ALTRI PROGRAMMI EQA UKNEQAS DI COMPETENZA DEL LABORATORIO TRASFUSIONALE: Raggiungere e Mantenere l Eccellenza

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1 Azienda Ospedaliera Ospedale Civile di Legnano Incontro con i Centri Trasfusionali della Regione Marche Ancona, 27 Maggio 2010 ALTRI PROGRAMMI EQA UKNEQAS DI COMPETENZA DEL LABORATORIO TRASFUSIONALE: Raggiungere e Mantenere l Eccellenza Bruno Brando Direttore Centro Trasfusionale e Laboratorio di Ematologia Ospedale di Legnano (MI) bruno.brando@ao-legnano.it Membro dello Steering Committee UK NEQAS For Leucocyte Immunophenotyping

2 I PROGRAMMI EQA UKNEQAS DI COMPETENZA DEL LABORATORIO TRASFUSIONALE Blood Transfusion Laboratory Practice Feto-Maternal Haemorrhage Di Stretta Competenza Trasfusionale CD34+ Stem Cells Low Level Leucocyte Count in leucoreduced products Immune Monitoring Programme Leukaemia Immunophenotyping / MRD Molecular Diagnostics PNH Scheme Laboratori di Ematologia o Trasfusionali General Haematology Blood Coagulation Ematologia e Coagulazione

3 Quanto lontano vogliamo andare? Szechuan shoes: 3 Church s full brogues: 380

4 Mettiamo un po' d'ordine nella terminologia... IQC (Controllo Interno di Qualità): Esercizio autoprodotto o distribuito dalle Ditte del settore, che include materiali a vari livelli di reattività attesa (es. Low, Med, High). Assicura la precisione e la riproducibilità dei dati. VEQ (Valutazione Esterna di Qualità): Esercizio promosso da Società Scientifiche, Regioni, Università, che si limita a descrivere la distribuzione dei dati analitici ottenuti dai partecipanti su campioni a titolo ignoto inviati periodicamente. EQAS (External Quality Assurance Scheme): Valuta l'intero processo analitico, favorendo il passaggio a tests di migliori prestazioni. Di natura educazionale, è gestito solo da enti accreditati, che devono intervenire in caso di prestazioni insoddisfacenti. Punta al raggiungimento ed al mantenimento di risultati di eccellenza.

5 International Laboratory Accreditation Cooperation

6 UK NEQAS ORGANISATION & ADVISORY STRUCTURE Host Authorities UK NEQAS Consultant Executive Board Advisor Trustees Joint Working Group Regulatory Body CPA(UK) Ltd local accountability (facilitation) professional accountability external accountability (financial & policy) co-ordination and services professional accountability accreditation to standards UK NEQAS Steering committee advise and support Individual UK NEQAS schemes performance surveillance National Quality Assurance Advisory Panel NQAAP performance surveillance other EQAS INDIVIDUAL LABORATORY

7 UKNEQAS QUALITY MANUAL Riassume tutte le modalità operative del sistema UKNEQAS e dei suoi processi di certificazione e accreditamento. Revisionato ogni 6 mesi. Riporta tutti i criteri utilizzati per la definizione degli scores e dei livelli prestazionali, richiamabili come riferimento nei propri sistemi qualità. Dà un idea della complessità organizzativa e gestionale attualmente richiesta ad un promotore di schemi EQA, a garanzia dei partecipanti. Può costituire una traccia per impostare un sistema qualità specifico per i laboratori di citometria.

