Gli Schemi di External Quality Assessment UK NEQAS FMH e LI nel Laboratorio Trasfusionale

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1 A.O. Ospedale S.Anna Como - Giovedì 16 Aprile 2015 Formazione e Sicurezza nella Diagnostica Immunoematologica Gli Schemi di External Quality Assessment UK NEQAS FMH e LI nel Laboratorio Trasfusionale Bruno Brando Direttore dei Servizi Trasfusionali e Laboratori di Ematologia A.O. Ospedale Civile di Legnano (MI) bruno.brando@ao-legnano.it

2 Per la serie Italia Pittoresca...in Italia de a trasfusiòn feto-materna no ghe ne frega un casso a nissùn... Anonimo Veneziano 2007

3 164 su 208 (78.8%) SIMT hanno risposto 41 (25%) SIMT eseguono i test per FMH Blood Transfusion 2013 n 4

4 Pregnant women who are Rh-D negative must be considered for anti-d prophylaxis for the following potentially sensitising events: Amniocentesis Cordocentesis Other in-utero therapeutic intervention/surgery (e.g. intrauterine transfusion, shunting) Ante partum vaginal haemorrhage (APH, especially >24th week) Chorionic villus sampling Ectopic pregnancy External cephalic version Fall / Abdominal trauma Intrauterine death / Stillbirth Miscarriage Termination of pregnancy BCSH, Transfusion Medicine 1999; 9:

5 FMH evaluation can be of diagnostic help in emergency events that complicate pregnancy: Amniocentesis (Tannirandom Y 1999) Cordocentesis (Chitrity Y 1998; Rujiwetpongstorn J 2005) Ante partum vaginal haemorrhage (Zizka Z 2001; Weisberg L 2004) Chorionic villus sampling (Katiyar R 2007) Ectopic pregnancy (Krause HG 1996) External cephalic version (Khoo CL; Shankar M 2004) Fall / Abdominal trauma (Muench MV 2004; Hagmann CF 2004; Sherer DM 1997; Emery CL 1995) Evidence of severe fetal anemia (Bowers LA 2006; Sueters M 2003) Reduced Fetal Movements (Malcus P 2006; Weisberg L 2004) Intrauterine death (Biankin SA 2003) Miscarriage (Banerjee K 2004; Biankin SA 2003; Weinberg L 2001) Pre-eclampsia (Jansen MW 2001) As an Unexpected Finding (Pourbabak S 2004)

6 Detection of Fetal Cells in Maternal Blood Nucleated fetal RBC (para)physiologically circulating in maternal blood have been sought for since the 80s for antenatal diagnostic studies (Rare Event Analysis). The hallmarks of fetal RBC are: The presence of a nucleus Immature RBC surface phenotype (CD71+, CD36-, GLF-A-) Cytoplasmic HbF at high concentration Cytoplasmic Carbonic Anhydrase absent or very low Fetal RBC AB0/RhD phenotype can be detected in selected cases only. All individuals have circulating nucleated, immature RBC. All individuals have HbF+ RBC ( % of total RBC, with a 10-fold lower HbF concentration). Increased levels of HbF+ RBC in Thalassaemic trait, during pregnancy and in hereditary persistence of HbF. Mature RBC have cytoplasmic Carbonic Anhydrase.

7 The Kleihauer-Betke (KB) Test Acid elution of Hb A (citric or hydrochloric/fecl acid buffers) Staining with erythrosin or eosin the acid-resistant fetal RBC Fetal Cell Densely red Refractile Maternal RBC Ghost WBC can be counterstained KB TEST IS POSITIVE IF > 5 Fetal RBC / Maternal RBC Estimation of the FM haemorrhage: V (ml) = 2,500 x n / 10,000. One fetal cell in 10,000 maternal cells corresponds to an haemorrhage of ~ 0.25 ml of fetal RBCs (~ 0.5 ml fetal blood).

