FARMACI E ANABOLIZZANTI: NORMATIVA DI RIFERIMENTO, METODI E APPROCCIO DI VALIDAZIONE
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- Lucrezia Di Matteo
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1 FARMACI E ANABOLIZZANTI: NORMATIVA DI RIFERIMENTO, METODI E APPROCCIO DI VALIDAZIONE Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell Emilia Romagna B. Ubertini via A. Bianchi, 9 Dr. Guglielmo DUSI Drug Residues Laboratory Food Safety Department Brescia (Italy) guglielmo.dusi@izsler.it Brescia ore / Dr. Guglielmo Dusi Reparto Chimica degli alimenti di Origine animale
2 Dir.96/22/CE Dir.96/23/CE D.Lgs. 336/1999 del 04 agosto 1999 Dir. 2003/74 (modifica 96/22/CE) PNR D.Lgs. 158/2006 del 06 marzo 2006
3 PNR Piano Nazionale Residui.. tenendo conto delle prescrizioni del D.Lgs. n. 158/ viene predisposto (Ministero, Regioni, LNR, IIZZSS) un piano di campionamento a livello del processo di allevamento degli animali e di prima trasformazione dei prodotti di origine animale.
4 E' un piano di campionamento finalizzato: Svelare i casi di somministrazione illecita di sostanze vietate Svelare i casi di somministrazione abusiva di sostanze autorizzate Verificare la conformità dei residui di medicinali veterinari con i limiti massimi di residui (LMR) fissati nel regolamento 37/2010 Verificare le quantità massime di antiparassitari e di contaminanti ambientali fissate dalla normativa nazionale e comunitaria
5 PNR definisce: le specie animali le categorie animali i punti di campionamento le sostanze da cercare modalità di ricerca secondo il dettato della normativa in vigore e le indicazioni della Commissione europea
6 Specie e categorie animali bovini (vitelli, vitelloni, vacche) Suini (suini da ingrasso) ovi-caprini equini volatili da cortile (polli, tacchini, galline) conigli selvaggina d'allevamento e cacciata acquacoltura (trote, eurialine) latte (vaccino, ovi-caprino, bufalino) uova miele
7 Punti di campionamento allevamento macello centro di raccolta delle uova centri di smielatura
8 RENDICONTAZIONE IZS inserimento dati (verbale prelievo ed analisi) REGIONE verifica BANCA DATI RESIDUI (NSIS/PNR) MINISTERO elaborazione dati nazionali
9 ELABORAZIONE DATI UE Dati Paesi Membri SISTEMA INFORMATICO COMUNITARIO QUESTIONARIO N.C. Commissione Europea SUMMARY REPORTS
10 Sostanze da ricercare Direttiva 96/23/CE CATEGORIA A- Sostanze ad effetto anabolizzante 1. Stilbeni, loro derivati e loro sali ed esteri (es. Des, Dienestrolo, Esestrolo) 2. Agenti antitiroidei (es. Tiouracile e derivati, Tapazolo, Mercaptobenzimidazolo) 3. Steroidi (es. Nandrolone, Trenbolone, Metiltestosterone, CORTISONICI, Stanozololo, Boldenone, Etinilestradiolo, GESTAGENI, Progesterone, Testostenone, Estradiolo) 4. Lattoni dell'acido resorcilico (compreso lo zeranolo) 5. Beta-agonisti (es. Clenbuterolo, Isoxisuprina, Ractopamina)
11 Direttiva 96/23/CE CATEGORIA A- sostanze non autorizzate 6. Sostanze incluse nell'allegato del Regolamento 37/2010/CEE (Tabella 2): Sostanze da ricercare Cloramfenicolo Clorpromazina (promazine) Dimetridazolo (nitroimidazoli) Metronidazolo (nitroimidazoli) Nitrofurani (compreso il furazolidone) Ronidazolo (nitroimidazoli).
