Farmacologia del Nitrossido

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1 Farmacologia del Nitrossido Il NO è una molecola ad emivita brevissima (sec.) in grado di diffondere attraverso le membrane biologiche e reagire con una grande varietà di bersagli Il NO dà origine ai suoi effetti biologici reagendo direttamente o attraverso i suoi intermedi, (NO 3- ) Nitrati o (NO 2- ) Nitriti, con vari gruppi chimici contenuti nelle molecole biologiche quali: Ferro-eme : negli enzimi Guanilato ciclasi: GMP ciclico, responsabile della stimolazione delle chinasi specifiche (G-Chinasi) e della modulazione dei canali ionici ad esse sensibili citocromo c ossidasi: inibizione dell enzima nitrosil-eme e in presenza di ossiemoglobina, metaemoglobina e nitrato PGH sintetasi Fe-S clusters : Fe-deprivazione O 2 : NO 2 o (NO 2- ) (O 2- ) : perossinitrito ( - OONO) Ammine e tirosine:nitrosammine danneggiano il DNA e RNA; attività battericida: 3- nitrotirosine generano radicali liberi

2 Gli effetti del NO comprendono: Azioni dell ossido d azoto Vasodilatazione; inibizione dell adesione e dell aggregazione di piastrine e monociti; inibizione della proliferazione del muscolo liscio; protezione contro l aterogenesi Effetti sinaptici sul SNP e SNC Difesa dell ospite da effetti citotossici per azione su agenti patogeni Il NO esercita effetti mediante: Combinazione con l eme della guanilato ciclasi, attivazione dell enzima, aumento del cgmp e conseguente diminuzione di [Ca 2+ ] i Combinazione con i gruppi eme di altre proteine (ad es. citocromo ossidasi) Combinazione con l anione superossido, che porta alla formazione dell anione citotossico perossinitrito Nitrosazione di proteine, lipidi e acidi nucleici

3 Biosintesi dell Ossido d Azoto NO è generato da NOS, complesso enzimatico formato da- monoossigenasi tetraidrobiopterino-dipendente, diidropteridina reduttasi NADPH-dipendente, NADPH ossidasi- a partire da l-arginina NO può essere formato anche attraverso una via non enzimatica, per riduzione dei nitriti. Necessario ph <7!!!. Si conoscono tre forme di NOS NOS INDUCIBILI inos o NOS-II espressa in: Macrofagi, Fibroblasti, Neutrofili, nella Muscolatura liscia vascolare e nelle cellule endoteliali. Essa può essere espressa nei suddetti siti in risposta all introduzione di un agente patogeno. NOS COSTITUTIVE nnos o NOS-I presente in condizioni fisiologichein: neuroni, astrociti, muscolo scheletrico, isole pancreatiche, epitelio gastrico e polmonare, cell. Macula densa renale enos o NOS-III presente in condizioni fisiologiche nell endotelio, epitelio renale, miociti cardiaci, linfociti B e T, epatociti, adipociti

4 Tutte le isoforme contengono, come gruppi prostetici legati Ferroprotoporfiriina IX (eme) Flavina adenilnucleotide (FAD) Flavinmononucleotide (FMN) Tetraidropoietina Contengono anche siti di legame per: L-arginina NADPH (ridotta) Calcio calmodulina I gruppi prostetici e i ligandi controllano l assemblaggio dell enzima nel dimero attivo

5 L attività delle due isoforme costitutive di NOS viene controllata dalla Calcio-calmodulina intracellulare. Il controllo viene esercitato in due modi: Molti agonisti agiscono in maniera endoteliodipendente, aumentando la [Ca 2+ ] i con conseguente attivazione del complesso calcio-calmodulina che attiva enos o la nnos La fosforilazione di specifici residui sulla enos rende più attivo l enzima a una determinata concentrazione di calcio-calmodulina, aumentando la sintesi di NO in assenza di qualsiasi cambiamento di [Ca 2+ ] i

