Il flusso dell informazione genetica

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1 DNA, RNA e Proteine

2 Il flusso dell informazione genetica

3 Struttura del DNA DNA: Polimero organico costituito da monomeri chiamati nucleotidi (deossiribonucleotidi) Doppio filamento per appaiamento delle basi complementari (A-T, G-C) I 2 filamenti sono orientati in senso antiparallelo (5-3 e 3-5 ), avvolti uno intorno all altro a formare una doppia elica generalmente destrorsa (10,6 bp)

4 Ø = 20 Å Watson e Crick, 1953 diffrazione dei raggi X

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6 DNA batterico In genere, unico cromosoma circolare e covalentemente chiuso, formato da una singola molecola di DNA a doppia elica Doppia elica organizzata in domini superavvolti, in cui proteine specifiche si legano al DNA In E. coli: Ü KB Ü Lunghezza: 1mm Ü 50 domini superavvolti Ü 10% dell intero volume cellulare Ü Replicazione in 40 min Topoisomerasi II e II (DNA girasi) Superavvolgimento del cromosoma

7 Cromosomi in batteri, archea e eucarioti Eubatteri: 0,5-10 Mbp, in genere un cromosoma circolare e covalentemente chiuso (CCC). Escherichia coli: 4,6 Mbp, 1 CCC; Mycoplasma genitalium, 0,58 Mbp, 1 CCC; Rhodobacter sphaeroides 2 CCC 3,0 e 0,9 Mbp; Streptomyces coelicolor, 8,7 Mbp, 1CL Archea: Halobacterium NRC1, 3 CCC, 2,0, 0,19, 0,36 Mbp Eucarioti: diversi cromosomi lineari (8-130)

8 Il DNA batterico rimane circolare durante la replicazione La replicazione inizia da un origine (~300 bp), prosegue nelle 2 direzioni (2 forche replicative), termina quando le forche si incontrano (terc C: 2 sequenze da 23 bp). Intermedi a forma di theta

9 Replicazione del DNA La doppia elica viene srotolata da un enzima (elicasi) e stabilizzata da proteine affini al DNA a singolo filamento (ssb) L elongazione avviene in modo continuo sull elica guida (leading) e in modo discontinuo sull elica copia (lagging) con la primasi che sintetizza un innesco di 11 basi. La primasi è poi sostituita dalla DNA polimerasi III. La DNA polimerasi I rimuove gli inneschi e sintetizza nuovo DNA.

10 DNA polimerasi Enzimi che catalizzano le reazioni di addizione di nucleotidi; Tre varianti nei batteri Sintetizzano DNA in direzione 5 ->3, usando un elica antiparallela come stampo La replicazione è un processo accurato e veloce 1 errore ogni basi incorporate ca nucleotidi al secondo La maggior parte degli errori viene corretta dalla funzione di correzione di bozze (proof-reading) associate alla DNA polimerasi

11 DNA polimerasi III In basso numero di copie per ogni cellula Sintetizza DNA(5' Ü 3') per formazione del legame fosfodiesterico tra il gruppo OH 3' dello zucchero dell'ultimo nucleotide della catena e il Fosfato 5' del nuovo nucleotide Non é in grado di dare inizio a nuove catene senza un innesco (Primer) che fornisca un OH 3' terminale libero RNA polimerasi - Primasi Sintetizza il primer a RNA a partire da DNA a singolo filamento senza bisogno di innesco DNA polimerasi I Rimuove il primer e riempie i vuoti lasciati dalla degradazione del primer Ha anche attività esonuclesica 5' --> 3'

12 Proteine implicate nella replicazione in E. coli Proteina DNA girasi ed elicasi SSB DnaA DnaB HU PriA PriB Funzione Svolge il DNA Lega il DNA a singolo filamento Fattore di inizio della replicazione Srotola il DNA Proteina simile agli istoni, lega il DNA Partecipa alla formazione del primosoma, attività elicasica 3 ->5 Partecipa alla formazione del primosoma PriC Svolge il DNA, attività elicasica 5 ->3 DnaC DnaT Primasi DNA polimerasi III DNA polimerasi I DNA ligasi Ter Chaperone di DnaB Coadiuva DnaC nel rilascio di DnaB Sintetizza primer di RNA Allunga il filamento durante la sintesi di DNA Rimuove i primer di RNA e sintetizza i frammenti di DNA mancanti Lega in modo covalente i frammenti di Okazaki Terminazione della replicazione

