UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI FERRARA

Transcript

1 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI FERRARA C.A.R.I.D (CENTRO DI ATENEO PER LA RICERCA, L INNOVAZIONE DIDATTICA E L ISTRUZIONE A DISTANZA) e FACOLTÀ DI MEDICINA E CHIRURGIA DIPARTIMENTO DI SCIENZE CHIRURGICHE, ANESTESIOLOGICHE E RADIOLOGICHE Master Universitario in Terapia compressiva e metodiche di riparazione tissutale Unità didattica IL MODELLO PLASMINOGENO di Donato Gemmati Ricercatore - Università degli Studi di Ferrara Direzione del Master Paolo Frignani Coordinamento scientifico Paolo Zamboni Coordinamento didattico Mariasilvia Accardo, Francesca Pancaldi

2 Direzione del corso: Paolo Frignani Autore: Donato Gemmati, Docente del Master, Università degli Studi di Ferrara L edizione del presente volume costituisce parte integrante del Master in Terapia compressiva e metodiche di riparazione tissutale. Non è pertanto destinata a circolazione commerciale. Gennaio C.A.R.I.D. Via Savonarola, Ferrara Tel.: Fax: carid@unife.it

3 Obiettivi QUESTA UNITÀ DIDATTICA AFFRONTERÀ: la fibrinolisi tissutale nei processi di riparazione e rimodellamento tissutale; rapporto fra sistema del plasmogeno e metalloproteasi; la genesi della fibrina.

4 RUOLO DEL SISTEMA DEL PLASMINOGENO NELL OMEOSTASI DELLA FIBRINA E NEL RIMODELLA- MENTO TESSUTALE Il sistema fibrinolitico, oggi meglio definito come sistema del plasminogeno, è costituito da un proenzima inattivo, il plasminogeno, che convertito ad enzima attivo, la plasmina, degrada la fibrina e trasforma le pro-metalloproteasi di matrice (pro-mmp) in MMPs attive, che a loro volta degradano i componenti della matrice extracellulare (Figura 1) (1-3). Sono stati definiti due attivatori fisiologici del plasminogeno, un attivatore tessutale (tpa) e un attivatore tipo urochinasico (upa), il quale si lega ad un recettore cellulare (upar) per completare il processo di attivazione. L inibizione del sistema plasminogeno/mmps avviene: i) a livello degli attivatori fisiologici da parte di inibitori specifici del plasminogeno (PAIs), ii) a livello della plasmina principalmente ad opera dell α 2 - antiplasmina, iii) a livello delle MMPs ad opera degli inibitori tessutali delle MMPs (TIMPs). Il sistema del plasminogeno svolge un duplice ruolo, l uno mediato dal tpa principalmente coinvolto nell omeostasi della fibrina e l altro mediato dall upa principalmente coinvolto nella migrazione delle cellule e nel rimodellamento tessutale. Di conseguenza la definizione di sistema fibrinolitico è divenuta inadeguata e deve essere rimpiazzata dalla più idonea di sistema del plasminogeno. La biochimica, la (pato)fisiologia e le applicazioni terapeutiche del sistema del plasminogeno sono avvenute grazie all impiego di tecnologie di biologia molecolare, comprese quelle del DNA ricombinante che hanno permesso l espressione di proteine eterologhe e la manipolazione di geni target in vivo per l elucidazione del ruolo (pato)fisiologico dei loro prodotti tradotti. PLASMINOGENO PAI-1 e -2 PAI-1 e -2 tpa upa : upar PLASMINA α 2 -ANTIPLASMINA FIBRINA FDP, XDP Pro-MMP MMP (stabilizzata dal FXIIIa) TIMPs Figura 1. Rappresentazione schematica del sistema (fibrinolitico) del plasminogeno. t-pa: attivatore tessutale del plasminogeno; u-pa: attivatore urochinasico del plasminogeno; u-par: recettore per l attivatore urochinasico del plasminogeno; PAI: Componenti inibitore dell attivatore sistema del plasminogeno; del TIMP: inibitori tessutali delle metalloproteasi; FDP/XDP: prodotti di degradazione della fibrina/stabilizzata. Degradazione dei componenti dell ECM