6 NO sintasi NOS 1 Alto peso molecolare Modulazione funzionale da parte di PKA, C; trascrizionale da AP-2, NF-1, CREB, NF-kB Nella sequenza N-terminale presenta una regione aa GLGF che riconosce e interagisce con una sequenza PDZ di proteine di membrana (PSD-95) queste hanno la funzione di coordinare la distribuzione spaziale di recettori, canali, e citoscheletro. La PSD-95 si trova nella membrana postsinaptica neuronale e localizza il 95% dell enzima in questa sede, in modo che possa sentire l aumento di Ca 2+ attraverso VDCCe RCC. Nel muscolo scheletrico è espressa una variante NOS1µ che interagisce con una proteina, la α-sintrofina, sul sarcolemma. L interazione tra nos 1µ e sintrofina consente un maggior flusso di sangue simultaneamente alla contrazione muscolare. Nella D. M. di Duchenne una mutazione di sintrofina impedisce l interazione con NOS 1µ

7 PSD95 (Post Synaptic Density protein BH 4 (Tetraidrobiopterina)

8 NO sintasi NOS 3 Presenza di sequenze consenso per miristilazione (favorisce l associazione con membana cellulare) e palmitoilazione (favorisce il riassociarsi alla membrana) Associata a A. di Golgi, mitocondri. Sulla membrana plasmatica è associata a caveolina-1 e 3. Quando la NOS è fosforilata in tirosina si ha inibizione dell enzima. La Ca2+ - calmodulina defosforila e attiva la NOS 3 che si dissocia da caveolina. Quando il calcio ritorna a livelli basali il complesso si riassocia Fosforilazione in serina da parte di PKB (Akt) attiva l enzima in seguito ad interazione con fattori di crescita endoteliale, fattore di crescita epidermica, l insulina, corticosteroidi, bradichinina., SHEAR-STRESS. La via PI-3K-AKT è sinergica con attivazione da calcio, poiché abbassa la soglia di attivazione dell enzima Fosforilazione in treonina ha effetto inibitorio

9 NO sintasi NOS 3 Il gene per NOS3 è molto grande. La regione promoter 5 presenta siti di riconoscimento per AP-1,-2, NF-1 e steroidi L espressione della NOS3 è aumentata in corso di carenza metabolica, esposizione a freddo, ipossia, ischemia, nell endotelio, nel muscolo cardiaco. In presenza di sheer-stress e estrogeni Polimorfismi di restrizione sono responsabili di patologie cardiovascolari e metaboliche (popolazione caucasica e giapponese)

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11 NO sintasi NOS 2 Localizzazione citosolica, di membrana nel muscolo scheletrico isoforme (splicing alternativo 22 aa in meno) La regione regolatrice del gene influenza la velocità dell enzima. 2 regioni a monte di TATA: 1 responsiva a LPS (NF-IL6 e NF-κB) e legame per STAT ed AP-1; la regione 2 amplifica da 10 a 70 volte l espressione della NOS regolata dalla regione1 e risponde a IFNγ. Nella sepsi LPS è rilasciato dalla parette batterica e circola nel corpo la risposta infiammatoria. IFN-γ è rilasciato dai linfociti infiltrati e amplifica la risposta all LPS intorno al sito dell infezione NO: azione battericida, morte per apoptosi dei macrofagi infettati, facilitazione della proliferazione dei linfociti

12 Jak (Janus Chinasi) Trasduttori del Segnale STAT (Signal Transducers and Activators of transcription)

13 Effetti del NO

14 La via L-arginina/NO delle cellule endoteliali determina un attivazione tonica dei vasi di resistenza, fornendo un meccanismo fisiologico di vasodilatazione che influisce sulle resistenze vascolari periferiche e quindi sulla pressione sistemica del sangue Effetti Vascolari

15 Effetti del NO sul circolo coronarico Il distretto coronarico è dipendente dal rilascio del NO. Il calibro vasale e le resistenze periferiche di questo distretto vengono accomodati, ad ogni ciclo cardiaco, dal rilascio di modulatori endoteliali tra cui il NO Gli inibitori della NOS producono un importante riduzione del flusso coronarico ed antagonizzano l azione coronaricodilatatrice di sostanze, quali l acetilcolina, che accomodano il flusso coronarico attraverso il rilascio di NO da parte delle NOS III

16 Effetti Vascolari

17 Effetti del NO sull ipertensione arteriosa L uso di donatori di NO, come il nitroprussiato è ormai ben consolidato in terapia: l NO stimola la formazione di cgmp, influenzando sia le proteine contrattili (catene leggere di miosina) sia la regolazione del calcio La somministrazione di un inibitore delle NOS (nitroarginina) è in grado di produrre un incremento della pressione arteriosa. L effetto è contrastabile con la L-arginina e suggerisce un alterazione su base genica del sistema L-arginina-NO. La via metabolica L-arginina-NO è importante anche a livello renale ed una sua alterazione può portare a ipertensione renale. Il NO è in grado di interferire con la funzione glomerulare attraverso la vasodilatazione dell arteriola afferente che si concretizza in un incremento finale del coefficiente di filtrazione glomerulare