13 Trascrizione e prodotti genici Sintesi di un filamento di mrna su uno stampo di DNA 3 tipi di RNA: RNA messaggero (mrna, instabile, semivita 1,5-2 min) RNA transfer (trna stabile, con struttura secondaria) RNA ribosomiale (rrna, stabili, con struttura secondaria) 23 S (m.w.=1,2x10 6 ) rrna (RNA ribosomiale) 60% dell RNA cellulare mrna (RNA messaggero) circa 10% dell RNA trna (RNA di trasporto) circa 30% dell RNA cellulare 5 S 16 S (m.w.=0,6x10 6 ) m.w.= 5x10 4-4x10 6 m.w.= 3x10 4

14 Ribonucleotidi trifosfati n (APT, AGT, CTP, UTP ) RNA polimerasi DNA stampo RNA + nppi Nella maggior parte dei casi viene trascritta una sola delle due eliche del DNA (filamento senso) RNA polimerasi Enzima che sintetizza RNA in direzione 5-3 usando un elica di DNA antiparallela come stampo. A differenza della DNA polimerasi può iniziare la sintesi senza primer. Riconosce sul DNA un sito specifico (promotore) La sintesi si ferma in prossimità di un terminatore della trascrizione.

15 RNA polimerasi DNA-dipendente: Oloenzima: 4 subunità (2 α, β e β') Apoenzima: subunità σ MW La subunità σ è essenziale solo per la formazione del complesso DNA-RNA e viene rimossa subito dopo l 'inizio della trascrizione Interazioni della RNApolimerasi con i promotori 1 tipo in eubatteri: e archea; 3 tipi negli eucarioti Enzima Localizzazione Prodotto RNA polimerasi I Nucleo rrna (18S-5,8S-28S) RNA polimerasi II Cromatina, matrice nuc. mrna RNA polimerasi III Cromatina, matrice nuc. trna-rrna 5S

16 Strutture a forcina nel DNA Terminatori rho-indipendenti Terminatori: sequenze ripetute ed invertite sequenza centrale non invertita Strutture, dette strutture a forcina o stem-loop, si formano per adesione di regioni complementari ed impediscono all'rna polimerasi di procedere oltre. La struttura, caratterizzata da una lunghezza di 7-20 coppie di basi, presenta uno stelo (la regione in cui i due filamenti si appaiano per effetto della complementarità) ricco in coppie guanina-citosina molto stabili. Lo stelo è poi seguito da una serie (circa 6) di residui di uracile, che si appaiono debolmente alle adenine del DNA stampo. Le strutture stem-loop seguite da una sequenza di poli-uracile, possono causare l'arresto della RNA polimerasi; in genere però possono continuare la trascrizione data la stabilità del duplex.

17 Nei procarioti esistono due tipi di terminatori: L'oleoenzima termina la trascrizione senza l'intervento di fattori esterni. La terminazione è causata dalla formazione di strutture secondarie intramolecolari nell'rna nascente. Terminatore intrinseco o rhoindipendente Una proteina legata a RNA polimerasi (nusa) si lega saldamente alla struttura stem-loop, in modo da causare l'arresto temporaneo dell'enzima stesso. Tale pausa coincide con la trascrizione della sequenza di poli-uracile. I legami deboli adeninauracile destabilizzano il duplex RNA-DNA, generando il rilassamento e la dissociazione dalla RNA polimerasi.

18 Nei procarioti esistono due tipi di terminatori: Fattore Rho: esamero di identiche subunità di ~275 kd. Ogni subunità ha un dominio di legame all'rna ed un dominio di idrolisi dell'atp. Rho è un membro della famiglia delle elicasi ATP dipendenti, che funziona come fattore ancillare dell'rna polimerasi. Terminatore rhodipendente

19 Traduzione Processo attraverso cui l informazione genetica trascritta sull mrna viene tradotta in proteine Decodifica il linguaggio dei nucleotidi traducendolo nel linguaggio delle proteine 64 triplette (CODONI) Il codice genetico

20 trna 60 tipi diversi (uno o più trna per ogni aa) Molecole corte a singola elica con ampie regioni a doppia elica, in cui si distingue: Estremità accettrice (estremità 3 -OH) su cui sono presenti 3 nucleotidi non appaiati (CCA), cui si lega lo specifico aminoacidi da trasferire alla catena polipeptidica in allungamento Ansa anticodone: tre nucleotidi specificatamente coinvolti nel processo di riconoscimento e di appaiamento con il codone Lunghezza nucleotidi 5 bracci o anelli braccio D o DHU diidrossiuridina braccio T o TψC ribotimidina e pseudouridina braccio variabile