8 BCSH Guidelines - KB Test Se in un campo sono presenti almeno 100 GR si procede al conteggio delle emazie fetali: <10 emazie in 25 campi FMH è < 2 ml. >10 emazie in 25 campi si deve procedere alla quantificazione

9 IDENTIFICATION AND ENUMERATION OF FETAL D+ RBCs IN MATERNAL BLOOD Maternal RBCs (Rh-D neg woman) Fetal D + RBCs (0,085 %) Quanti-D PE Millipore Monoclonal Ab EDTA blood, Wash x2, Stain for 20 min, Wash x1, Read 300,000 RBC) WARNING: If the Mother Has Received Anti-D Prophylaxis the Binding of Fuorescent Anti-D MoAb is INHIBITED!

10 The Fetal Cell Count Kit (ImmunoQuality Products, Groeningen, NL) 1) Monoclonal antibody to Fetal Hemoglobin - PE Clone NaM16-2F4 Origin Mouse Class IgG1 Specificity Fetal hemoglobin (g chain) References Maier-Redelsperger et al. Blood 84: 3182, 1994 Navenot et al., Cytometry 32: 186, ) Polyclonal antibody (rabbit) to Carbonic Anhydrase - FITC

11 Test Procedure Fetal Cell Count Kit (~ 90 min) Initial Washing of Peripheral Blood with PBS x 1-2 Fixation and Permeabilization: Fixation: 10μL EDTA blood + 100μL Fixative A + 100μL Fixative B Vortex, Incubate 30 min at RT, shake every 10 min Wash by adding 2 ml Washing Solution D, resuspend 300g x 3 min, decant, Repeat washing Permeabilization: (SDS) add 100μL Reagent C, vortex, incubate 4 min Immunofluorescence staining: Incubation with pab anti-ca FITC + mab anti-hbf PE x 20 min. Washing X 1 PBS-BSA Data Acquisition: Setting Log FSC, Log SSC, and Log fluorescence signals for FITC & PE RUN: at least 300,000 (Better 500,000) erythrocytes

12 Fetal Cell Count Kit-Acquisizione & Analisi delle Popolazioni R1 Emazie Fetali HbF+ / CA neg Emazie Fetali in maturazione HbF+ /CA± + Cattura Eritrociti Emazie Materne HbF+ dim /CA+ Emazie Materne Mature HbF neg/ca+

13 Fetal Cell Count Kit - Analisi & Calcoli Emazie Fetali HbF ++ / CA - =0,165% HbF+ RBC Emazie Totali Emazie Materne HbF - / CA + Dalla percentuale di cellule HbF+ si ricava la STIMA della FMH in ml di emazie fetali: ml FMH = (1800 x HbF+%) / 100 (non corretto per VGM fetale). In questo caso: ml FMH = (1800 x 0,165) / 100 = 2,97 ml Fattore di correzione: VGM fetale (in media il 22% maggiore di quello materno) per cui: ml FMH = 2,97 + (2,97 x 0,22) = 3,62 ml (corretto per VGM fetale) La dose standard di 500 ui di Anti-D (RHO-Gamma) neutralizza fino a 4 ml di emazie fetali D+

14 FMH Scheme Input dati Analitici Input dati Terapeutici Anti-D

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16 Report Esercizi FMH (Prima di introduzione di Z-Score) Learning Curve Tipica di ogni Schema UKNEQAS

17 Introdotto Lo Zeta Score Per gli Schemi QUANTITATIVI: - Immune Monitoring, CD34+ Stem Cells, Low Level Leucocyte Count, - Leukaemia Immunophenotyping (Part 1) - Minimal Residual Disease - BCR-ABL Quantitativo - Post-Transplant Chimerism Monitoring

18 Vecchio Scoring System UKNEQAS_LI Nel tempo sono stati sviluppati 10 diversi sistemi di Scoring, ritagliati su ciascun analita e schema. In alcuni schemi: Score Alto= Tutto bene, In altri schemi: Score Alto= Tutto male (Confusione!) Il vecchio sistema identificava comunque in modo accurato i laboratori con prestazioni insoddisfacenti.

19 Caratteristiche e Proprietà dello Zeta Score Definite dall Algoritmo A di questo documento ISO. Il calcolo assicura l inclusione di TUTTI i risultati dei partecipanti, minimizzando gli effetti dei valori estremi (Outliers).