18 Effetti del NO a livello cellulare Il NO, generato dalle NOSI-II-III in condizioni normali a concentrazioni nanomolari, agisce su due bersagli intracellulari: la GUANILATO CICLASI, che viene attivata e la CITOCROMO C OSSIDASI, che viene inibita L attivazione della guanilato ciclasi porta ad proteine chinasi cgmp dipendenti (G chinasi) [cgmp] e alla stimolazione delle Le G chinasi controllano l omeostasi del Ca 2+, attraverso differenti meccanismi: 1. l inibizione dell attività della PLC β e γ, 2. fosforilazione del recettore per l IP 3, 3. inibizione dell ingresso di Ca 2+ dai canali SOCC e VOCC 4. stimolazione dell estrusione del Ca 2+ dal citosol, attraverso l attivazione dello scambiatore Na + /Ca 2+ e le Ca 2+ - ATPasi del reticolo e della membrana plasmatica La G-chinasi permette un controllo a feedback negativo tra i sistemi dell NO e del Ca 2+

19 Effetti del NO a livello cellulare L interazione tra NO/Ca 2+ è importante nella regolazione del tono vascolare [Ca 2+ ] i stimola l attivazione della chinasi della catena leggera della miosina, inducendo contrazione del muscolo liscio vascolare [Ca 2+ ] i stimola la produzione di NO da parte della NOSIII. Il NO diffonde alle cellule muscolari liscie, dove promuove l attivazione delle G chinasi, con conseguente calo della [Ca 2+ ] i che porta ad inibizione della contrazione muscolare [Ca 2+ ] i stimola l attivazione della PKA, che ha un effetto inibitorio sulla chinasi della catena leggera di miosina, inibendo quindi la contrazione muscolare. La PKA inibisce anche la NOSIII rimuovendo quindi il blocco sulla contrazione originato esercitato dal NO.

20 Effetti del NO a livello cellulare Il NO è il messaggero intracellulare responsabile della regolazione dell attività della citocromo c ossidasi Il NO si lega, con alta affinità, all enzima respiratorio sullo stesso sito in cui si lega l ossigeno. Questo comporta una competizione tra i due gas per l enzima. In condizioni di normossia tissutale (30 μm di O 2 ) il legame del NO è sfavorito e la respirazione procede normalmente Se la [O 2 ] diminuisce, il NO si lega più facilmente alla citocromo c ossidasi, inibendo l attività e rallentando la respirazione. Nel caso in cui l ipossia sia cronica, si ha anche stimolazione della neosintesi di NOS con aumento della generazione di NO che ulteriormente inibisce la respirazione Durante l ipossia si ha un aumento della [Ca 2+ ] i che porta a maggiore stimolazione dell attività NOS

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22 Effetti Neuronali Nel Sistema Nervoso il NO viene prodotto dalla forma neuronale del nnos, Il NO è presente nel 2% circa dei neuroni e in quasi tutte le aree cerebrali; la sua concentrazione è particolarmente alta nel cervelletto e nell ippocampo Il NO si trova nei corpi cellulari, nei dendriti e nelle terminazioni nervose L effetto del NO si verifica con due modalità: 1) Attivazione della guanilato ciclasi solubile, portando alla produzione di cgmp che a sua volta attiva la PKG che fosforila i canali ionici. Questo meccanismo di controllo fisiologico opera a basse [NO], circa 0.1μmol * L -1 2) Mediante reazioni con radicali liberi superossidi, che genera il perossinitrito, un anione altamente tossico che agisce ossidando varie proteine intracellulari; questo richiede concentrazioni pari a 1-10 μmol * L -1

23 Effetti del NO sul SNC e SNP La NOS I è presente in numerose aree del SNC Cervelletto: cellule dei granuli e cellule a canestro Bulbo olfattivo Ippocampo: granuli del giro dentato ed interneuroni Il NO è in grado di modulare la trasmissione sinaptica Il NO è prodotto a seguito di un aumento della [Ca 2+ ] i (indotta dall attivazione di VOCCs o di recettori canali permeabili al calcio) e agisce transinapticamente diffondendo nella cellula contigua e attivando la guanilato ciclasi