12 Sostanze da ricercare Direttiva 96/23/CE CATEGORIA B - Medicinali Veterinari e agenti contaminanti 1. Sostanze antibatteriche, compresi sulfamidici e chinolonici 2. Altri prodotti medicinali veterinari a. Antielmintici b. Coccidiostatici, compresi i nitroimidazoli c. Carbammati e Piretroidi d. Tranquillanti (es. PROMAZINE) e. Antinfiammatori non steroidei (AINS) f. Altre sostanze esercitanti un'attività farmacologica
13 Sostanze da ricercare Direttiva 96/23/CE CATEGORIA B - Medicinali Veterinari e agenti contaminanti 3. Altre sostanze e agenti contaminanti per l'ambiente a. Composti organoclorurati, compresi i PCB b. Composti organofosforati c. Elementi chimici d. Micotossine e. Coloranti (es. Verde Malachite) f. Altri
14 ALIMENTI.. LE MATRICI Latte (es. Cloramfenicolo, NITROIMIDAZOLI, Antiparassitari, Antibiotici, AINS) Muscolo (es. Etinilestradiolo, NITROFURANI, Verde Malachite, Antibiotici ) Uova (es. NITROIMIDAZOLI, NITROFURANI, Antibiotici ) Fegato (es. CORTISONICI, Beta-agonisti) Miele (es. Cloramfenicolo, NITROFURANI, Antibiotici ).
15 LE MATRICI E NON SOLO ALIMENTI.. Urina (es. Des, Dienestrolo, Esestrolo, Nandrolone, Trenbolone, Metiltestosterone, CORTISONICI, Stanozololo, Boldenone, Lattoni dell'acido resorcilico, Beta-agonisti, PROMAZINE) Acqua di abbeverata (es. Cloramfenicolo, NITROFURANI) Tiroide (TIREOSTATICI) Grasso (es. GESTAGENI) Siero o plasma (es. Progesterone, Testostenone, Estradiolo, NITROIMIDAZOLI, AINS) Pelo (es. Beta-agonisti) Bulbo oculare (es. Beta-agonisti).
16 I LIMITI DI RIFERIMENTO MRL (Maximum Residue Limit) [Regolamento n 37/2010] Il limite consentito è il limite massimo del residuo, il livello massimo o altra tolleranza massima per le sostanze stabiliti nella legislazione comunitaria.
17 I LIMITI DI RIFERIMENTO MRL Reg 2377/1990 e suc. mod. Reg 37/2010 del 22 dicembre 2009
18 I LIMITI DI RIFERIMENTO Decisione 2002/657/CE (8) È necessario prevedere l istituzione progressiva di limiti minimi di rendimento richiesti (MRPL) dei metodi analitici per le sostanze per le quali non è stato definito alcun limite consentito ed in particolare per quelle sostanze il cui impiego non è autorizzato oppure espressamente vietato all interno della Comunità, al fine di garantire un attuazione armonizzata della direttiva 96/23/CE. Articolo 4 Limiti minimi di rendimento richiesti La presente decisione sarà rivista per stabilire progressivamente i limiti minimi di rendimento richiesti (MRPL) dei metodi analitici da utilizzare per le sostanze per le quali non è stato stabilito alcun limite consentito.
19 I LIMITI DI RIFERIMENTO MRPL Dec.2002/657/CE del 12 agosto 2002 Dec 2004/25/CE del 22 dicembre 2003 Dec 2005/34/CE del 11 gennaio 2005
20 I LIMITI DI RIFERIMENTO MRL (Maximum Residue Limit) MRPL (Minimum Required Performance Limit) (Cloramfenicolo, Nitrofurani, MPA, Verde malachite) Sostanze per le quali è stato fissato un livello fisiologico (Progesterone, Testostenone, Estradiolo) Sostanze per le quali NON esiste nessun limite
21 CONCENTRAZIONI RICERCATE ppt [ng/l] : decine (es.estradiolo 40 ppt) ppb [µg/l o µg/kg]: da frazioni a decine (es. Cloramfenicolo 0,3 ppb - Prednisolone 10 ppb) ppm [mg/l o mg/kg]: fino a decine (es. Nicarbazina)
22 Concentrazione dell analita
23 Purificazione dell estratto
24 Metal Chelate Affinity chromatography (MCAC ) o Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography (IMAC) Fasi: preparazione colonnina chelazione metallo (binding) lavaggio eluizione
25 Immuno Affinity Chromatography (IAC) Fasi: preparazione colonnina condizionamento caricamento campione lavaggio eluizione
26 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE Resorcylic Acid Lactones (RALs) in urine G. Dusi, E. Bozzoni, W. Assini, N. Tognoli, M. Gasparini, E. Ferretti: Development and validation of a confirmatory method fo the determination of resorcylic acid lactones in urine sample by liquid chromatographytandem mass spectrometry - Analytica Chimica Acta 637 (2009), 47-54