20 Calcolo dello Zeta Score Dato Partecipante Media Robusta z = ( x - X ) ^ SD Robusta Valori POSITIVI SOVRASTIMA 0 Hai fatto Centro! Valori NEGATIVI SOTTOSTIMA La Media Robusta e la SD Robusta vengono calcolate usando l Algoritmo A (ISO ).

21 Come Interpretare lo Zeta Score (1) Z-Score compreso tra -2 e +2: Tutto OK Critical Critical Z-Score tra -2 e -3 o tra +2 e +3: ACTION Cerca di capire cosa succede e prendi provvedimenti Z-Score < -3 o > +3: CRITICAL C è veramente qualcosa che non va. Rivedere l intero processo!

22 Due Z-Score ACTION in 2 esercizi consecutivi generano uno Score CRITICAL Esempio di Z-Score con Sottostima: ACTION Esempio di Z-Score con Sovrastima: CRITICAL

23 I TRAPIANTI DI ORGANI SOLIDI AB0-INCOMPATIBILI United Network for Organ Sharing (UNOS - USA): ~ pazienti attivi inseriti in lista per trapianto d organo Trapianti di organo eseguiti negli USA nel 2014: Sistema Informativo Trapianti del Centro Nazionale Trapianti: 9143 pazienti inseriti in lista per trapianti d organo Trapianti di organo eseguiti in Italia nel 2014: 2980 Organ Procurement and Transplantation Network ( OPTN): Tempi di attesa per trapianto di rene suddiviso per gruppi ABO nel periodo : Rene di gruppo O: 5.07 anni Rene di gruppo A: 3.31anni Rene di gruppo B: 5.31 anni Rene di gruppo AB: 2.34 anni La discrepanza tra numero di pazienti in lista di attesa e trapianti eseguiti sulla base della disponibilità degli organi rende evidente la necessità di ampliare il bacino dei donatori obiettivo il superamento della barriera AB0 nel Tx d organo solido.

24 IL TRAPIANTO DI CSE ABO-INCOMPATIBILE Mentre la compatibilità HLA è un pre-requisito per il buon attecchimento in riceventi condizionati, la compatibilità ABO non è una limitante, anche se possono comunque verificarsi delle complicanze legate a questa incompatibilità. In caso di incompatibilità maggiore AB0: correlazione tra anticorpi anti A/ anti B e conta reticolocitaria. La ripresa eritropoietica è significativamente ostacolata per titoli anticorpali al di sopra di 1:8 Stussi G. Transfus Apher Sci 2006; 35:

25 Dosaggio delle Isoemoagglutinine Anti-A e Anti-B Nel Trapianto d Organo Solido ABO-Incompatibile Procedure cliniche in cui è possibile praticare un Tx contro barriera AB0: Trapianto di Rene Trapianto di Fegato Trapianto di Cuore (in neonati) Non esiste un valore basale del titolo delle agglutinine universalmente accettato da tutti i centri per l inclusione dei pazienti in un programma di Tx ABO incompatibile. Tuttavia i pazienti con titolo 512 presentano elevato rischio di rigetto acuto rispetto a quelli con titolo basale 256. Il titolo delle agglutinine anti-a e anti-b raccomandabile pre trapianto varia in ogni centro: il cut off è generalmente compreso tra 8 e 32.

26 Programma UK NEQAS BTLP Pilot AB0 TITRATION Fine 2014: 90 centri iscritti al programma UKNEQAS BTLP Pilot AB0 TITRATION 34 in UK 19 in Italia 37 centri in altre 16 nazioni La maggioranza dei centri iscritti esegue titolazioni delle agglutinine Anti-A e Anti-B nel trapianto di cellule staminali emopoietiche e nel trapianto di rene. La maggior parte dei Centri che eseguono titolazioni delle agglutinine Anti-A e Anti-B anche per altri scopi (es. per MEN ABO o altri trapianti) effettua questi test circa volte all anno al massimo.

27 Invio 12/13 AB0 T4: n. 3 Plasma 0 Emazie test A1 Rh- Confronti Metodo Standard vs Metodo in-house

28 Variabilità dei risultati ancora elevata malgrado metodo standard. P1 aveva anche un Anti-D. Non importante nell esercizio ma rilevante in clinica. NIBSC sta per distribuire uno standard biologico titolato Anti-A e Anti-B.