24 NO nella modulazione della LTP (Long Term Potentiation) La LTP è indotto a livello ippocampale da stimolazione ad alta frequenza di alcuni circuiti eccitatori e consiste in un potenziamento della risposta sinaptica che persiste per ore o giorni: la LTP è considerata la base neurochimica dei processi che sottostanno all attività mnemonica Studi condotti con inibitori della NOS suggeriscono che il NO, prodotto dalle cellule postsinaptiche, possa agire da messaggero retrogrado che diffonde dal terminale presinaptico in cui induce un aumento del rilascio di neurotrasmettitore (vedi fig 35.6) Il rilascio di neurotrasmettitore va ad attivare la trasmissione glutammatergica attraverso il recettore NMDA

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26 NO nell attivazione corticale La somministrazione di nitroprussiato di sodio, che rilascia spontaneamente il NO, a livello ippocampale e intracerebroventricolare attiva la corteccia; la somministrazione di emoglobina (che rimuove NO ad opera della formazione del complesso eme-no) inattiva la corteccia Tali evidenze suggeriscono che il nitrossido possa svolgere un ruolo fisiologico come mediatore endogeno delle risposte rapide di neuroni corticali a stimoli sensoriali

27 Effetti del NO sul SN vegetativo Le fibre nervose del SNV (NANC) rappresentano una importante componente dell innervazione autonoma della muscolatura liscia gastrointestinale, del sistema genito-urinario e degli altri sistemi Il NO è il neurotrasmettitore di tale sistema, esso regola: 1. Lo svuotamento gastrico e la progressione dell onda peristaltica 2. la trasmissione nervosa a livello uro-genitale 3. La reattività della muscolatura liscia bronchiale

28 Farmacologia dell NO Farmaci che generano NO: Nitroglicerina, nitrito di amile, isosorbide dinitrato, sodio nitroprussiato Combinazione di farmaci antiinfiammatori non steroidei ed esteri nitrici: CINOD, non inducono danno gastrico per attivazione del microcircolo locale e inibizione di processi infiammatori Nitronaproxen: trattamento del dolore acuto e cronico associato a patologie osteoarticolari Nitroaspirina: trattamento di patologie cardiovascolari con azione antipiastrinica e antiaggregante

29 Farmacologia dell NO Farmaci che generano NO: Inibitori della fosfodiesterasi: Sildenafil, tadalafil, vardenafil, su PDE5 selettiva per il cgmp, usato nell impotenza maschile in quanto aumenta la dilatazione di vasi post capillari accrescendo il turgore dei corpi cavernosi BAY : attivatore guanilato ciclasi nell impotenza e nello scompenso cardiaco Farmaci che inibiscono NO Inibitori NOS: L-NAME, L-NMMA Inibitori GC: ODQ Inibitori G chinasi: analoghi cgmp

30 Il NO come mediatore di morte neuronale Una stimolazione anche breve (15 min) con glutammato, porta ad una generazione persistente (24 ore) di NO da parte della NOS I Il NO induce un aumento di rilascio di glutammato generando quindi un circolo di autopotenziamento. Il NO può danneggiare il DNA attraverso la deaminazione delle basi.

31 NO e morte cellulare A concentrazioni fisiologiche NO inibisce la morte cellulare per apoptosi Il cgmp inibisce l attivazione delle caspasi Aumenta l espressione del fattore antiapoptotico Bcl 2 Inibisce la permeabilità mitocondriale e la formazione dello sfingolipide proapoptotico ceramide Finche la glicolisi è mantenuta si ha la protezione dell apoptosi

32 NO e morte cellulare L S-nitrosazione del glutatione rappresenta una modalità di sequestro del glutatione che non può partecipare ai processi redox che attivano la catena caspasi e il programma apoptotico. Ciò consente un rallentamento dell apoptosi tale da favorire la fagocitosi delle cellule prima della necrosi I neuroni hanno bassi livelli di glutatione e non utilizzano la via glicolitica. L NO può dunque avere effetti citotossici attraverso il glutammato rilasciato in corso di ischemia focale. La formazione di radicali liberi stimola la riparazione di DNA da parte di Poli-ADP ribosio sintasi (PARS), attività dispendiosa a danno della cellula