ISTRUZIONI D USO E SCHEDA TECNICA
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- Damiano Corti
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1 Kit ELISA per la determinazione di Immunocomplessi delle varianti di Squamous Cell Carcinoma Antigen (SCCA-IgM) Rev. 05/2017 IT XG003.P 96 Tests DISPOSITIVO MEDICO- DIAGNOSTICO IN VITRO Fabbricante ai sensi della Direttiva 98/79/CE e ss.mm.ii. Benedetti & Co Biosolutions s.r.l. Via Monte Cengio, Padova SIMBOLI UTILIZZATI SULL ETICHETTA Dispositivo medico-diagnostico in vitro Numero di lotto Codice prodotto Data di Scadenza (utilizzare entro ) Limiti di temperatura (conservare tra..) Numero di test Attenzione, leggere le Istruzioni per l uso Rischio Biologico 1.0 USO Hepa-IC è un saggio immunometrico di tipo ELISA per la misurazione della concentrazione degli immunocomplessi dell antigene del carcinoma delle cellule squamose (SCCA-IgM). 2.0 SPIEGAZIONE TEST Hepa-IC è un innovativo saggio diagnostico in-vitro basato sulla rilevazione delle varianti di SCCA circolanti sottoforma di immunocomplesso (SCCA-IgM). Hepa-IC è un saggio ELISA altamente specifico e sensibile per la rilevazione di HCC, realizzato per misurare SCCA-IgM nel siero dei pazienti (1-15). La concentrazione di SCCA-IgM è e- spressa in unità arbitrarie (AU/ml) usando uno specifico calibratore come riferimento. Il dosaggio di SCCA-IgM rispetto al test dell alfa-fetoproteina permette di incrementare notevolmente la sensibilità di rilevazione dell HCC (1,8,9,11-15). E stato dimostrato che il dosaggio di SCCA-IgM è anche utile per valutare il progressivo sviluppo dell HCC sia in pazienti cirrotici sia in quelli affetti da epatite cronica (2-7,10). 3.0 PRINCIPIO DEL TEST I calibratori standard e i campioni sono incubati simultaneamente nei pozzetti della piastra sensibilizzata con anticorpo anti- SCCA umana. Gli immunocomplessi SCCA-IgM sono rivelati con l aggiunta dell anticorpo secondario coniugato con perossidasi e del substrato enzimatico (TMB). Lo sviluppo del colore è proporzionale alla quantità di analita presente nel campione. Pag. 1/8
2 4.0 REAGENTI E MATERIALE FORNITO XG003-PL: una piastra multistrip da 96 pozzetti, sensibilizzata con anticorpo oligoclonale di coniglio anti-scca. XG003-C (1-6) : sei vials di calibratori liofilizzati. La concentrazione esatta dei calibratori è riportata sull etichetta. XG-EA2: 14 ml di soluzione di anticorpo secondario anti-igm coniugato con perossidasi pronta all'uso. XG-CH7: 14 ml di soluzione cromogena pronta all'uso di TMB (3,3,5,5 - Tetramethylbenzidine). XG-ST7: 14 ml di soluzione bloccante di H 2 SO 4 0.3M pronta all'uso. XG-DB5: 5 ml di soluzione di diluizione concentrata 5X da ricostituire in acqua deionizzata. Dopo diluizione la soluzione contiene 1% BSA e 0.05% Tween 20. Contiene Proclin come conservante. XG-WB3: 100 ml di soluzione di lavaggio concentrata 10X da ricostituire in acqua deionizzata. 5.0 STRUMENTAZIONE RICHIESTA MA NON FORNITA Pipette di precisione con puntali monouso Washer per micropiastre Lettore per micropiastre con filtro a 450 ± 20 nm Acqua deionizzata 6.0 CONDIZIONI DI CONSERVAZIONE Il kit deve essere conservato tra 2 e 8 C La data di scadenza è stampata su ogni componente e sull etichetta della confezione. 7.0 AVVERTENZE E PRECAUZIONI 7.1 NORME DI SICUREZZA SOLO PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO Le soluzionistandard XG003-C (1-6) contiengono proteine di origine umana. Tale materiale è stato, tuttavia, testato mediante metodi approvati per la presenza di anticorpi diretti verso il virus dell HIV, verso il virus dell HCV e per la presenza dell antigene di superficie del virus dell epatite B (HBsAg), ed è risultato negativo. Dal momento che nessun test può offrire la completa sicurezza che i virus HIV, HBV, HCV, ed altri agenti infettivi siano assenti, tutti i reagenti di origine umana devono essere considerati potenzialmente infettivi. Di conseguenza si raccomanda fortemente di maneggiare questi reagenti ed i campioni di origine umana in accordo con le Procedure Standard OSHA per i patogeni presenti nel sangue (16). La buona pratica di laboratorio e livelli di sicurezza 2 devono essere usati per materiali che contengono