21 Aminoacil-tRNA sintetasi Enzimi che legano l aa allo specifico trna secondo la reazione: Attivazione Ü aa + ATPD aminoacil-amp + PP Caricamento Ü aminoacil-amp + trna D aminoacil-trna + AMP Dopo attivazione e caricamento, l aa-trna si sposta verso i ribosomi H H N Proteina O C OH Aggiunta aminoacidi al gruppo carbossilico libero Direzione C-terminale

22 Sintesi proteica Inizio Allungamento Terminazione In E. coli: residui/min Un ribosoma ogni 80 nucleotidi dell mrna Ü 20 ribosomi leggono un mrna che codifica per un polipeptide di 50 KDa e Abbinamento trascrizione / traduzione

23 Ribosoma Consente l unione dell mrna con il trna carico del suo aa importante nella messa in fase del mrna, l rrna ha anche azione enzimatica (peptidil transferasi) 3 siti: sito accettore (A) dove si lega il trna sito peptidico (P), dove è trattenuta la catena polipeptidica nascente sito di uscita (E)

24 1)Formazione del complesso d inizio: subunità 30S, cui si lega l mrna, trna per la formilmetionina e fattori di inizio. Ribosoma attivo: unione al 50S Complesso di inizio ÜAUG 5'-mRNA + 30S-Ribosoma + trnafmet Ribosoma attivo (70S) Ü Complesso di inizio + subunità 50 S dei ribosomi

25 Formilmetionina: il gruppo amminico (NH 2 ) è bloccato da un gruppo formilico (CHO) Üpuò essere usata solo all'inizio della proteina (Azione di deformilasi e aminopeptidasi) RBS: sito di legame ai ribosomi o sequenza di Shine e Dagarno - sequenza dell'mrna di circa 10 nucleotidi tra sito di trascrizione e start codon AUG complementare al 3' rrna 16S contenuto nella subunità 30 S dei ribosomi Traduzione: inizio

26 2) Sul ribosoma assemblato un trna che porta il primo aa si appaia con il codone d inizio dell mrna Legame aminoacil-trna 3) La subunità 30S dell rrna si lega l mrna, mentre alla subunità 50S si lega il trna in 2 siti specifici: sito P (sito peptidico) e A (sito accettore) 4) Il primo aa si lega al secondo con un legame peptidico e il primo trna è rilasciato transpeptidizzazione Traduzione: allungamento

27 5) Il ribosoma si muove lungo l mrna finché il secondo trna è nel sito P traslocazione 6) Il ribosoma si muove lungo l mrna e nuovi aa si aggiungono al polipeptide 7) Quando il ribosoma arriva al codone di stop, il polipeptide è rilasciato. 8) Il polipeptide rilasciato forma una nuova molecola Traduzione: allungamento/terminazione

28 Elementi della sintesi proteica Subunità ribosomiali mrna e codone AUG Aminoacil-tRNA Fattori d inizio, allungamento e terminazione (proteine) Energia (GTP e ATP)

29 Il legame AA-tRNA richiede l idrolisi di un GTP La traslocazione dal sito A al sito P richiede l idrolisi di un GTP L attivazione dell AA richiede l idrolisi dell ATP in AMP Per aggiungere un AA è richiesta l idrolisi di 4 legami ad alta energia La sintesi proteica è un processo energeticamente dispendioso

30 Chaperonine Proteine che permettono il corretto ripiegamento delle proteine, inglobando nella loro struttura a barilotto la proteina non ancora ripiegata o ripiegata non correttamente. Per il ripiegamento corretto è necessaria energia fornita dall ATP.

31 Organizzazione dei geni Nei virus e nei batteri Geni generalmente molto vicini tra loro e separati da corte sequenze non codificanti (non trascritte/tradotte) Sequenze non tradotte --> segnali di regolazione o? Geni sovrapposti I geni coinvolti in una stessa sequenza di reazioni biochimiche: sono generalmente molto vicini Ümaggiore semplicità del sistema di regolazione Il genoma degli eucarioti presenta un grande eccesso di DNA che non codifica per proteine la cui funzione é in gran parte sconosciuta

