Micotossine e funghi micotossigeni. Davide Spadaro Università di Torino

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1 Micotossine e funghi micotossigeni Davide Spadaro Università di Torino

2 1. Funghi micotossigeni 2. Micotossine e micotossicosi 3. Significato biologico e importanza economica 4. Interventi preventivi 5. Interventi curativi 6. Interventi legislativi 7. Analisi delle micotossine

3 Micotossine Metaboliti secondari dei funghi, tossici per l uomo e gli animali. Gli stati di avvelenamento o le malattie da essi causati sono detti micotossicosi. Ingestione di macromiceti erroneamente scambiati per commestibili; ingestione di derrate alimentari contaminate da micromiceti.

4 Storia Nel XIX secolo: Epidemie tra cavalli o maiali alimentati con foraggi o mangimi deteriorati. Scarsa attenzione alle possibili cause. Nel 1962 in Inghilterra: clamorosa moria di tacchini alimentati con arachidi infette da Aspergillus flavus. La tossicità di semi e cariossidi, mal conservati e invasi da A. flavus, era dovuta a diversi metaboliti secondari, aflatossine.

5 Aflatossine prodotti da specie di Aspergillus, B1, B2, G1 e G2 (fluorescenza blu e verde quando osservate su TLC agli UV), Tossicità acuta: rifiuto del cibo, indebolimento, aborto Tossicità cronica: cancro del fegato

6 Paesi tropicali Grave rischio sanitario: le cattive condizioni di conservazione portano l umidità del seme a livelli favorevoli allo sviluppo dei funghi produttori. Paesi temperati Rischio sanitario moderato: capacità di passare nel latte delle bovine alimentate con foraggi avariati. La presenza di livelli di aflatossine superiori ai limiti consentiti è frequente anche in partite americane di mais.

7 Funghi tossigeni Numerose specie fungine produttrici di micotossine sono comuni patogeni dei cereali e sono diffuse in aree geografiche sia a clima temperato, sia a clima semi-tropicale e tropicale. Cereali attaccati autunno-vernini: frumento duro e tenero, orzo, avena, segale e triticale Cereali attaccati primaverili-estivi: mais, riso e sorgo Malattie: marciumi delle radici, dello stelo e delle spighe. Capacità di produrre micotossine nelle piante attaccate in pieno campo con conseguente accumulo delle stesse nei prodotti finali, sui quali l accumulo di micotossine può proseguire durante l immagazzinamento e durante le operazioni di trasformazione dei prodotti.

8 Specie fungine più importanti che producono micotossine nei cereali appartenenti ai generi: Fusarium, Claviceps, Alternaria, Aspergillus, Penicillium. Specie xerofile (alofile): capaci di accrescersi in condizioni di bassa umidità (a w 0,75). Specie psicrofile: capaci di accrescersi in condizioni di bassa temperatura (T<5 C).

9 Infection density Incidence of mycological flora on kernels of barley field fungi Alternaria Aureobasidium Cladosporium Rhizopus Chaetomium Fusarium storage fungi Aspergillus Penicillum Mucor Rhizopus malt fungi Geotrichum Mucor Rhizopus Field Harvest Storage Malt production after Müller, Brauwelt 134,

10 Altri generi comprendono ceppi di portata micotossicologica più limitata: meno tossici, limitati geograficamente, ricorrenti in circostanze o su colture poco diffuse. Tra questi altri generi: Acremonium, Chaetomium, Diplodia, Myrothecium, Phomopsis, Rhizoctonia, Sclerotinia, Stachybotrys, Trichoderma e Trichothecium.

11 Poche specie e non tutti i ceppi Lieviti non tossigeni: no formazione di micotossine nei processi fermentativi. Una o poche specie dei generi di funghi tossigeni sono produttori di micotossine. Non tutti i ceppi di una stessa specie tossigena sono produttori di micotossine o, quanto meno, non con la stessa capacità.

