Acido etilendiamminotetraacetico. Spettrometria di massa ESI. Isopropil-β-D-tiogalattopiranoside

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1 ABBREVIAZIONI ATP cdna DTT EDTA ESI ESI/MS HEPES IPTG LB MALDI MALDI/MS MOPS p27 wt PMSF SDS TFA TRIS t-rna Adenosina 5 -trifosfato DNA copia Ditiotreitolo Acido etilendiamminotetraacetico Electrospray Ionization Spettrometria di massa ESI N-(2-idrossietil)piperazina-acido N -(2-Etansolfonico) Isopropil-β-D-tiogalattopiranoside 10 g/l bacto-triptone, 5 g/l estratto di lievito, 10 g/l di NaCl Matrix Assisted Laser Desorption spettrometria di massa MALDI Acido 3-N-morfolino propansulfonico p27 wild-type Fenilmetilsulfonilfluoruro Sodio dodecilsolfato Acido Trifluoroacetico Tris(idrossimetil)ammino metano RNA transfer

2 1. INTRODUZIONE 1.1 Il ciclo cellulare Negli eucarioti le cellule somatiche vanno normalmente incontro ad eventi duplicazionali; da una singola cellula madre, attraverso un ordinata sequenza di eventi, si ottengono due cellule figlie con lo stesso corredo cromosomico della cellula progenitrice. L evento fisico della divisione nucleare viene chiamato mitosi. Il termine ciclo cellulare è comunemente usato per indicare il periodo di tempo che va dalla formazione della cellula, come prodotto di una mitosi, fino al completamento della sua divisione in due cellule figlie. Il ciclo cellulare si articola in 4 fasi: la fase G 1 (6-12 ore) (Fig-1.) durante la quale sono sintetizzati RNA e proteine; la fase S (6-8 ore) che rappresenta il periodo di tempo necessario affinché tutto il DNA della cellula sia duplicato; la fase G 2 (3-4 ore) che copre la transizione dalla fase S alla mitosi ed infine la mitosi (M) stessa. Ognuna di queste fasi è caratterizzata da numerosi eventi che si susseguono in maniera estremamente ordinata, grazie ad un sistema di regolazione che controlla l intero ciclo. Un ruolo chiave, nella regolazione del ciclo cellulare è svolto dalla fosforilazione e defosforilazione di substrati proteici da parte di specifiche chinasi. In particolare, nelle cellule eucariotiche somatiche a questo ruolo sono deputate le serin/treonin chinasi ciclino-dipendenti o CDK. L attività di queste chinasi è a sua volta soggetta ad una serie di complessi meccanismi di controllo. Per essere attive, le CDK, richiedono il legame con specifiche subunità dette cicline. Le cicline che intervengono nelle diverse fasi del ciclo cellulare sono espresse solo durante lo stadio nel quale devono svolgere la propria funzione. La loro classificazione è infatti caratteristica dello stadio del ciclo

3 Fig.-1 Schema del ciclo cellulare, ad ogni fase è associato un complesso ciclina-cdk.

4 cellulare in cui vengono espresse: la ciclina D che interagisce con le CDK2, CDK4, CDK5, interviene nella fase G 1 ; il complesso proteico ciclina E/CDK2 modula la transizione G 1 S; il complesso ciclina A/CDK2 si forma nella fase S infine i complessi ciclina B/A-CDK2 regolano la transizione S G 2 (Sherr et al., 1993). La degradazione di queste subunità avviene probabilmente mediante un meccanismo di tipo proteolico ubiquitina-dipendente grazie a delle sequenze amminoacidiche (destruction box) contenute nella regione N- terminale delle cicline (Morgan., 1995; Glotzer et al., 1991). Un secondo evento necessario all attivazione delle CDK è la fosforilazione di uno specifico residuo di treonina da parte della chinasi CDK attivante o CAK (Fig-2). Il residuo di treonina che viene fosforilato dalla chinasi CAK è un residuo piuttosto conservato (Thr 160/161) e durante il normale ciclo cellulare dei vertebrati il trasferimento di fosfato su questo residuo sembra aumentare parallelamente con la formazione del legame alla ciclina (Krek et al., 1992). Comunque il complesso così formato è in grado di agire quale modulatore positivo del ciclo cellulare. L inattivazione di questi complessi può avvenire in diversi modi ad esempio tramite l intervento di una fosfatasi (CDC25) che rimuove il fosfato sulla Thr 160/161; questo tipo di meccanismo probabilmente agisce sul turn-over del complesso, ne facilita cioè il pathway di degradazione. Alternativamente, l inattivazione del complesso ciclina- CDK, può avvenire per aggiunta di un secondo fosfato, questa volta su un residuo di tirosina (Tyr15) presente nella regione N-terminale del complesso per azione di una chinasi denominata Wee1 (Morgan, 1995). I complessi ciclina-cdk possono infine essere inibiti dall interazione con una seconda classe di proteine: gli inibitori delle chinasi ciclino dipendenti (CKI).

5 Le CKI, appartengono ad una classe di piccole proteine che agiscono da regolatori negativi del ciclo cellulare. Esse hanno sollevato, negli ultimi anni, un interesse sempre maggiore ai fini della comprensione dei meccanismi che regolano la proliferazione cellulare nei mammiferi, oltre che per le loro potenziali applicazioni in campo biomedico. Fig.-2 Schema riassuntivo sulla regolazione dei complessi ciclina-cdk.