5 Tutti gli enzimi del sistema del plasminogeno sono serin-proteasi, il cui sito attivo è composto da una triade catalitica di aminoacidi, serina, acido aspartico ed istidina. Il sito attivo è localizzato nella regione COOH-terminale della molecola, mentre la regione NH 2 -terminale contiene uno o più domini strutturali/funzionali detti moduli. Gli inibitori del sistema del plasminogeno appartengono alla superfamiglia delle serpine, i cosiddetti inibitori delle serin-proteasi. Nella loro regione COOHterminale presentano un sito reattivo peptidico specifico (Arg-X o Lys-X), che è tagliato dal loro enzima target, risultando nella formazione di un complesso inattivo enzima-inibitore. Le proprietà fisico-chimiche e genetiche dei principali componenti del sistema del plasminogeno, del sistema delle MMP e delle loro interazioni sono descritte successivamente (3,4). Plasminogeno: consiste di 791 aa. E organizzato in 7 domini strutturali, comprendenti un peptide di preattivazione (residui aa 1-77), 5 sequenziali kringle-domain (K) omologhi (struttura a triplo loop), e il dominio proteasico (residui aa ). I kringle-domain contengono siti di legame lisinici che giocano un ruolo cruciale nel legame specifico per la fibrina, per la superficie cellulare e per l α 2 -antiplasmina. Il plasminogeno è convertito a plasmina dal taglio di un singolo legame peptidico compreso tra Arg560 e Val561 (R560, V561) (Figura 2). PLASMIN PAs K76--K77 R560--V561 NH 2 K1 K2 K3 K4 K5 B-CHAIN V441--V442 COOH ELASTASE S S Figura 2. Struttura del plasminogeno (vedi testo). Attivatore tessutale del plasminogeno (tpa). Consiste di 530 aa. È composto di importanti domini con omologie con altre proteine. Un finger-domain (residui aa 4-50), un growth-factor-domain (residui aa 50-87), due kringle-domain di circa 80 residui aa, e un dominio proteasico (residui aa ), comprendente la triade catalitica. Il legame del tpa alla fibrina è principalmente mediato dai finger-domain e dal secondo kringle-domain. Attivatore urochinasico del plasminogeno (upa). Consiste di 411 aa. È composto da un growthfactor-domain, un kringle-domain e un dominio proteasico contenente la triade catalitica. Il growthfactor-domain è responsabile del legame dell upa al suo recettore, che è presente sulla superficie di di molte specie cellulari. L upa, molecola a singola catena, è convertito ad upa a doppia catena dal taglio del legame peptidico Lys 158 -Ile 159. α 2 -antiplasmina (α 2 AP). La forma nativa consiste di 464 aa. È l unica tra le serpine ad avere un estensione COOH-terminale di 51 residui aa, che contiene un sito di legame che reagisce con i siti di legame lisinici sia del plasminogeno che della plasmina. Importante ricordare il residuo Gln 14 della parte NH 2 -terminale dell α 2 -antiplasmina che può legarsi alle catene Aα della fibrina, in un processo che richiede calcio ed è catalizzato dalla forma attivata del FXIII della coagulazione (FXIIIa). Inibitori dell attivatore del plasminogeno (PAIs). Sono il PAI-1 ed il PAI-2. Il PAI-1 è stabilizzato da uno stretto legame ad una proteina di adesione cellulare, la vitronectina. Il PAI-2 esiste in