12 A. flavus: 45% dei ceppi produttore di aflatossine di tipo B. A. parasiticus: 92% dei ceppi produttore di aflatossine di tipo B e G. A. ochraceus: 17% dei ceppi produttore di OTA P. verrucosum: 62% dei ceppi produttore di OTA

13 Aspergillus Genere di funghi imperfetti. Ife Conidiofori portanti sulla vescicola terminale, sia direttamente (uniseriati) sia mediante sterigmi (biseriati), cellule (fialidi) producenti conidi unicellulari, da ialini a colori vivaci.

14 Il genere comprende almeno 50 specie, diffusissime e ubiquitarie, normalmente saprofite e degradatrici di ogni sorta di materiale organico. Alcune specie xerofile e tossigene sono da annoverare tra i più pericolosi agenti di ammuffimento delle derrate conservate. Pochi isolati sono anche fitopatogeni e possono accumulare micotossine nelle piante infette.

15 Specie Micotossina Coltura o prodotto a rischio A. carbonarius Ocratossina Uva A. clavatus Patulina Cereali, Mandorle, Insilati A. flavus Aflatossine Cereali, Arachidi, Oleaginose, Mandorle A. fumigatus Verrucologeno Insilati, Farine, Mangimi A. glaucus Gliotossina Foraggi, Mangimi A. nidulans Sterigmatocistina Cereali, Farine, Mangimi A. ochraceus Ocratossina Cereali, Legumi, Caffè crudo A. parasiticus Aflatossine Arachidi, Mais, Manioca, Noci A. terreus Gliotossina Insilati, Mangimi A. versicolor Sterigmatocistina Insilati, Mangimi

16 La contaminazione da aflatossine prodotte da Aspergillus flavus e A. parasiticus blocca le esportazioni di arachidi, entrata importante per alcuni PVS (Cina).

17 Aspergillus flavus on groundnut ~ contamination with Aflatoxins

18 Aspergillus flavus dà una muffa verde oliva polverosa. E molto comune nelle annate calde e secche. Il fungo può essere identificato nel mais perché produce composti fluorescenti in presenza di luce nera. Non si può però identificare direttamente la presenza di aflatossine.

19 Penicillium Genere di funghi imperfetti, ifali. Conidi unicellulari, da ialini a colori vivaci, originati da un verticillio di fialidi inserito alla sommità dell ifa conidiofora sia direttamente (monoverticillati) sia tramite metule (biverticilliati o complessi). fialidi metule conidi conidioforo

20 Il genere comprende 96 specie, ubiquitarie, normalmente saprofite, degradatrici di ogni sorta di materiale organico e capaci di adattarsi alle più disparate condizioni di vita. Alcune specie xerofile e/o psicrofile sono da annoverare tra i più pericolosi agenti di ammuffimento delle derrate conservate. Almeno il 70-80% delle specie di Penicillium sono potenzialmente micotossigene.

21 Specie Micotossina Coltura o prodotto a rischio P. citreonigrum Citrinina Riso, Altri cereali, Mangimi, Spezie P. implicatum citrinina Cereali, Farine P. purpurescens Ocratossina Cereali, Mandorle P. spinulosum Citrinina Cereali, Farine P. thomii Citrinina Cereali, Mandorle P. citrinum Citrinina Riso, Altri cereali, Legumi P. janthinellum Ac. Penicillico Cereali, Legumi P. melinii Patulina Stoppie, Paglie, Lettiere P. simplicissimum Verrucologeno Insilati, Mangimi P. aurantiogriseum Ac. Ciclopiazonico Cereali, Mangimi P. camemberti Ac. Ciclopiazonico Mandorle P. chrysogenum Ocratossine Cereali, Farine, Frutta P. crustosum Patulina Cereali P. expansum Patulina Frutta, Cereali P. griseofulvum Patulina Cereali, Legumi P. verrucosum Ac. Penicillico Mandorle P. verrucosum Ocratossine Cereali, Mangimi P. islandicum Luteoschirina Riso, Altri Cereali, Mandorle, Legumi P. purpurogenum Rubratossine Cereali e Legumi P. rugulosum Patulina Patate, Frutta P. variabile Ocratossine Cereali, Legumi P. verruculosum Verruculogeno Insilati, Fieni, Stoppie, Mangimi P. vulpinum Patulina Fieni, Stoppie, Lettiere Penicillium nordicum Carni Ocratossina A