29 Consiglio d Europa - Raccomandazioni sul Controllo delle Cellule Contaminanti Residue nel Plasma e negli Emocomponenti Leucodepleti PFC 6.000/µL 100/µL /µL RBC & PLT U Council of Europe - Guide to the Preparation, Use and Quality Assurance of Blood Components. Recommendation No. R (95) 15-16th Edition, 2010, pg. 314 LINEE-GUIDA SIMTI 2007 e 2010: L Unità Leucodepleta non deve contenere più di rwbc

30 Medium di Colorazione DNA - WBC Residui Sodio 1g / Litro Propidio Ioduro 50 mg / Litro Sigma P 4170 IGEPAL CA µl / Litro Sigma I 3021 RNAsi A III 6 mg / Litro Sigma R 5125 Preparare 100 ml alla volta, filtrare con 0.22 µm Millipore, Conservare a 4 C in vetro scuro, stabile 1 mese. Uso con Microsfere di Conteggio (Qualunque tipo)

31 Flow-Count Beads BEADS res WBC FLOWCOUNT 1026/µL rwbc Beads Marker Events Mean All rwbc Beads rwbc = 39 / * 1026 = 1.91/µL

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33 Facscanto Tutte le valutazioni prestazionali relative a risultati quantitatitivi numerici vengono oggi espresse come ZETA SCORE in accordo alle regole ISO

34 Studio di comparazione di 7 diversi sistemi di filtrazione in-linea (Gara di aggiudicazione - Sacche quadruple T&B con filtro) Manufacturer Mean rwbc/µl rwbc/unit x10^6 % Rejected Process Time M Baxter ± ± min Baxter ± ± min Braun 5.97 ± ± min Fresenius ± ± min Fresenius ± ± min Pall 2.48 ± ± min Terumo 2.59 ± ± min Valutata una campionatura di 10 sacche per ogni concorrente. Parametri valutati: Recupero emazie, Emazie residue nel filtro, Tempo di processamento, rwbc/µl e rwbc/unità.

35 Le linee-guida SIMTI prevedono il controllo dell ~1% delle unità prodotte per diversi parametri, tra cui Hb g/l e Hct% per i GRC e n. PLT (x 10 9 /L) per concentrati da pool o aferesi. Nella preparazione degli emocomponenti si ottengono prodotti con concentrazioni cellulari molto maggiori di quelle ordinarie. Occorre quindi che le misure di questi parametri siano accurate poiché da queste deriva la valutazione globale della buona qualità del processo di scomposizione e manifattura emocomponenti.

36 Non tutti i contaglobuli sono sempre in grado di valutare accuratamente i parametri degli emocomponenti concentrati: possibili problemi di sovrao sottostima, con conseguenze sul giudizio di qualità dei prodotti.

37 SVILUPPI DEGLI SCHEMI UKNEQAS BTLP Tecnicamente molto difficile ottenere RBC stabilizzati con Ig e C a basso titolo. Primo schema nella seconda metà Seconda misura dopo 15gg per stabilità. Complessità crescente del sistema Antigeni (678 Ag) Difficile identificazione Ag di nicchie etniche Terminologia Antigeni ancora molto variabile. Anticorpi di limitata reperibilità e reattività 46 Geni, 1653 Alleli (al Marzo 2015) Genotipizzazione e previsione del Fenotipo (anche fetale). Eseguito un primo pre-pilot su 56 laboratori. Previsto un primo schema pilota nel 2015.

38 CONTEGGIO DEI PBSC CD34+ NELL AUTO- e ALLOTRAPIANTO Applicazioni e Pericoli Conteggi dei PBSC CD34+ in numerosi punti CRUCIALI del processo: Monitoraggio ripresa post-chemio Decisione di eseguire o meno l aferesi Calcolo della resa aferetica Calcolo del quantitativo raccolto nella sacca di aferesi Calcolo delle cellule CD34+ VITALI al momento del congelamento Calcolo delle cellule CD34+ VITALI dopo manipolazioni (purging) Calcolo delle cellule CD34+ VITALI al momento del TRAPIANTO Applicazioni extra-trapianto del conteggio dei CD34+ periferici (Mielodisplasie, Mielofibrosi, Leucosi acute e croniche...) IL VERO PERICOLO E QUELLO DI SOVRASTIMARE I CONTEGGI DI CD34+ (Raccolgo con troppo pochi CD34+ in giro, Credo di avere raccolto abbastanza, Credo di avere CD34+ vitali a sufficienza...)