o per i quali si sospetti contenere agenti infettivi (18-19). Non pipettare con la bocca. Usare i guanti monouso e protezione per gli occhi nel maneggiare i campioni e durante la prova. Lavare accuratamente le mani una volta terminato il test. I seguenti reagenti contengono concentrazioni basse di sostanze dannose o irritanti: Il tampone di lavaggio (XG-WB3) contiene detergenti; Il coniugato (XG-EA2) contiene fenolo; la soluzione di diluizione (XG-DB5) contiene Proclin. Il substrato (XG-CH7) è acido; Se un reagente viene a contatto con la pelle o con gli occhi lavare abbondantemente con acqua; Le apparecchiature non monouso devono essere sterilizzate dopo l uso ponendo preferibilmente in autoclave per 1h a 121 C; le apparecchiature monouso devono essere autoclavate o incenerite; L acido solforico contenuto nella soluzione bloccante (XG-ST7) e l acido cloridrico utilizzato per eventualmente lavare la vetreria sono corrosivi; tali sostanze de- Pag. 2/8
3 vono essere utilizzate con cautela. In caso di contatto con la pelle o gli occhi, lavare abbondantemente con acqua; Acidi neutralizzati ed altri rifiuti liquidi devono essere disinfettati aggiungendo sodio ipoclorito in un volume sufficiente da ottenere una concentrazione finale almeno dell 1%. Una esposizione al sodio ipoclorito all 1% di almeno 30 minuti dovrebbe essere sufficiente per garantire una disinfezione efficace. Eventuali versamenti di materiali potenzialmente infetti devono essere rimossi immediatamente con carta assorbente e la zona inquinata dovrà essere pulita ad esempio con sodio ipoclorito all 1%, prima di continuare il lavoro. Se è presente un acido, il sodio ipoclorito non dovrà essere utilizzato prima che la zona sia stata asciugata. Tutti i materiali utilizzati per pulire e- ventuali versamenti accidentali, compresi guanti, devono essere scartati come rifiuti potenzialmente infetti. Non mettere in autoclave materiali contenenti sodio ipoclorito. 7.2 PRECAUZIONI TECNICHE Conservare a 2-8 C Prima dell uso portare i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (18-30 C). Riporre i reagenti alla temperatura di conservazione raccomandata immediatamente dopo l uso. Prima di aprire la busta delle strip lasciarla almeno mezz ora a temperatura ambiente. Non utilizzare i reagenti dopo la data di scadenza. Evitare l inquinamento microbico dei reagenti perché ciò riduce la validità del prodotto e può dare luogo a risultati errati. Non modificare la procedura né sostituire i reagenti con quelli di altri produttori o altri lotti. Non ridurre i tempi di incubazione raccomandati. Si consiglia di lavare accuratamente con acido cloridrico 2M e sciacquare con acqua distillata o deionizzata, tutta la vetreria da utilizzare nel test. Evitare l utilizzo di congelatori autosbrinanti per la conservazione dei campioni. Non esporre i reagenti a forte illuminazione né a vapori di ipoclorito durante la conservazione e le fasi di incubazione. Evitare che i pozzetti si secchino durante il test. Evitare la contaminazione incrociata tra reagenti. E importante utilizzare delle pipette dedicate per l uso. Evitare di toccare il bordo del pozzetto con il coniugato. Non soffiare sulle micropiastre. I dosaggi immunoenzimatici possono talvolta presentare un particolare effetto sul bordo ( edge effect ); si può minimizzare tale effetto aumentando l umidità durante le fasi di incubazione. Le piastre devono essere coperte con i copripiastre ed incubate al buio. In alternativa si possono incubare in un analizzatore adatto. Per ulteriori dettagli consultare l apposito manuale operativo dello strumento. Non si possono utilizzare incubatori a CO 2. Prima di leggere la piastra assicurarsi che il fondo della stessa sia pulito ed a- sciutto e non ci siano bolle d aria sulla superficie del liquido. Può essere fonte di errori l utilizzo di campioni fortemente emolizzati, siero non completamente coagulato o campioni che presentino inquinamento microbico. Leggere il manuale operativo relativo a qualsiasi strumento utilizzato, con particolare riferimento ai seguenti punti: Installazione e requisiti particolari; Principio operativo, istruzioni, precauzioni, rischi; Pag. 3/8