22 Fusarium Genere di funghi imperfetti, ifali. Conidi pluricellulari (macroconidi), fusiformi, ialini, prodotti in sporodochi. Alcune specie producono anche microconidi e clamidospore. Il genere comprende 50 specie. Genere di grande importanza fitopatologica con specie agenti di malattie vascolari (tracheofusariosi) e specie agenti di malattie parenchimatiche (marciumi, cancri).

23 Alcuni ceppi delle specie fitopatogene possono iniziare la loro attività tossigena nelle piante infette (cereali), e continuarla poi durante la raccolta e nei prodotti conservati se le condizioni restano favorevoli (contenuto di umidità 20-22%).

24 Fusarium culmorum Fusarium graminearum Fusarium avenaceum Fusarium cerealis Fusarium tricinctum Fusarium poae Dehne, Oerke & Steiner 2005

25 Specie Micotossina Coltura o prodotto a rischio F. acuminatum Tricoteceni tipo A Moniliformina Cereali, Foraggi, Legumi F. avenaceum Moniliformina Cereali, Legumi F. crookwellense Tricoteceni tipo B Zearalenone Cereali, Patate F. culmorum Tricoteceni tipo B Zearalenone Cereali F. equiseti Trocoteceni tipo A e B Zearalenone Cereali, Banane F. graminearum Tricoteceni tipo B Zearalenone Cereali F. heterosporum Zearalenone Cereali, Banane F. verticillioides Fumonisine Cereali F. oxysporum Fusarine Moniliformina Cereali Wortmannina F. poae Tricoteceni tipo A Cereali F. proliferatum Fumonisine Cereali F. sambucinum Moniliformina Tricoteceni tipo A. Patate, Carote, Luppolo F. semitectum Zearalenone Tricoteceni tipo A Frutta, Ortaggi, Patate, Banane F. sporotrichioides Zearalenone Tricoteceni tipo A Zearalenone Cereali F. subglutinas Moniliformina Cereali

26 Mycotoxin formation by different Fusarium - species on cereals Fusarium- species Tricho- Zearale- Fumo- Monili- Fusa- cycl. thecenes nones nisines formin rines Peptides F. avenaceum F. culmorum F. crookwellense F. equiseti F. graminearum F. moniliforme F. poae F. sambucinum F. sporotrichioides F. subglutinans F. tricinctum F. venenatum Desjardins & Proctor 2001 Dehne, Oerke & Steiner 2005

27 Fusariosi della spiga (Fusarium head blight) Maggiore suscettibilità di frumento duro e frumento tenero. Diffusione epidemica Europa, Asia, Sudafrica, Nordamerica e Australia. Segnalata in Italia fin dal Recentemente, anche in aree cerealicole dell Italia meridionale a causa di andamenti climatici primaverili eccezionalmente piovosi. Sintomatologia: su spighe immature, disseccamenti parziali o totali della spiga. Disseccamenti parziali dovuti ad attacco di fusariosi su spiga di frumento duro a confronto con spighe sane

28 Condizioni ideali: andamenti climatici piovosi e/o caldo umidi, in coincidenza con le fasi fenologiche comprese tra la spigatura e la maturazione latteocerosa. In tali condizioni è possibile osservare la presenza di masserelle color arancio (sporodochi) costituite dalle fruttificazioni agamiche. Particolare di spiga di grano tenero contaminata da masserelle color arancio (sporodochi) costituenti le fruttificazioni agamiche di Fusarium spp.