27 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE C18 + NH2 IAC ANALITA α β-zearalanolo α β-zearalenolo Zearalenone Zearalanone TRANSIZIONE 321,1 277,1 (picco base) 319,1 275,1 (picco base) 317,1 175,0 (picco base) 319,1 275,1 (picco base)
28 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE α e β Nandrolone - α e β Trenbolone in urine M. Gasparini, M. Curatolo, W. Assini E. Bozzoni, N. Tognoli, G. Dusi: Confirmatory method for the determination of nandrolone and trenbolone in urine samples using immunoaffinity cleanup and liquid chromatography-tandem mass spectrometry J. Chrom. A 1216 (2009),
29 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE C18 IAC Oasis HLB ANALITA β-trenbolone α-trenbolone β-nandrolone α-nandrolone TRANSIZIONE 271,1 199,1 (picco base) 271,1 199,1 (picco base) 275,1 109,1(picco base) 275,1 109,1(picco base)
30 LC-UV/VIS LC-FLUO LC-DAD TLC LC-MS/MS Tecniche analitiche MICROB. GC-MS ELISA RIA
31 Tecniche analitiche adatte alla conferma Tecnica di misurazione HPLC o GC abbinata alla spettrometria di massa HPLC - DAD HPLC fluorescenza GC-ECD HPLC-UV/VIS (singola lunghezza d onda) Decisione 2002/657/CE Sostanze secondo la Direttiva 96/23/CE A e B B B B B Limitazioni A seguito di separazione cromatografia on-line o off-line Solo con tecniche full scan oppure usando almeno 3 (categoria B) o 4 (categoria A) punti di identificazione Devono essere rispettati i requisiti specifici per la rilevazione mediante spettrometria UV Solo per molecole che possiedono fluorescenza propria oppure a seguito di trasformazione o derivatizzazione Solo se sono utilizzate due colonne a differente polarità Solo se sono utilizzati almeno 2 sistemi cromatografici differenti oppure un secondo metodo indipendente di rilevazione
32 Decisione 2002/657/CE Analisi qualitativa: Identification Point (IP) 4 punti di identificazione per le sostanze di categoria A 3 punti per le sostanze di categoria B Tecnica MS Spettrometria di massa a bassa risoluzione (LR) LR-MS n, ione precursore LR-MS n, prodotto di transizione Spettrometria di massa ad alta risoluzione (HR) Punti di identificazione ottenuti per ione
33 Decisione 2002/657/CE Identification Point (IPs) Tecnica Numero di ioni Identification point LC-MS N n LC-MS/MS 1 precursore e 2 prodotti [1+(2x1.5)]= 4 LC-MS/MS 2 precursori, ciascuno con 1 prodotto (1+1.5)x2 = 5 LC-MS/MS 1 precursore, 3 prodotti [1+(1.5x3)] = 5.5
34 Decisione 2002/657/CE Le intensità relative degli ioni rilevati, espresse come percentuale dell intensità del picco base, corrispondono a quelle di campioni drogati (a concentrazioni paragonabili) entro le tolleranze: Intensità relativa (% del picco di base) EI-GC-MS (relativa) CI-GC-MS, GC-MS n LC-MS, LC-MS n (relativa) >50% ± 10% ± 20% >20% - 50% ± 15% ± 25% >10% - 20% ± 20% ± 30% 10% ± 50% ± 50%
35 REGOLAMENTO (CE) N. 882/2004 DEL PARLAMENTO EUROPEO E DEL CONSIGLIO del 29 aprile 2004 relativo ai controlli ufficiali intesi a verificare la conformità alla normativa in materia di mangimi e di alimenti e alle norme sulla salute e sul benessere degli animali Articolo 12 Laboratori ufficiali 1. L'autorità competente designa i laboratori che possono eseguire l'analisi dei campioni prelevati durante i controlli ufficiali. 2. Le autorità competenti, tuttavia, possono designare soltanto i laboratori che operano, sono valutati e accreditati conformemente alle seguenti norme europee: a) EN ISO/IEC su "Criteri generali sulla competenza dei laboratori di prova e di taratura";.. 3. L'accreditamento e la valutazione dei laboratori di prova di cui al paragrafo 2 possono riguardare singole prove o gruppi di prove. 4. L'autorità competente può annullare la designazione di cui al paragrafo 1 se le condizioni di cui al paragrafo 2 non sono più rispettate.