4 Specifiche del produttore e performance dello strumento; Manutenzione ed assistenza tecnica. 8.0 RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Il siero rappresenta la tipologia di campione consigliata per l esecuzione del test Hepa- IC. I campioni di siero dovrebbero essere prelevati in condizioni asettiche ed in modo tale da evitare fenomeni di emolisi. I campioni possono essere conservati a 2-8 C se il saggio è effettuato nelle 24 ore che seguono il prelievo dei campioni, in caso contrario i campioni devono essere congelati. Allo scongelamento, il campione deve essere delicatamente agitato per assicurare consistenza e omogeneità nei risultati. Evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento. I campioni che mostrano sedimento, eritrociti o torbidità devono essere centrifugati e chiarificati prima di eseguire il test I S T R U Z I O N I P E R L U S O 9.1 NOTE TECNICHE Permettere ai campioni ed ai reagenti di raggiungere la temperatura ambiente prima di eseguire il test. Non scongelare i campioni o i reagenti a bagnomaria. Agitare delicatamente i campioni ed i reagenti prima dell uso. Evitare che si formi schiuma. Evitare l esposizione dei reagenti a fonti di calore eccessivo o di luce durante la conservazione e le incubazioni. Campioni e standard dovrebbero essere analizzati in duplicato. Eseguire un curva standard per ciascun test. Usare solo strip pre-adsorbite e provenienti dallo stesso lotto per ciascun test. Non mescolare reagenti provenienti da kit appartenenti a lotti diversi. Eseguire le incubazioni in una scatola chiusa e contenente carta umida allo scopo di prevenire l eccessiva evaporazione. 9.2 PREPARAZIONE DEI REAGENTI Ricostituire i calibratori XG003-C (1-6) liofilizzati con 440 μl di acqua deionizzata per ogni calibratore. I calibratori ricostituiti devono essere conservati a 2-8 C e utilizzati entro due settimane. Preparare la quantità richiesta del tampone di diluizione XG-DB5 diluendo 5 volte la soluzione concentrata con acqua deionizzata. La conservazione a 2-8 C potrebbe causare la formazione di cristalli nella soluzione concentrata, in questi casi è opportuno riscaldare la soluzione a 37 C in agitazione fino alla loro completa scomparsa. Il tampone di diluizione ricostruito deve essere conservato a 2-8 C e utilizzato entro un mese. Preparare la quantità richiesta del tampone di lavaggio XG-WB3 diluendo 10 volte la soluzione concentrata con acqua deionizzata. Il tampone di diluizione ricostruito deve essere conservato a 2-8 C e utilizzato entro un mese. 9.3 ESECUZIONE DEL TEST 1. Preparare i reagenti come descritto sopra. 2. Allestire la piastra con un numero sufficiente di pozzetti che comprendano gli standard ed i campioni. 3. Rimuovere le strip in eccesso e conservarle nell apposita busta di conservazione con l'essiccante fornito. 4. Lavare 3 volte con il tampone di lavaggio XG-WB3 ricostituito (300 µl/well). 5. Dispensare 100 µl/well dei calibratori ricostituiti C1, C2, C3, C4, C5 e C6 (in duplicato) ottenendo una curva di calibrazione a sei punti. La concentrazione esatta dei calibratori è riportata sull'etichetta. Dispensare, in duplicato, 100 µl/well del tampone di diluizione XG-DB5 ricostituito nei pozzetti relativi al controllo negativo (Bianco). Pag. 4/8
5 6. Dispensare 100 µl/well della diluizione 1:8 relativa ai campioni (in duplicato). Usare il tampone di diluizione XG-DB5 ricostituito come diluente. 7. Incubare 1h a temperatura ambiente. 8. Lavare 6 volte con il tampone di lavaggio XG-WB3 ricostituito (300 µl/well). 9. Aggiungere 100 µl/well della soluzione di anticorpo secondario XG-EA Incubare 1h a temperatura ambiente. 11. Lavare 6 volte con il tampone di lavaggio XG-WB3 ricostituito (300 µl/well). 