29 Fusariosi della spiga può determinare marcati decrementi produttivi: la spiga colpita a maturazione risulta vuota o con cariossidi striminzite. Granaglie raccolte inutilizzabili sia per l impiego come semente sia per l alimentazione umana, se l attività tossigena dei funghi ha determinato la presenza, oltre certi limiti, di micotossine.

30 Specie coinvolte: F. culmorum e F. graminearum (DON e ZEA), F. avenaceum, F.poae (T-2) Attività tossigena di queste specie: in campo durante le fasi conclusive di vegetazione della pianta durante lo stoccaggio delle granaglie se temperatura e umidità nei silos favorevoli F. culmorum e F. graminearum

31 Dehne, Oerke & Steiner 2005

32 Marciume della spiga di mais da Fusarium Prevalentemente condizionata dalle variabili climatiche (temperatura), anche se le pratiche agricole possono esercitare a loro volta una certa influenza. Il marciume rosso (F. graminearum e F. culmorum DON e ZEA) è particolarmente diffuso in annate e in località in cui si hanno piogge intense e temperature basse durante l estate o inizio autunno. Il marciume rosato (F. verticillioides e F. proliferatum - FB) si incontra più frequentemente quando si ottengono temperature più elevate e con ridotta umidità.

33 Nel marciume rosso, il patogeno solitamente si sviluppa a partire dalla sommità della spiga per diffondere un micelio di colore rosso che si estende lungo tutta la spiga. Sui cartocci e sugli steli delle spighe si possono osservare spesso periteci di colore bruno scuro, che sono i corpi fruttiferi di Gibberella zeae, il teleomorfo di F. graminearum.

34 Negli ultimi 10 anni: specie associate al marciume rosato sempre più prevalenti, in particolare nelle zone più meridionali di coltivazione. Indagini su F. verticillioides hanno evidenziato che questo fungo utilizza come principale via di infezione delle cariossidi, le sete nel momento in cui queste si formano. Comparsa di marciume rosato sulla spiga che si manifesta con un micelio rosa che si sviluppa su cariossidi isolate o raggruppate. Fusarium verticillioides

35 Successivamente, anche infezioni fungine dovute ad attacchi e ferite di insetti quali la piralide del mais (Ostrinia nubilalis): gli insetti come vettori di spore, le spore trasportate dal vento o da schizzi di pioggia, utilizzano come veicolo di infezione le lesioni determinate dagli insetti. Marciume rosato della spiga di mais L importanza di stabilire il tipo di specie di Fusarium presenti sulle spighe di mais risiede anche nel rischio di accumulo di micotossine (diverso in funzione delle specie di Fusarium).

36 Specie principali di Fusarium associate con il marciume della spiga del mais e principali micotossine prodotte Specie fungina FBs AF BEA FUP MON T-2 DON ZEA F. culmorum no no no no no no si si F. graminearum no no no no no no si si F. poae no no si no no si no no F. proliferatum si si si si si no no no F sporotrichioides no no no no no si no no F. subglutinans no si si si si no no no F. verticillioides si si no no no no no no FBs= Fumonisine; AF= Acido fusarico; BEA= Beauvericina= FUP= Fusaproliferina; MON= moniliformina; T-2= Tossina T-2; DON= Deossinivalenolo

37 Claviceps Genere di funghi ascomiceti Ascospore filiformi in aschi cilindrici racchiusi in periteci immersi nello sferidio originato dallo sclerozio.

38 sferidi o ascomati composti periteci con ostiolo Sclerozi su spighe di segale. Gli sclerozi provengono dalla trasformazione degli ovari come esito finale di infezioni fiorali.

39 Dallo sclerozio germinato emerge lo stroma contenente i periteci. All interno dei periteci si trovano aschi contenenti ascospore.