8 UK NEQAS for Leucocyte Seven Full Schemes: Immunophenotyping Worldwide Participants (5/10) Immune Monitoring 645 Leukaemia Phenotyping & Diagnosis CD34 + Stem Cell Quantitation 279 Low-Level Leucocyte Counting 112 Molecular Analysis of Haematological Malignancies Minimal Residual Disease 37 PNH Analysis 99

9 CD 34 Scheme

10 Metodo EWGCCA ISHAGE in Singola Piataforma per l Identificazione e il Conteggio dei PBSC CD34+ Gate su Cellule Nucleate NO Beads Gate su CD45+ CD45+ CD34+ Cellule NUcleate Gate su Nucleate CD45+ CD34+ Gate su Nucleate CD45+ CD34+ SSC Low CD SSC Low 776 VERI CD Beads Flow-Count 776 CD34+ eventi 4089 Bead eventi x 1012 = 192 CD34+ PBSC/µL (# beads/µl)

11 CALCOLO DEL VALORE PERCENTUALE DI CD34+ CD34+ COEFFICIENTE DI VARIAZIONE (CV) TRA I DIVERSI DENOMINATORI: % Per Valori di CD34+ Inferiori all' 1% 0,012% 0,016% 0,018% SSC/FSC SSC/CD45 SSC/LDS751

12 PROBABILMENTE IL MIGLIOR DENOMINATORE OGGI IDENTIFICABILE: LDS751 AND CD45 SOGLIA su LDS Side Scatter -> Side Scatter -> Consigliabile impostare la SOGLIA su LDS751

13 CONTEGGIO DEI PBSC CD34+ NELL AUTO- e ALLOTRAPIANTO Applicazioni e Pericoli Conteggi dei PBSC CD34+ in numerosi punti CRUCIALI del processo: Monitoraggio ripresa post-chemio Decisione di eseguire l aferesi Calcolo della resa aferetica Calcolo del quantitativo raccolto nella sacca di aferesi Calcolo delle cellule CD34+ VITALI al momento del congelamento Calcolo delle cellule CD34+ VITALI dopo manipolazioni (purging) Calcolo delle cellule CD34+ VITALI al momento del TRAPIANTO Applicazioni extra-trapianto del conteggio dei CD34+ periferici IL VERO PERICOLO E QUELLO DI SOVRASTIMARE I CONTEGGI DI CD34+ (Raccolgo con troppo poche cellule, Credo di avere raccolto abbastanza, Credo di avere CD34+ vitali a sufficienza...)

14 Comparative Analysis of Inter-Laboratory CVs for CD34 + Enumeration by Platform Sample All Dual Single A 44.2% B 30.2% C 26.9% D 29.7% E 38.5% F 18.8% G 31.3% H 18.9% I

15 Effect of Gating Strategy VALUE (ABS 6 CV%) Trial CV% ISHAGE Bender protocol Milan protocol 0.00 CD Trial UK NEQAS

16 Inchiesta su COME viene usato il protocollo ISHAGE dai partecipanti allo schema UKNEQAS CD34+ 1% 5% 1% 1% 1% 2% Correct Missing gate Gating on wrong parameter Using wrong antibody 32% 57% Missing plot and gate Wrong gate and parameter Wrong gate and parameter and missing gate Using different protocol to that stated

17 Cytometry Part B 2008; 74B: CD34 Scheme

18 Conta solo il valore assoluto di CD34+

19 Issued both with CD34 stem cell counts <10 cells/ul Ex 0706 We have relaxed the scoring system to reflect the degree of difficulty in these samples

20 Please note if you are a UK laboratory our Steering Committee and the Haematology NQAAP require all UK laboratories to use a single platform approach when undertaking CD34 stem cell enumeration. Ex 0801

21 Effect of Instrument Service on Performance One Year One Year Running Score Service Performed 5 0 One Year Trial

22 CD34 Scheme: Italian UPs & PUPs Partecipante Esercizio A B C D E F G H O702 O703 O704 O705 O706 O801 O802 O803 Non Return Outlier Qualcuno sembra non volere fare sforzi per migliorare...