39 PUNTI FERMI DELLE TECNOLOGIE DI CONTEGGIO DELLE CELLULE CD34+ MARCATURA CD45 FITC / CD34 PE (di Classe III) ACQUISIZIONE DI ALMENO 100 EVENTI CD34+ CONCENTRAZIONE DEL CAMPIONE < /µl TEST IN SINGOLA PIATTAFORMA (Microsfere) PIPETTAMENTO INVERSO DI PRECISIONE ATTENTO E MIRATO ADDESTRAMENTO TECNICO PROTOCOLLO ISHAGE MODIFICATO EWGCCA DISPONIBILI EQAS E STANDARDS BIOLOGICI

40 IL CONTEGGIO DELLE CELLULE CD34+ IN CITOMETRIA FORNISCE INFORMAZIONI DI IMPORTANZA CRUCIALE AL MEDICO TRAPIANTISTA SINGOLO MIGLIOR PREDITTORE DI UNA RACCOLTA EFFICACE SINGOLO MIGLIOR PREDITTORE DI ATTECCHIMENTO > 5 x 10 6 CD34+ / Kg REINFUSE = SICURO ATTECCHIMENTO CONTROLLO DELLA RESA AFERETICA COME RAPPORTO TRA CD34+ DISPONIBILI E CD34+ EFFETTIVAMENTE RACCOLTE POSSIBILE ACCURATO CONTROLLO DELLO STATO DI APOPTOSI O DI VITALITA' DELLE CD34+ CONSERVATE O SCONGELATE TEST IN SINGOLA PIATTAFORMA ACCURATO E FLESSIBILE (Sangue Periferico, Leucaferesi, Donatore Normale Mobilizzato, Sangue Cordonale, Midollo Osseo)

41 Metodo EWGCCA ISHAGE in Singola Piattaforma per l Identificazione e il Conteggio dei PBSC CD34+ Gate su Cellule Nucleate NO Beads Gate su CD45+ CD45+ CD34+ Cellule Nucleate Gate su Nucleate CD45+ CD34+ Gate su Nucleate CD45+ CD34+ SSC Low CD SSC Low 776 VERI CD Beads Flow-Count 776 CD34+ eventi 4089 Bead eventi x 1012 = 192 CD34+ PBSC/µL (# beads/µl)

42 Inchiesta su COME viene usato il protocollo ISHAGE dai partecipanti allo schema UKNEQAS CD34+ (Survey 2008) 1% 5% 1% 1% 1% 2% Correct Missing gate Gating on wrong parameter Using wrong antibody 32% 57% Missing plot and gate Wrong gate and parameter Wrong gate and parameter and missing gate Using different protocol to that stated

43 Cytometry Part B 2008; 74B: CD34 Scheme

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45 -0.15 Conta solo il valore assoluto di CD34+

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47 CALCOLO DEL VALORE PERCENTUALE DI CD34+ CD34+ COEFFICIENTE DI VARIAZIONE (CV) TRA I DIVERSI DENOMINATORI: % Per Valori di CD34+ Inferiori all' 1% 0,012% 0,016% 0,018% SSC/FSC SSC/CD45 SSC/LDS751

48 Gli Esercizi EQA Controllano l Effetto dell Introduzione di Cambiamenti nella Pratica di Lavoro Immune Monitoring Scheme Introduzione delle guardie notturne Brando - Ospedale Niguarda

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51 Alcuni campioni vengono depleti di T CD4+ mediante Clinimacs, in modo da offrire casi con livelli patologici di CD4+ % e /µl

52 See what happens with bad monoclonals Strange performance discrepancy between CD4 & CD3 / CD8 The cause was an excess non-specific binding with CD3 and CD8 BD Mabs resumed