40 Dehne, Oerke & Steiner 2005

41 sclerotia on rye Dehne, Oerke & Steiner 2005

42

43 honeydew sugary ooze or exudate, often from aphids, and a characteristic symptom of ergot (honeydew stage of sorghum ergot)

44 Il genere comprende 35 specie. Dal punto di vista micotossicologico: gli sclerozi si accompagnano alle cariossidi e alle farine, le fruttificazioni (periteci) acquistano un significato particolare per gli animali alimentati con essenze cerealicole infette (foraggio, pascoli).

45 1. Funghi micotossigeni 2. Micotossine e micotossicosi 3. Significato biologico e importanza economica 4. Interventi preventivi 5. Interventi curativi 6. Interventi legislativi 7. Analisi delle micotossine

46 MICOTOSSINE E MICOTOSSICOSI Numerose Nella maggior parte dei casi: metaboliti tossici studiati in laboratorio con scarsa probabilità di essere ritrovati come contaminanti naturali. Solo alcune trovate nelle derrate alimentari, e di esse pochissime associate a micotossicosi naturali. aflatossine, zearalenoni, tricoteceni (deossinivalenolo, tossina T-2), ocratossine, ergoline (alcaloidi di Claviceps), fumonisine, patulina.

47 CLASSIFICAZIONE DI ALCUNE MICOTOSSINE SULLA BASE DEL RISCHIO CANCEROGENO PER L UOMO (IARC, 1993) Gruppo 1 Cancerogene per l uomo Aflatossine B 1, B 2, G 1, G 2 Gruppo 2B Cancerogene per gli Aflatossina M 1 animali e possibili cancerogeni per l uomo Ocratossina A Fumonisine adattata da: International Agency for Research on Cancer. Monographs on the Evaluation of Carcinogenic risk to humans. IARC Lyon, France, VOL. 56, 1993,

48 Aflatossine Le aflatossine sono prodotte esclusivamente da Aspergillus flavus e da Aspergillus parasiticus, due delle 11 specie del gruppo A. flavus. A. flavus è ubiquitario e produce solo aflatossine di tipo B. A. parasiticus è ristretto alle aree tropicali e subtropicali e produce aflatossine di tipo B e G. L incidenza di isolati tossigeni in A. flavus e in A. parasiticus è rispettivamente del 45% e del 92%. Le aflatossine appartengono al gruppo chimico dei polichetidi e hanno somiglianza strutturale con le fitoalessine cumariniche.

49 Delle 18 aflatossine descritte, le più frequenti sono: AB1, AB2, AG1 e AG2 soprattutto nei prodotti vegetali; AM1 e AM2 essenzialmente nel latte.

50 Si formano soprattutto nelle aree tropicali e sub-tropicali nelle colture e nelle derrate di mais, arachidi, semi oleaginosi, noci e mandorle, cocco, caffè, cacao, spezie, frutta (fichi, pistacchi) e radici (manioca) essiccate naturalmente. Il contenuto minimo di umidità per la crescita delle muffe aflatossigene è di: 18,3-18,5% per frumento, mais e sorgo; 16-17% per il riso, fagioli e altri legumi; 17-17,5% per la soia; 9-9,5% per le arachidi e le mandorle; 9,5-10% per i semi oleaginosi. T min opt e max per la crescita delle muffe: 6-8 C, C e C. T min opt e max per la sintesi delle aflatossine: 8 C, C e 42 C.

51 Importante è la presenza di aflatossine nel latte (effetto carry over) e nei prodotti lattiero-caseari. Trascurabile in altri prodotti zootecnici. Le aree geografiche più a rischio per la formazione delle aflatossine sono le regioni subtropicali e tropicali, dove concomitanza favorevole di fattori favorevoli: presenza prevalente di isolati tossigeni, colture e condizioni agro-ambientali più idonee, tecnologie di produzione, di trasformazione e di conservazione dei prodotti non sufficientemente adeguate.