23 R1 R eventi acquisiti R2 Cellule CD34+ nel Sangue Periferico NORMALE DONATORI (19-65a) NORMALI (n= 35) R1 %Mean = % ABS Mean = 4.41 /μl ± SD ABS = 0.42 Mean CV % = 7.7% %min = 0.01% %Max = 0.13% R3 R4 ABS min = 0.01/μL ABS Max = 6/μL CV dei Replicati = 5 15%

24 Circulating CD34+ Cells in MDS patients stratified by IPSS and its determinants # and % of pts with Circulating CD34+ / µl CD34+ > 10/µL # (%) p-value Median 25 th -75 th perc Range p-value IPSS Class Low Risk 5 (12) < <0.001 Intermediate Risk-1 Intermediate Risk-2 / High Risk 16 (38) 23 (92) Karyotype Class Good Outcome 22 (27) < <0.001 Intermediate Outcome Poor Outcome 19 (20) 13 (93) Bone Marrow Blasts (Microscopy) < 5% 22 (30) < < % - 10% 11% - 20% 11 (52) 11 (84) Number of Cytopenias (25) < (59) Cesana C, Klersy C, Brando B et al. Leuk Res 2008; 32:

25 Long-term overall survival of MDS patients according to baseline CD34+ cells / µl 1,0 Cumulative Proportion Surviving 0,8 0,6 0,4 0,2 P<.0001 Circulating CD34+ Cells </= 10/µL Circulating CD34+ Cells > 10/µL 0, Months Cesana C, Klersy C, Brando B et al. Leuk Res 2008; 32:

26 Passamonti F. et al. Haematologica 2003; 88: Discrimine attorno a 15 CD34+ /µl

27 Low Level Leucocyte Scheme - LLLC Conteggio dei Leucociti Residui negli Emocomponenti Leucodepleti

28 PROBLEMI CAUSATI DAL TRASFERIMENTO DI WBC RESIDUI NELLA TRASFUSIONE Reazioni Febbrili (Ridotte dalla lavorazione Top&Bottom) Trasferimento di Microrganismi (CMV, EBV, HSV, Toxo...) Trasferimento di Prioni (Creutzfeld-Jacob Variants) Immunizzazione ANTI-HLA (Trapianti d organo solido) Refrattarietà Piastrinica (Pazienti oncologici) Reazione GVH Acuta Trasfusionale (pz immunodepressi) Immunosoppressione Trasitoria (Immuno-modulazione)

29 CD4+ T Cells Range Valori % / µl 10-50% /µl CD34+ PBSC WBC Residui % /µl /µl Diversi range di valori % e /µl Diverse richieste in termini di precisione Diversi setup strumentali Un unit unità di Emazie prefiltrate deve venire DECLASSATA se il conteggio di WBC Residui = > ~ 3 Cells / µl se il conteggio di WBC Residui è = > ~ 3 Cells /

30 ACCEPTABLE RESIDUAL CELL LEVELS IN PLASMA (Obtained by Fractionation) EC law 2002 / 98 Red Cells < 6 x 10 9 / Liter (< 6000/µL) White Cells < 0.1 x 10 9 / Liter (< 100/µL) Platelets < 50 x 10 9 / Liter (< 50000/µL) Fresh Frozen Plasma obtained by fractionation can transfer residual cells which may enhance anti-rbc, anti-ptl and anti-hla responses. Apheresis Plasma is virtually cell-free.

31 100 µl ANY BLOOD PRODUCT 100 µl Flow-Count BEADS (Or TruCOUNT Tube) 5 µl ANY NORMAL PLASMA + CTRL TIPS & TRICKS 500 µl STAINING MEDIUM * Staining is Almost Immediate * Run NEGATIVE CTRL First * Pass RINSE Solution after running Positive CTRL or after a rwbc-rich sample * Process 15 µl raw sample 500 µl STAINING MEDIUM 500 µl STAINING MEDIUM (Plus Beads) CTRL

32 Medium di Colorazione DNA - WBC Residui Sodio Citrato 1g / Litro Propidio Ioduro 50 mg / Litro Sigma P 4170 IGEPAL CA µl / Litro Sigma I 3021 RNAsi A III 6 mg / Litro Sigma R 5125 Preparare 100 ml alla volta, filtrare con 0.22 µm Millipore, Conservare a 4 C in vetro scuro, stabile 1 mese.