6 due differenti forme con proprietà cinetiche simili, una forma non glicosilata intracellulare di 47 kda con ed una forma glicosilata secreta di 60kDa. Recettore di superficie cellulare upa specifico (upar). È sintetizzato come polipeptide aminoacidico di 313 aa, successivamente processato al COOH-terminale in una proteina di 283 aa ancorati per metà alla membrana plasmatica cellulare. Lega con alta affinità tutte le forme di upa contenenti un growth-factor-domain intatto. È composto di 3 domini strutturali omologhi di cui quello in posizione NH 2 -terminale lega l upa. Il sistema del plasminogeno e l omeostasi della fibrina La fibrinolisi fisiologica sembra essere regolata da interazioni specifiche molecolari tra i componenti del sistema del plasminogeno (5). Il tpa ha una debole affinità per il plasminogeno in assenza di fibrina, che diviene molto più alta in sua presenza. Questa aumentata affinità sembra essere il risultato di un processo denominato surface assembly costituito dall attivatore del plasminogeno e dal plasminogeno sulla superficie della fibrina. In questa reazione il tpa lega la fibrina mediante il finger-domain ed un kringle-domain, ed il plasminogeno si lega principalmente mediante il sito di legame lisinico e l altro kringle-domain. Infatti, un modo di regolare la fibrinolisi è a livello dell attivazione del plasminogeno localizzato sulla superficie della fibrina. Il blocco reversibile del sito attivo della plasmina col suo substrato, riduce marcatamente il tasso di inattivazione da parte della α 2 AP. Da qui si può estrapolare che le molecole di plasmina generate sulla superficie della fibrina, a cui sono legate attraverso siti di legame lisinici e coinvolti nella degradazione della fibrina, sono protette dalla rapida inattivazione da parte dell α 2 AP. La plasmina rilasciata dalla superficie della fibrina è comunque rapidamente inattivata. Controllo dell attivazione del plasminogeno La rapida rimozione del tpa dal sangue avviene con la clearance epatica mediante due diversi sistemi di riconoscimento (6). Gli epatociti legano il tpa tramite una proteina relata al recettore per le lipoproteine a bassa densità (LRP) e le cellule endoteliali tramite un recettore mannosio-dipendente. La sintesi e la secrezione di tpa e PAI-1 da parte delle cellule endoteliali sono processi altamente regolati. L istamina e la trombina si legano a specifici recettori che attivano la fosfolipasi C. Questa agisce sul fosfatidil-inositolo bifosfato producendo diacilglicerolo, che attiva la protein-chinasi C legata alla membrana, che regola la sintesi di tpa. La sintesi e la secrezione del PAI-1 possono essere modulate da vari agonisti (7, 8). Patofisiologia della fibrinolisi Una carente risposta fibrinolitica può essere causata da un debole rilascio di tpa da parte della parete vasale o da una aumentata risposta dei processi di inattivazione (9). Comunque, una relazione causale tra scarsa sintesi e/o rilascio di tpa e trombosi non è stata definitivamente stabilita nell uomo. La concentrazione di PAI-1 nel plasma è aumentata in molte patologie dal tromboembolismo venoso, all obesità, alla sepsi alla malattia coronarica arteriosa. Ad esempio c e una chiara correlazione tra variazione circadiana dell attività plasmatica del PAI-1 ed insorgenza di infarto del miocardio, con una più alta incidenza alle 8 del mattino, in cui i livelli di PAI-1 risultano più elevati. Al contrario, aumentati livelli di tpa o deficienza di α 2 AP o PAI-1 possono causare una tendenza al sanguinamento. La deficienza omozigote di α 2 AP può essere associata a severa diatesi emorragica (9) così come una eccessiva fibrinolisi dovuta a diminuzione dei livelli di PAI-1.