6 1.2 Inibitori delle CDK: la proteina p27. Gli inibitori delle chinasi ciclino-dipendenti o CKI formano complessi di natura non covalente con i dimeri ciclina CDK inattivandoli, rendendo possibile così un controllo negativo della proliferazione cellulare. E intuitivo quindi che eventi deregolativi a carico di queste molecole proteiche possono avere un ruolo importante nella cancerogenesi. Le CKI sono divise in due famiglie in base alle loro caratteristiche strutturali ed alla loro specificità di legame. La prima classe di proteine è formata dagli inibitori di CDK4 o INK4 a questa classe appartengono p16 INK4a (Serrano et al., 1993), p15 INK4b (Hannon and Beach, 1994), p18 INK4c (Guan et al., 1994) e p19 INK4d (Chan et al., 1995). Tutte si legano in maniera altamente specifica esclusivamente alla CDK4 ed alla sua isoforma CDK6 (Sherr et al., 1995). Le proteine della famiglia Cip/Kip, invece, legano ed inibiscono esclusivamente i complessi ciclina-cdk che intervengono durante le fasi G 1 ed S. A quest ultima classe di inibitori appartengono: p21 Cip1/WAF1 (Gu et al., 1993), p27 kip1 (Polyak et al., 1994) e p57 kip2 (Lee et. al.,1995). Sebbene queste proteine siano in grado di legare indipendentemente la CDK e la ciclina isolata, esse mostrano un affinità molto maggiore per il legame con il complesso ciclina-cdk (Nakanishi et al., 1995; Lin et al., 1996). Le proteine Cip/Kip sono in grado di inibire le chinasi cicline E-, A- e D-dipendenti e come tali giocano un ruolo importante nel controllo del ciclo cellulare in risposta a fattori anti-mitogeni (Xu et al., 1999). p27, dunque, è un inibitore della famiglia Cip/Kip e come tale è un regolatore negativo del ciclo cellulare, è una piccola proteina di circa 23kDa e viene normalmente espressa in quasi tutti i tessuti umani. Blocca la progressione dalla fase G 1 alla fase S legandosi con il complesso ciclina/e-cdk2 ed inibendone l attività. Le Cip/Kip sono

7 altamente conservate. Tra le proteine di questa famiglia, p21 e p27 mostrano il più alto grado di omologia a livello di sequenza primaria. Fig.-3 Sequenza amminoacidica relativa alla regione N-terminale degli inibitori delle chinasi cilino-dipendenti p27 e p21. La sequenza amminoacidica riportata in Fig-3, costituisce la regione che effettivamente lega il complesso ciclina-cdk. Il legame tra p27 e la ciclina avviene attraverso l interazione tra la regione coil/α-helix dell inibitore ed una sequenza caratteristica della ciclina stessa (ciclinbox), mentre il legame con la CDK2 avviene attraverso il coinvolgimento di una regione più estesa di p27 (β-hairpin/βstrand/3 10 helix) con la regione N-terminale della subunità catalitica della CDK. E in particolare, attraverso questa seconda interazione, che p27 impedirebbe stericamente l accesso al sito attivo della chinasi, rendendolo inattivo (Russo et al., 1996). Entrambi gli inibitori, p21 e p27, contengono al C-terminale una sequenza amminoacidica come segnale per la localizzazione nucleare o SNL (Polyak et al., 1994). E stato, inoltre, dimostrato che il controllo dell attività in vivo di p27 è di tipo post-traduzionale: con la formazione del trimero ciclina/e- CDK/p27 l inibitore stesso diviene, attraverso un meccanismo ancora

8 non del tutto chiarito, substrato della CDK che è ora in grado di trasferire un gruppo fosfato sulla treonina 187 di p27. (Montagnoli et al., 1999; Lyuben et al.; 1999) Anche in questa caso la fosforilazione sul residuo amminoacidico è essenziale; infatti, la proteina fosforilata viene riconosciuta da un complesso proteico (SCF) che media un meccanismo di degradazione ubiquitina-dipendente attraverso la via del proteosoma 26S (Pagano et al., 1995). Il turn-over temporale e selettivo di questi inibitori mediante ubiquitina/proteosoma è un meccanismo di regolazione molto valido ed ampiamente adottato dalla cellula, anche per altre proteine. Non si possono escludere, comunque, per questa classe di inibitori, vie di regolazione alternative. E stato, infatti, recentemente proposto per p21, un nuovo meccanismo di regolazione basato sulla ritenzione della proteina nel citoplasma. Tale meccanismo impedisce la traslocazione di p21 nel nucleo dove fisiologicamente svolge la sua normale funzione. La protein chinasi B o AKT fosforila l inibitore a livello della treonina 145 e la proteina fosforilata non è più in grado di traslocare nel nucleo (Zhou et al., 2001). E interessante notare inoltre che la maggior parte delle cellule tumorali della tiroide conservano un livello di espressione normale di p27 (Erickson et al., 1998; Resnick et al.,1998). Quindi nonostante la presenza dell inibitore, si osserva una crescita aberrante delle cellule e di conseguenza, un elevata attività delle CDK2. Questo può essere spiegato, come per p21, dalla ritenzione di p27 nel citoplasma. (Yaroslavskiy et al., 1999; Baldassarre et al., 1999). La sequenza SNL, quindi in qualche modo non sarebbe più in grado di fornire l informazione necessaria per il passaggio, di p27, nel nucleo. Questo inibitore quindi, sembra costituire un importante connessione tra mitogeni extra-cellulari e ciclo cellulare, con una correlazione inversa tra la sua attività e la capacità di proliferazione cellulare.