33 Flow-Count Beads BEADS res WBC FLOWCOUNT 1026/µL rwbc Beads Marker Events Mean All rwbc Beads rwbc = 39 / * 1026 = 1.91/µL

34 WBC Residui negli Emocomponenti Leucodepleti Propidio Ioduro res WBC BEADS Flow-Count Beads Marker Events CV All rwbc Beads rwbc rwbc = 86.8 /µl (Declassare la sacca!)

35 LLLC SCHEME: 6 Invii / anno 3 Emazie Concentrate + 3 Concentrati Piastrinici Leucodepleti ogni invio

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37 LLLC SCHEME: Possibile tenere sotto EQA due strumenti o due sistemi analitici diversi

38 Studio di comparazione di 7 diversi sistemi di filtrazione in-linea (Gara di aggiudicazione - Sacche quadruple con filtro) Manufacturer Mean rwbc/µl rwbc/unit x10^6 % Rejected Process Time Baxter ± ± min Baxter ± ± min Braun 5.97 ± ± min Fresenius ± ± min Fresenius ± ± min Pall 2.48 ± ± min Terumo 2.59 ± ± min Valutata una campionatura di 10 sacche per ogni concorrente. Parametri valutati: Recupero emazie, Emazie residue nel filtro, Tempo di processamento, rwbc/µl e rwbc/unità.

39 Immune Monitoring Scheme

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42 Il processamento dei preparati cellulari con Clinimacs Miltenyi permette di generare campioni con valori di CD4 anormali Ex # - sample CD4+ ABS CD4+ % , , , , , , , , , ,8

43 EX 0801: Ultimo con il calcolo dello Score Cumulativo

44 EX 0802: Nuova modalità di calcolo dello Score Scorporando gli scores per CD3, CD4 e CD8 emerge il contributo relativo delle varie misure.

45 Valori Assoluti e Percentuali (singola piattaforma) possono seguire trends differenti

46 CV della Conta Percentuale di CD4+ nel Tempo Utilizzatori di "Leukogate" CD45/CD cv Tutti i partecipanti Utilizzatori di Gate CD45 / CD Trial Introduzione del Gate CD45 / SSC UK NEQAS for Leucocyte Immunophenotyping

47 Effetto dell'introduzione di cambiamenti nella pratica di lavoro Immune Monitoring Scheme Introduzione delle guardie notturne Ospedale Niguarda

48 Cytometry Part B 2008; 74B: Immune Monitoring Scheme

49 UK NEQAS and IQA (Duke) have reported the introduction of VERIQAS, a CD4+ T lymphocyte training panel using stabilized whole blood specimens that provides immediate feedback via an interactive website.

50 Immune Monitoring Scheme Poor Performers & Persistent Poor Performers Ex # # Outliers O O O O O801 24

51 immune Monitoring Ex 0805 Italia All

52 immune Monitoring Ex 0805 Italia All

53 Leukaemia Immunophenotyping & Diagnostic Interpretation

54 CORE ANTIGENS: 6 Antigeni Obbligatori GENERANO SCORE

55 RECOMMENDED ANTIGENS: 8 Antigeni Raccomandati ma NON Obbligatori GENERANO SCORE SOLO QUELLI TESTATI

56 Open Image in new window Zoom IN Zoom OUT

57 10 April April Report Optional Recommended Core

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62 Ex. 0504: PROBLEMI

63 Ex. 0504: PROBLEMI

64 Per la difficoltà di accettare il criterio BCSH di definizione dei positivi nelle distribuzioni omogenee di fluorescenza, si tende a riportare valori "polarizzati" attorno a 0% (neg) e 100% (pos). E' un problema!