7 SISTEMA DEL PLASMINOGENO E RIMODELLAMENTO TESSUTALE Le proteasi giocano un ruolo essenziale nei processi di migrazione cellulare e di rimodellamento tessutale, essendo direttamente o indirettamente implicate in molti processi biologici. Essenzialmente attaccano l integrità dei principali componenti della matrice extracellulare, un prerequisito fondamentale per le cellule endoteliali, tumorali, del muscolo liscio, dell infiammazione, che devono migrare in siti distanti ed attivare citochine o liberare fattori di crescita sequestrati per favorire la rigenerazione tessutale (10-12). Le ferite o le ulcere croniche degli arti inferiori sono generalmente caratterizzate da una perdita di tessuto cutaneo, dermico e di strutture di matrice, con una cuffia fibrinica che circonda i vasi dermici (13). La cuffia di fibrina, costituita da fibrina, fibrinogeno, fibronectina, tenascina, laminina e macromolecole di collagene, sembra influenzare significativamente la velocità di guarigione delle ferite a causa del conseguente ridotto trasporto di ossigeno e di nutrienti dal sangue al derma (13). Studi di zimografia hanno dimostrato un elevato stato di attivazione del sistema del plasminogeno in campioni di ulcere venose (14). Ulteriori studi hanno fornito evidenze di una elevata espressione di mrna nonché aumentati livelli di molecole di upa e upar nelle ferite di pazienti con ulcere venose agli arti inferiori. Ciò suggerisce che le ulcere venose, come altri tipi di patologie correlate ad un difettoso e lento processo di guarigione e rimodellamento tessutale, sono caratterizzate da un elevata attivazione del sistema del plasminogeno, per cui è sempre più diffusa l opinione che la cascata enzimatica del plasminogeno, e delle principali molecole coinvolte nel processo, giochi un ruolo cruciale nel delicato e complesso mantenimento dell equilibrio dell attività proteolitica (13). A causa del danno epiteliale, con distruzione degli strati di derma ed epidermide e successiva perdita della struttura della membrana basale, le cellule epidermiche possono venire a contatto direttamente con il collagene. Nel normale processo di guarigione delle ferite, il ripristino dell omeostasi del tessuto avviene attraverso alcuni step fondamentali come la migrazione cellulare attraverso al matrice, la dissoluzione del coagulo, la riepitelizzazione, la riformazione della membrana basale e il rimodellamento dell ECM. Molti di questi processi sono a carico dei cheratinociti, in risposta a segnali propri del processo di guarigione della ferita. In condizioni normali della pelle upa e PAI-1 sono assenti, ma in seguito a danno epiteliale, la loro espressione aumenta significativamente nei cheratinociti. Esperimenti in vitro hanno dimostrato che i cheratinociti in proliferazione hanno un comportamento simile ai cheratinociti implicati nei processi in vivo di guarigione delle ferite, con divisione cellulare, migrazione ed espressione di upa, del suo recettore upar, di tpa e PAI-1. Il completamento di guarigione avviene grazie ad una localizzata e specifica proteolisi dell ECM implicando il sistema del plasminogeno e quello delle MMPs. Quando i cheratinociti sono a contatto con le proteine della matrice provvisoria, quali la fibrina, la fibronectina e la vitronectina, sono prodotti tpa, upa e PAI-1 ed il recettore per l upa (upar) è espresso sulla superficie cellulare. Come conseguenza si ha generazione di plasmina che degrada direttamente i componenti della matrice e la promozione della migrazione e adesione cellulare con un rapido riciclo di upa (Figura 3A). Quando invece i cheratinociti sono a contatto con il collagene (I, III) o con la laminina-5, l espressione del PAI-1 viene fortemente ridotta e l espressione del tpa aumentata. Tali cambiamenti inducono un attivazione del plasminogeno che nella sua forma attiva converte le pro-mmps a MMPs degradanti e rimodellanti il collagene. L aumentata attività del tpa promuove la trasformazione del precursore della laminina-5 nella sua forma matura e l ancoraggio dei cheratinociti alla nuova membrana basale. Infine, gli attivatori del plasminogeno inducono la proliferazione dei cheratinociti e dei fibroblasti e la differenziazione dei cheratinociti (Figura 3B). Da queste evidenze sperimentali si deduce quindi che il processo di rimodellamento tessutale è strettamente e finemente regolate nello spazio e nel tempo (15).