36 II (Atti per i quali la pubblicazione non è una condizione di applicabilità) COMMISSIONE DECISIONE DELLA COMMISSIONE del 12 agosto 2002 che attua la direttiva 96/23/CE del Consiglio relativa al rendimento dei metodi analitici e all interpretazione dei risultati [notificata con il numero C(2002) 3044] (Testo rilevante ai fini del SEE) (2002/657/CE) Gazzetta ufficiale delle Comunità europee L 221/8
37 Decisione 2002/657/CE :ambiti di applicazione Articolo 1 La presente decisione stabilisce le norme per i metodi analitici da utilizzare nelle analisi di campioni ufficiali prelevati in ottemperanza all articolo 15, paragrafo 1, seconda frase, della Direttiva 96/23/CE e riporta criteri comuni per l interpretazione dei risultati analitici provenienti dai laboratori di controllo ufficiali per tali campioni. La presente decisione non si applica alle sostanze per le quali siano state stabilite norme più particolari in altra legislazione comunitaria.
38 Decisione 2002/657/CE Considerando quanto segue:. (4) La direttiva 93/99/CEE del Consiglio, del 29 ottobre 1993, riguardante misure supplementari in merito al controllo ufficiale dei prodotti alimentari e la decisione 98/179/CE (3) richiedono che a partire dal gennaio 2002 i laboratori di controllo ufficiali siano certificati in base alla ISO (1). In ottemperanza alla decisione 98/179/CE, i laboratori autorizzati sono tenuti a partecipare a un programma esterno, riconosciuto sul piano internazionale, di valutazione qualitativa e di accreditamento. I laboratori autorizzati debbono inoltre dimostrare la propria competenza partecipando regolarmente e con successo ad appositi programmi di verifica, riconosciuti od organizzati dai laboratori di riferimento nazionali o comunitari.
39 However, this very complete and complex document (2002/657/EC) is not always very easy to read for the analyst, and the need for a practical "fit-for-purpose" guideline clearly appeared both for the reference and application laboratories The need of to find a compromise between the 2002/657/EC decision requirements, an optimized organization for the assays to use the same experiments to validate several parameters, and some practical aspects and limitations linked to a laboratory activity Antignac J-P et al. Anal. Chim. Acta, 483 (2003)
40 Decisione 2002/657/CE SANCO/2004/2726
41 Decisione 2002/657/CE + SANCO/2004/2726 LINEE GUIDA IIZZSS LINEA GUIDA PER LA VALIDAZIONE INTRA-LABORATORIO DI METODI DI PROVA DI CONFERMA PER LA DETERMINAZIONE DI SOSTANZE NON AUTORIZZATE IN ACCORDO CON LA DECISIONE 2002/657/CE LINEA GUIDA PER LA VALIDAZIONE INTRA-LABORATORIO DEI METODI DI PROVA DI CONFERMA PER LA DETERMINAZIONE DI SOSTANZE DI CATEGORIA B IN CONFORMITÀ ALLA DECISIONE 2002/657/CE LINEA GUIDA PER LA VALIDAZIONE INTRA-LABORATORIO DI METODI DI PROVA DI SCREENING IN ACCORDO CON LA DECISIONE 2002/657/CE
42 Decisione 2002/657/CE: parametri da valutare Capacità di rivelazione (CCβ) Limite di decisione (CCα) Esattezza/ Recupero Precisione Selettività/ Specificità Applicabilità/R obustezza/ Stabilità Metodi qualitativi C Metodi quantitativi C C = Conferma + = parametro obbligatorio
43 Limite di Decisione (CCα) Limite oltre il quale è possibile concludere con una probabilità di errore pari ad α che un campione è non conforme Per le sostanze elencate nel Gruppo A dell allegato I alla Direttiva 96/23/CE, l errore α è pari o inferiore all 1 %. Per tutte le altre sostanze l errore α è pari o inferiore al 5 %.
44 CAPACITA DI RILEVAZIONE (CCβ) E il livello di concentrazione più basso al quale un metodo è in grado di rilevare campioni effettivamente contaminati con un certezza statistica di 1- β. β è la probabilità che il campione sia non conforme nonostante abbia dato esito conforme. Per le sostanze vietate β deve essere < 5%
45 Limite di Decisione (CCα) Capacità di rivelazione (CCβ) Sostanze per le quali è stato stabilito un MRL CCβ LMR > CCα LMR > MRL Sostanze per le quali è stato stabilito un MRPL CCα < CCβ MRPL Sostanze per le quali non esiste nessun limite CCβ > CCα (il più basso possibile)
46 Grazie per l attenzione
PNAA biennio 2006-2007- Esami condotti nella Regione Lazio sui mangimi per animali destinati alla produzione di derrate alimentari Bovini da latte
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