12. Aggiungere 100 μl/well di soluzione cromogena XG-CH Lasciar incubare al buio per min, aggiungere 100 μl/well di soluzione di arresto XG-ST7 e misurare i valori di OD di ciascun pozzetto utilizzando il lettore di micropiastre equipaggiato con un filtro a 450 nm. Leggere la colorazione della reazione bloccata entro 1 ora. 14. Elaborare le OD con il software Xerepro o costruire la curva standard dai valori di OD come descritto nella sezione seguente: elaborazione dei risultati R I S U L T A T I 10.1 ELABORAZIONE DEI RISULTATI a. Eseguire la media delle densità ottiche ottenute in duplicato per ciascuno dei punti dello standard e dei campioni. b. Sottrarre la media delle densità ottiche del bianco. c. Costruire la curva standard mettendo le concentrazioni note dei calibratori sull'asse X e i relativi valori di assorbanza sull'asse Y. d. Calcolare la concentrazione di SCCA- IgM dei campioni per interpolazione con una curva di regressione secondo un'equazione a quattro parametri. e. Moltiplicare per il fattore di diluizione al fine di ottenere le concentrazioni dei campioni prima della diluizione. Figura 1: Tipica curva standard di SCCA-IgM. Dopo 15 minuti la reazione viene bloccata aggiungendo 100µL/well di soluzione di stop. I valori di OD di ciascun pozzetto vengono determinati utilizzando un lettore di micropiastre equipaggiato con un filtro a 450 nm CONTROLLO QUALITÀ Il coefficiente di variazione inter- ed intrasaggio è stato determinato su 4 curve standard ed è risultato essere inferiore al 15%. Per una performance ottimale, l assorbanza relativa al bianco dovrebbe essere inferiore a 0.2 OD@450. Si raccomanda che ciascun laboratorio e- segua il test utilizzando propri campioni precedentemente testati e risultati positivi come controllo di qualità interno in modo da assicurare la correttezza della procedura e dei reagenti INTERPRETAZIONE Hepa-IC può essere utilizzato per (1-15, 20-24): la diagnosi di HCC poiché l analisi di SCCA-IgM è altamente sensibile fino al 70% di rilevazione di HCC ed estremamente specifica fino al 100% nei soggetti senza malattia. valutare il rischio di evoluzione ad HCC in pazienti con malattie epatiche benigne. monitorare la progressione dell epatite in pazienti HCV positivi. Pag. 5/8
6 prevedere la risposta terapeutica al trattamento dell epatite C. determinare la prognosi di pazienti con HCC poiché livelli di SCCA-IgM elevati risultano associati a periodi di sopravvivenza più brevi. monitorare l efficacia dei trattamenti nei pazienti affetti da HCC CARATTERISTICHE DEL SAGGIO 11.1 INTERVALLO L intervallo di calibrazione è compreso tra la concentrazione di XG003-C1 e la concentrazione di XG003-C6. L effetto uncino potrebbe verificarsi per valori di concentrazione superiori a 200 AU/ml (valore letto sulla curva di calibrazione prima di moltiplicare per la diluizione). I campioni con valori superiori alla concentrazione di XG003-C1 dovrebbero essere ulteriormente diluiti e dosati nuovamente PRECISIONE Precisione Intrasaggio Campione C1 C3 H5 H1 N AU/ml CV 2.3% 6.4% 6.3% 12.3% Precisione Intersaggio Campione C1 C3 H5 H1 N AU/ml CV 1.3% 4.1% 2.3% 11% REFERENZE 1. Giannelli G, et al. Clinical validation of combined serological biomarkers for improved hepatocellular carcinoma diagnosis in 961 patients. Clin Chim Acta. 383:147-52, Turato C, et al. HFE, TGF-Beta1 and Squamous cell Carcinoma Antigen-1 Polymorphisms and Liver Disease Stage in Chronic HCV Infection. Dig Liver Dis. 39: A27, Cavalletto L, et al. Clinical Significance of Serum and Liver Tissue SCCA in Chronic Hepatitis C. Dig Liver Dis. 39: A18, Vidalino L, et al. SCCA expression in PBMCs in patients with chronic hepatitis C. Dig Liver Dis. 38/3, Quarta S, et al. Monitoring SCCA-IgM complex predicts HCC development in cirrhotic patients. J Hepatol. 44: S107, Giannelli G, Antonaci S. New frontiers in biomarkers for hepatocellular carcinoma. Dig Liver Dis. 38: 854-9, Pontisso P, et al. Progressive increase of SCCA-IgM immune complexes in cirrhotic patients is associated with development of hepatocellular carcinoma. Int J Cancer. 119: , Beneduce L, et al. A new class of biomarkers for hepatocellular carcinoma; IgM immune complexes. J Clin Virol.36: S48, Beneduce L, et al. Improvement of sensitivity for liver cancer detection by simultaneous evaluation of SCCA-IgM, AFP-IgM complexes and free AFP. J Hepatol. 44: S97, Quarta S, et al. Serum SCCA-IgM Complexes Increase Over Time and HCC Development in Cirrhotic Patients. Dig Liver Dis. 37: A38-A39, Beneduce L, et al. Squamous cell carcinoma antigen-immunoglobulin M complexes as novel biomarkers for hepatocellular carcinoma. Cancer. 103: , Pag. 6/8
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