52 Inattive nella composizione chimica originaria, convertite nel fegato in un composto tossico instabile. Aflatossina B 1 attivata: epossido Le aflatossine sono metaboliti con attività cancerogena, mutagena e teratogena, dotate di elevata tossicità.

53 Il loro ampio spettro di azione scaturisce dalla peculiare capacità di reagire con gli acidi nucleici e le nucleoproteine cellulari, determinando effetti deleteri sulla sintesi proteica e sull integrità cellulare. Sono essenzialmente potenti epatotossine, dotate di elevata attività genotossica, agenti di epatocarcinomi. Effetti cellulari delle aflatossine

54 Tra le micotossicosi naturali causate dalle aflatossine: aflatossicosi (Malattia X del Tacchino) alcune sindromi a carico dell uomo, Deposito di grassi nel fegato di un pollo limitate ad alcune aree a rischio più elevato: Cirrosi infantile dell India; Sindrome di Reye; con ingrossamento del fegato Denutrizione (Ipoproteinemia) infantile dell Africa; Epatocarcinoma umano.

55 La Commissione IARC preposta alla valutazione delle sostanze cancerogene ha incluso l aflatossina B 1 nel Gruppo 1, tra le sostanze sicuramente cancerogene per gli animali e per l uomo. La presenza di aflatossine nei mangimi è causa di ricorrenti aflatossicosi sia acute e sia, soprattutto, sub-acute in tutti gli allevamenti zootecnici. Per la comparsa di manifestazioni acute sono sufficienti presenze di aflatossina B 1 nella dieta di: 0,15-0,2 mg/kg per le specie aviarie e per i suini; 0,3 mg/kg per i bovini; 0,2-10 mg/kg per l uomo possano risultare da tossiche a letali.

56 Almeno 50 Paesi hanno finora adottato limiti di tolleranza per le aflatossine negli alimenti. Limiti di tolleranza USA e UE: 0,02 mg di AFB1 per kg di alimento o di mangime (0,02 ppm = 20 ppb); USA: 0,005 mg di AFM1 per litro di latte (0,005 ppm = 5 ppb). UE: 0,00005 mg di AFM1 per litro di latte (0,05 ppb = 50 ppt). Per mitigare gli effetti negativi delle aflatossine può essere utile aumentare i livelli di vitamina A, E e B1, di selenio, zinco, rame e manganese nei mangimi completi.

57 Zearalenoni Prodotti da diverse specie di Fusarium e in particolare da F. graminearum (Gibberella zeae) e F. culmorum. Il composto che, tra i 12 metaboliti caratterizzati, riveste maggiore importanza micotossicologica è lo zearalenone, che a volte si ritrova assieme allo zearalenolo.

58 Gli isolati fitopatogeni possono iniziare la loro attività tossigena nelle colture cerealicole infette (mais, frumento, sorgo, orzo, avena) e continuarla durante la raccolta e nei prodotti conservati (granaglie, insilati, fieni). Condizioni favorevoli: contenuto di umidità dei prodotti del 20-22% alternanza di temperature diurne di C e notturne di C che stimolano la formazione di zearalenone [e DON]). I prodotti soggetti a contenere zearalenone sono i cereali (cariossidi, sfarinati, mangimi, alimenti) ed in particolare il mais. Anche in Italia, è possibile trovare zearalenone non solo nelle spighe di mais infette, ma anche negli insilati (silo-mais).