32 Maturazione dell mrna (splicing dell RNA) Confronto fra eucarioti e procarioti

33 snrnp Ribonucleoproteine Nucleari Piccole

34 Operatore rrna Maturazione dei geni per rrna Operone RNA ribosomiale

35 1. Canalizzazione metabolica Regolazione metabolica 2. Stimolazione o inibizione di enzimi critici 3. Controllo del numero di molecole di enzima Il controllo dell espressione genica è un processo essenziale in ogni organismo. Tale affermazione è ovvia negli organismi pluricellulari, dove i vari tipi cellulari svolgono funzioni altamente specializzate e sono programmati per esprimere solo alcuni dei propri geni e non altri. Tuttavia, anche i microrganismi hanno bisogno di regolare i propri geni; i batteri, per esempio, hanno una grande versatilità dal punto di vista metabolico e in particolare nell utilizzazione degli zuccheri come fonte di carbonio. Se la cellula batterica dovesse sintetizzare simultaneamente tutti gli enzimi coinvolti in tali processi, probabilmente consumerebbe più energia di quanto riuscirebbe a ricavarne. La cellula ha sviluppato dei meccanismi per reprimere tutti i geni che non sono necessari, attivandoli solo nel momento in cui servono. Regolazione dell espressione genica Quello che non serve è uno spreco

36 Regolazione genica Nei procarioti il controllo è In E. coli, la presenza di lattosio nel mezzo induce un aumento della b-galattosidasi, mentre la presenza di triptofano inibisce gli enzimi responsabili della sintesi esercitato a livello della trascrizione

37 Un operone contiene sempre i seguenti elementi: 1)uno o, di solito, più geni strutturali che codificano per specifici enzimi o proteine. 2)un promotore, situato a monte dei geni: una sequenza di DNA che, legandosi all'rna polimerasi, permette l'inizio della trascrizione (-35; -10 o Pribnow box). 3)un operatore: frammento di DNA, a valle del promotore, che regola l'espressione dei geni strutturali interagendo con proteine specifiche chiamate repressori o attivatori, a seconda che, impediscano o stimolino l'espressione. L'operone può anche contenere un gene regolatore, che codifica per la proteina regolatrice. Tale gene non è considerato parte integrante dell'operone, in quanto può essere dislocato in un punto anche distante del genoma.

38 Regolazione positiva Regolazione genica dell'operone Una proteina attivatore si lega all'operatore stimolando la trascrizione. Regolazione negativa Una proteina repressore si lega all'operatore impedendo la trascrizione. Si distinguono operoni inducibili e operoni repressibili

39 operoni inducibili negativi proteina repressore legata all'operatoreü no trascrizione molecola induttrice legata al repressore Ü cambio conformazionale Ü trascrizione. La proteina repressore è legata all'operatore e impedisce la trascrizione dei geni dell'operone. Se nella cellula è presente la molecola induttrice, essa si lega alla proteina repressore, ne cambia la conformazione, rendendola incapace di legare l'operatore e permettendo così la trascrizione. operoni inducibili positivi proteina attivatore non legata all'operatore Ü no trascrizione molecole legate alla proteina attivatore Ü cambio conformazionale Ü trascrizione. La proteina attivatore è normalmente incapace di legarsi all'operatore. Certe molecole, tuttavia, possono legarsi alla proteina attivatore e cambiare la sua conformazione in modo da renderla capace di legarsi al DNA e incentivare, così, la trascrizione.

40 operoni repressibili negativi proteina repressore non legata all'operatore Ü trascrizione corepressori legate al repressore Ü cambio conformazionale Ü no trascrizione. La proteina repressore, ancorché prodotta, è incapace di legarsi all'operatore nella sua conformazione normale. Tuttavia, molecole chiamate corepressori possono legarsi al repressore, cambiarne la conformazione e renderlo capace di legarsi all'operatore, impedendo la trascrizione. operoni repressibili positivi proteina attivatore legata all'operatore Ü trascrizione molecole legate all'attivatore Ü cambio conformazionale Ü no trascrizione. La proteina attivatore è legata all'operatore e la trascrizione avviene regolarmente. Determinate MGEMA 9 cfu L11 10/04/17 molecole possono legarsi all'attivatore e impedirgli, cambiandone la conformazione, di legarsi all'operatore. In questo modo, la trascrizione viene inibita. 40

41 Lattosio

42 Regolazione della sintesi di β-galattosidasi lacy codifica per una permeasi per l'ingresso del lattosio nella cellula. lacz codifica per la β-galattosidasi i laca codifica per la tiogalattoside transacetilasi (funzione non chiara) Se nel mezzo di coltura è presente il lattosio o molecole analoghe (induttori), il repressore, interagendo con esse, cambia conformazione, e non è più in grado di legarsi all operatore; Ü l RNA polimerasi non ha ostacoli Ü i geni lac possono essere espressi. E. coli: Lattosio: ~3000 molecole di β-galattosidasi No lattosio: <3 molecole di β-galattosidasi Mutanti I - (espressione continua) Mutanti I S (espressione repressa)

43 Triptofano