utilizzare esclusivamente la quantità necessaria e sostituire immediatamente i reagenti al freddo dopo l'uso. Volume del campione prelevato: 7,3 µl/test di sangue intero Volume del campione (dopo la terapia) Hb: 25 µl/test HbA1c: 2,5 µl/test Limite di rilevabilità Il limite di rilevabilità viene determinato in base al protocollo Valtec (15) ed equivale a 50,02 µmol/l per l'emoglobina totale. Accuratezza e precisione Ripetibilità (intra-serie) 3 campioni di concentrazione bassa, media ed elevata e 2 controlli vengono analizzati per 20 volte in conformità alle indicazioni fornite nel protocollo Valtec (15). Valore medio % CV % Controllo normale 5,37 1,78 Controllo patologico 10,73 1,52 Campione 1 5,48 1,03 Campione 2 8,00 2,07 Campione 3 12,49 1,28 Riproducibilità 2 campioni di livelli basso ed elevato e 2 controlli vengono analizzati in duplice test per 20 giorni (2 serie al giorno) in conformità alle indicazioni fornite nel protocollo NCCLS EP5-A (16). Valore medio % CV % Controllo normale 5,49 2,62 Controllo patologico 11,10 2,73 Campione 1 5,16 2,34 Campione 2 13,67 2,18 Linearità e gamma di misurazione La linearità del reagente viene determinata in base alle indicazioni fornite nel protocollo NCCLS EP6-P (17). Bassa linearità: per l'emoglobila totale: 203 µmol/l per l HbA1c: 54,94 µmol/l Elevata linearità: per l'emoglobila totale: 5125 µmol/l per l HbA1c: 7,80 µmol/l Nota: se la concentrazione di HbA1c è superiore alla massima concentrazione del calibratore (7,80 µmol/l, 319,80 µmol/l con il metodo automatico), non diluire il campione. Calcolare il valore massimo possibile in conformità alla concentrazione HbT e fornire maggiore di... come valore. Esempio: se la concentrazione di HbT determinata dallo strumento è di 2214,00 µmol/l, calcolare il valore: 319,80/2214,00 x 100 = 14,44% di HbA1c. Il risultato è: maggiore di 14,44% di HbA1c. Correlazione È stata effettuata la correlazione di 98 campioni dei pazienti prendendo come riferimento un reagente disponibile in commercio in base alle indicazioni del protocollo NCCLS, EP9-A2 (18). Di seguito è riportata l'equazione per la linea allometrica ottenuta. Y = 1,07 x + 0,04 con coefficiente di correlazione di r 2 = 0,947.

5 Interferenze Trigliceridi: nessuna influenza significativa fino a 7 mmol/l Bilirubina totale: nessuna influenza significativa fino a 353 µmol/l Bilirubina diretta: nessuna influenza significativa fino a 368 µmol/l Glucosio: nessuna influenza significativa fino a 167 mmol/l Stabilità della calibrazione Il reagente viene calibrato il giorno 0. Per controllare la stabilità della calibrazione, vengono analizzati 2 campioni di controllo. La durata della stabilità della calibrazione è 4 settimane. Nota: si consiglia di effettuare nuovamente la calibrazione quando si cambiano i lotti di reagente, in caso di sostituzione della soluzione di lattice e quando i risultati dei controlli della qualità non rientrano nell'intervallo stabilito. Rapporto NGSP Y = (100*886*X-181)/1000 Nota: X = HbA1c/HbT. Versione dell'applicazione a : 4.00 Avvertenza L'utente è tenuto a verificare che il presente documento faccia riferimento al reagente utilizzato. Bibliografia 1. Mayer TK and Freedman ZR: Protein glycosylation in diabetes mellitus: A review of laboratory measurements and of their clinical utility. Clin. Chim. Acta 127; (1983). 2. Baynes JW.Bunn HF, Goldstein DE, et al : National Diabetes Group; Report of the expert committee on glucosylated hemoglobin. Diabetes Care 7; (1984). 3. Koenig RJ, Peterson CM, Kilo C. et al: Hemoglobin A1c as an indicator of the degree of glucose intolerance in diabetes. Diabetes 25; (1976). 4. Nathan DM, Singer DE, Hurxthal K, and Goodson JD: The clinical information value of the glycosylated hemoglobin assay. NE J. Med. 310; (1984). 5. McCarren M: DCCT; and it works: Intensive therapy reduces the risk of diabetic eye, kidney, and nerve disease. Diabetes forecast (September 1993). 6. Larsen ML, Horder M, and Mogensen EF: Effect of long-term monitoring of glycosylated hemoglobin levels in insulindependent diabetes mellitus. NE. J. Med. 323; (1990). 7. Nathan DM: Hemoglobin A 1c. Infatuation or the real thing? NE. J. Med. 323; (1990). 8. Wolf HU, Lang W, and Zander R; Alkaline haematin D-575, a new tool for the determination of haemoglobin as an alternative to the cyanhaemoglobin method. Clin. Chim. Acta. 136; (1984). 9. National Committee for Clinical Laboratory Standards Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Skin Puncturethird edition; approved standard. NCCLS publication H4-A3. Villanova, PA: NCCLS; Knowles BJ, Haigh WB, and Michaud GC: A monoclonal antibodybased immunoassay for hemoglobin A 1c. Diabetes 35; Supplement: 94A (1986). 11. Goldstein DE, Little RR, Wiedmayer HM, et al: Glycated hemoglobin: Methodologies and clinical applications Clin. Chem. 32; (1986). 12. Ellis G. Diamandis EP, Giesbrecht EE, et al. An automated «high pressure» liquid chromatographic assay for hemoglobin A 1c. Clin. Chem. 30: (1984). 13. Burtis CA and Ashwood ER, eds: Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 2 nd edition, WB Saunders Company, Philadelphia, PA. p.2021 (1994). 14. Diabetes Care 2002; 25 (suppl. 1); Vassault A., Grafmeyer D. Naudin C. et al., Protocole de validation de techniques (document B), Ann. Biol. Clin., 1986, 44, Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices, Approved Guideline, NCCLS document EP5-A, Vol. 19, No. 2, february Evaluation of the Linearity of Quantitative Analytical Methods, Proposed Guideline, NCCLS document EP6-P, Vol. 6, No. 18, september Method Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples, Approved Guideline, 2 nd ed., NCCLS document EP9-A2, Vol. 22, No. 19, a. Modifica dall indice G all indice H : Nuova versione dell applicazione.

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