59 Elevate concentrazioni di zearalenone sono piuttosto frequenti soprattutto nei mangimi e determinano iperestrismo negli allevamenti di maiale. Gli zearalenoni non sono dotati di tossicità acuta, sono ormoni dotati di attività anabolica e uterotrofica. Determinano uno sconvolgimento delle attività ormonali legate alla sfera sessuale che porta a ipofertilità e iperestrismo (sindrome estrogenica). I maialini con le gambe storte possono morire di fame o essere schiacciati

60 Il prolasso rettale è comune nei maiali nutriti con mais contaminato da zearalenone Vulve gonfie sono un tipico segnale di zearalenone

61 Tricoteceni I tricoteceni sono un gruppo di almeno 70 composti biologicamente attivi, prodotti da diversi generi di funghi. I tricoteceni di Fusarium aventi importanza micotossicologica possono essere raggruppati in: tricoteceni di tipo A, circa 33 metaboliti, tra cui la tossina T-2, il diacetossiscirpenolo e il neosolaniolo; tricoteceni di tipo B, circa 9 metaboliti, tra cui il deossinivalenolo (DON, noto anche come vomitossina), il nivalenolo (NIV) e il fusarenone-x (FUS).

62 Le specie di Fusarium di maggiore interesse per la produzione di tricoteceni sono: F. sporotrichioides e F. poae producono tricoteceni di tipo A (T-2). Funghi con debole attitudine parassitaria che si sviluppano sui cereali sia in campo che in magazzino. F. poae F. graminearum e F. culmorum producono tricoteceni di tipo B (DON). Agenti di fusariosi dei cereali e la formazione di tricoteceni avviene in condizioni simili a quelle descritte per gli zearalenoni. Condizioni favorevoli: contenuto di umidità dei prodotti del 20-22% alternanza di temperature diurne di C e notturne di C.

63 I prodotti soggetti a contenere tricoteceni sono essenzialmente i cereali (frumento e mais). I tricoteceni non mostrano attività genotossiche e pertanto figurano tra le sostanze non carcinogene del Gruppo 3 (IARC). I tricoteceni, e in particolar la tossina T-2 e il DON, sono dotati di elevata tossicità acuta. La tossina T-2 e derivati hanno una più spiccata attività dermotossica, emorragica e immunosoppressiva e sono responsabili della comparsa negli allevamenti zootecnici (aviari) della Sindrome emorragica (Tossicosi da mais ammuffito): dermatiti orali, gastro-enteriti emorragiche e leucopenia.

64 Elevata immunotossicità: stato progressivo di cattiva salute degli allevamenti, con forti decurtazioni delle produzioni zootecniche. Manifestazioni di tricotecenotossicosi sull uomo: in passato: leucopenia tossica alimentare (ATA), intossicazioni alimentari da DON negli anni 90 in India, Cina e Giappone. Il DON ha una più spiccata attività emetica ed è responsabile della comparsa in allevamenti zootecnici (suini) della Sindrome emetica (e della Sindrome di rifiuto di alimento): vomito, rifiuto di alimento, riduzione del peso corporeo.

65 Malformation of pigs due to T-2 Skin irritation especially at legs and ears

66 Malformation of pigs due to T-2 Necrotisation of tails in the age of 5-6 days

67 Mammal - toxicity of important Trichothecenes Toxin mice -LD 50 relative to [mg/kg] T-2-Toxin A-Trichothecenes: T-2-Toxin 5,2 1,0 Diacetoxyscirpenol 23,0 4,4 B-Trichothecenes: Nivalenol 4,1 0,8 Deoxynivalenol 70,0 13,5 3-Acetyl-DON 34,0 6,5 15-Acetyl-DON 14,0 2,5 source:miller et al. 2001: Deoxynivalenol: A 25 year perspective on a trichtothecene of agricultural importance

68 Ocratossine Prodotte da diverse specie di Aspergillus e di Penicillium. Saprofiti, ubiquitari, agenti di ammuffimento di granaglie, mangimi e alimenti. A. ochraceus colonizzatori di colture tropicali e sub-tropicali (caffè, cacao) nonché di prodotti da forno; A. alliaceus colonizzatori di mandorle e fichi delle aree temperate più calde; A. carbonarius e Aspergillus sez. Nigri colonizzatori di uva e derivati; P. verrucosum colonizzatori dei cereali (orzo, frumento, segale) delle aree temperate più fredde.