65 Trial 0801

66 Trial 0805 FISH showed a deletion of 11q23 Diagnosi controversa!

67 Diagnosi controversa! (1) Trial 0805 DLBCL or MZL

68 Diagnosi controversa! (2) Trial 0805 B-PLL dd spmzl w/ovl or MCL blast var

69 Diagnosi controversa! (3) Trial 0805 B-PLL

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71 Questions Raised by Leukaemia Scheme # 0904 Why the slide is submitted to expert evaluation in isolation of all other clinical or laboratory information? Auer rods were noted by the expert reviewer in the slide, but they were undetectable in the digital images (both at Immunophenotyping and at Diagnostic Interpretation). How to evaluate Myelodysplasiarelated leukaemia if the available digital images were just peripheral blood with no other maturation lines? Is there any Cytometric cutoff value for Myeloperoxidase? (i.e: 3%, 5%, 20%?...) DOMANDE E PROBLEMI Leukaemia Scheme # 0904 Perché il revisore esperto valuta il vetrino isolatamente da altri dati clinici e di laboratorio? Corpi di Auer sono stati notati dal revisore sul vetrino, ma erano assenti nelle immagini digitali fornite. Come diagnosticare una LAM MDScorrelata, se le immagini disponibili sono solo periferico senza altre linee maturative? Quale può essere oggi il valore di cutoff Citometrico per la Mieloperossidasi? (i.e: 3%, 5%, 20%?...)

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73 Questions Raised by Leukaemia Scheme # 0906 Case # 0906 was referred to UKNEQAS as a MANTLE CELL Lymphoma. 53% participants diagnosed Mantle Cell Lymphoma, according to a phenotypic score system (Leukemia 1994;8:1640). No t(11;14) nor Cyclin D1 status were available. MCL is usually FMC7+ and CD79b+ (case 0906 was negative for both). sig intensity level is not easily evaluable in stabilized samples. At the end of the diagnostic workup, Case # 0906 was reclassified by the referring clinical Centre as a Heavy disease load of lymphoma, B- chronic lymphocytic leukaemia / small lymphocytic lymphoma! DOMANDE E PROBLEMI Leukaemia Scheme # 0906 Il Caso # 0906 è stato riferito a UKNEQAS come un NHL Mantellare. Il 53% dei partecipanti ha diagnosticato un Linfoma Mantellare, probabilmente seguendo i criteri di score fenotipico indicati in Leukemia 1994;8:1640. Non erano riportati dati su t(11;14) né su Ciclina D1. MCL è di solito FMC7+ e CD79b+, ma il caso 0906 era negativo. L intensità delle sig non è ben valutabile nei campioni stabilizzati. Sulla base di una BOM il centro clinico ha quindi riclassificato il caso 0906 come: Infiltrato linfomatoso di alto grado da LLC-B / Linfoma Linfocitico a Piccole Cellule!

74 SOMMARIO Esercizi Ingresso della Dssa Wendy Herber (Cambridge) nello steering committee ha migliorato l analisi morfologica dei casi. L elenco di Core Antigens e di Optional Antigens indica la traccia che un ematologo esperto potrebbe dare al suo laboratorio di citometria per ottimizzare il pannello di marcature (economia!). Emerge in alcuni casi un forte effetto Clone o Fluorocromo, con impatto sulla qualità dei risultati. Si rileva una notevole sensibilità da parte di partecipanti (italiani e non) sugli scores generati anticorpo per anticorpo: fino a 100 per ciascun anticorpo non c è da allarmarsi. Scores sistematicamente alti per singoli anticorpi possono indicare scarsa sensibilità o poca specificità dei coniugati impiegati.

75 Molecular Diagnosis of Haematological Malignancies

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78 JAK2 Scheme

79 Pilot PNH Scheme

80 PNH Scheme Stabilised PNH Granulocytes Developing biological control material for internal & external quality assurance. with Dr S. Richards, HMDS, Leeds 66% 23% 10% 64% 25% 11% Day 1 Day 113

81 Stabilised PNH Red Cells

82 PNH Pilot Study Issued to 90 sites. 58 returned results. Small minority of participants could not detect a PNH clone. Two participants detected a PNH clone with the normal sample issued. CD 59 was used by 83% of participants for the detection of the red cell clones. CD 55 and 59 was used by 80% of participants for the detection of the granulocyte clones.