8 A PAI-1 upa tpa Plg Plasmina upa upar Degradazione della matrice Fibrina, Vitronectina, Fibronectina Pro-collagenasi B No PAI tpa upa Plasmina Plg Collagenasi upa upar Degradazione del collagene Collagene (I e III) Laminina 5 Laminina 5 (forma matura) (precursore) tpa Figura 3 A, B. Modello del ruolo della matrice extracellulare nella modulazione della espressione genica delle proteine del sistema del plasminogeno nei cheratinociti (vedi testo). Varianti geniche (polimorfismi) del PAI-1 e loro effetti È stato dimostrato che alcuni polimorfismi nella sequenza del DNA dei geni che codificano per proteine coinvolte nell eziopatogenesi delle ulcere e della loro guarigione, ne modulano i livelli circolanti, contribuendo in un senso o nell altro al rimodellamento tessutale e potenzialmente interferendo sulla suscettibilità delle diverse patologie associate. Un esempio noto è fornito da un polimorfismo del tipo inserzione/delezione [4G/5G] localizzato a -675 paia di basi dal sito di inizio della trascrizione del gene per il PAI-1. Nella sua variante omozigote 5G/5G è significativamente correlato a bassi livelli di PAI-1, di circa il 20-25%, da cui ne risulterebbe una aumentata attività enzimatica legata alla plasmina con conseguenze sulla via fibrinolitica (16) e potenziali effetti sul processo di attivazione delle metalloproteasi di matrice (17). È importante sottolineare come, nella guarigione

9 delle ferite, un delicato bilanciamento tra attività fibrinolitica e proteasica sia di fondamentale importanza per la guarigione fisiologica del tessuto leso.

10 BIBLIOGRAFIA 1. Collen D., Ham-Wasserman lecture: Role of the plasminogen system in fibrin-homeostasis and tissue remodeling. Hematology (Am Soc Hematol Educ Program). 2001; Collen D., The plasminogen (fibrinolytic) system. Thromb Haemost, 1999; 82: Lijnen H.R., Collen D., Matrix metalloproteinase system deficiencies and matrix degradation. Thromb Haemost. 1999; 82: Collen D., Haber E., The fibrinolytic system and thrombolytic therapy. In Chien K.R., ed. Molecular Basis of Cardiovascular Disease. Philadelphia: W.B. Saunders; 1998: Collen D., Regulation of fibrinolysis: Plasminogen activator as a thrombolytic agent. In Nossel H.L., Vogel H.J., eds. Pathobiology of the Endothelial Cell. New York: Academic Press; 1982: Lijnen H.R., Collen D., Mechanisms of physiological fibrinolysis. Baillière s Clin Haematol. 1995; 8: Kruithof EKO., Plasminogen activator inhibitors A review. Enzyme. 1988; 40: Loskutoff D.J., Regulation of PAI-1 gene expression. Fibrinolysis. 1991; 5: Lijnen H.R., Collen D., Congenital and acquired deficiencies of components of the fibrinolytic system and their relation to bleeding or thrombosis. Fibrinolysis. 1989; 3: Carmeliet P., Collen D., Development and disease in proteinase-deficient mice: role of the plasminogen, matrix metalloproteinase and coagulation system. Thromb Res. 1998; 91 (6): Carmeliet P., Collen D., Genetic analysis of blood vessel formation. Role of endothelial versus smooth muscle cells. Trends Cardiovasc Med. 1997; 7: Bajou K., Noël A., Gerard R.D. et al. Absence of host plasminogen activator inhibitor 1 prevents cancer invasion and vascularization. Nat Med. 1998; 4: Herouy Y., Trefzer D., Hellstern M.O. et al. Plasminogen activation in venous leg ulcers. Br J. Dermatol. 2000; 143: Herouy Y., Hellstern M.O., Vanscheidt W. et al., Factor XIII-mediated inibition of fibrinolysis and venous leg ulcers. Lancet. 2000; 355: Jones J.M., Cohen R.L., Chambers D.A., Collagen modulates gene activation of plasminogen activator system molecules. Exp Cell Res. 2002; 280 (2): Humphries S.E., Panahloo A., Montgomery H.E., Green F., Yudkin J., Gene-environment interaction in the determination of levels of haemostatic variables involved in thrombosis and fibrinolysis. Thromb Haemost. 1997; 78 (1): Stefansson S., McMahon G.A., Petitclerc E., Lawrence D.A., Plasminogen activator inhibitor- 1 in tumor growth, angiogenesis and vascular remodeling. Curr Pharm Des. 2003; 9 (19):