69 Delle 9 ocratossine descritte, l OTA è clorurata ed è la più tossica, seguita dalla OTB e dalla OTC. Chimicamente sono descritte come 3,4-diidro-metilisocumarine derivate legate con legame amidico al gruppo amminico della L- b-fenilalanina. Solo l ocratossina A riveste importanza micotossicologica.

70 OTA: R =Cl e R=H OTB: R =H e R=H OTC: R =Cl e R=CH 2 CH 3

71 Condizioni ottimali: contenuto minimo di umidità del 15-16% per i cereali, temperature di 4-37 C C favoriscono A. ochraceus (diffuso nelle regioni tropicali) C favoriscono P. verrucosum (diffuso nelle regioni fredde). Prodotti contaminati da ocratossine: cereali, legumi, caffè, prodotti da forno (pane), vino, birra. Diffusione nei mangimi, ricorrenti ocratossicosi negli allevamenti di suini e di specie aviarie. Tracce di ocratossine, essendo molto persistenti, si ritrovano anche nelle carni di maiale (sangue, reni, fegato, muscoli). Assunte tramite l alimentazione e accumulate.

72 ALIMENTI CONTAMINATI DA OCRATOSSINA A E RELATIVI FUNGHI PRODUTTORI ALIMENTO FUNGHI PRODUTTORI Cereali (frumento, orzo, mais, segale, avena), mangimi, prodotti da forno, legumi, cacao, noci, caffè, uva, uva passa, succo d uva, mosto, vino, birra, carni di maiale (sangue, reni, fegato, muscoli), insaccati Aspergillus ochraceus, A. carbonarius, A. niger Penicillium verrucosum

73 Fonti di contaminazione in OTA per l uomo occidentale 5% 4% 3% 6% 8% 10% 13% 50% 1% cereali vino carne caffè spezie birra cacao frutta secca altro L OTA si può trovare frequentemente in un ampia gamma di prodotti alimentari. Il vino è la seconda fonte di ocratossina A.

74 COOR 2 H O OH O EFFETTI TOSSICI N H 4 O H 10 CH 3 ANIMALI R 1 Attività nefrotossica, mutagena, cancerogena, teratogena, immunosoppressiva. Maggiore resistenza degli animali poligastrici (bovini e ovini): l OTA è inattivata dalla flora ruminale a Otα meno tossica. Particolarmente sensibili i monogastrici (suini e specie aviarie): cattivo stato di salute (gastroenteriti, immunodeficienza), riduzione delle produzioni (aborto, ritardi nella crescita), epatiti, nefriti associate con la comparsa di carcinomi.

75 EFFETTI TOSSICI Le ocratossine sono nefrotossine che causano disfunzioni renali e alterazioni di tutto l apparato urinario, anche con la comparsa di carcinomi. ANIMALI Responsabili della comparsa negli allevamenti della ocratossicosi classica (Nefropatia micotossica dei suini e delle specie aviarie).

76 EFFETTI TOSSICI UOMO OTA è trovata con frequenza nel sangue umano. Associata alla Nefropatia Endemica dei Balcani (BEN). Sospetta causa di tumori del tratto urinario (UTT) e di nefriti interstiziali croniche in Nord Africa. Caratteristiche cliniche della BEN: perdita di sali anemia proteinuria e ematuria pallore Caratteristiche patologiche della BEN: reni contratti restringimento delle vene dilatazione dei vasi linfatici

77 Correlazione con consumo di caffè e carne di maiale

78 Ergoline (alcaloidi di Claviceps) Famiglia delle ergoline (alcaloidi tossici): derivati dell acido lisergico, circa 30 composti, tra cui l ergotamina; clavine, circa 15 composti, tra cui l agroclavina. Claviceps purpurea parassitizza le graminacee da granella (frumento, orzo, avena, segale, mais e riso) ( mal dello sclerozio dei cereali ) e numerose essenze prative. Il fungo colonizza l ovario trasformandolo in un feltro micelico su cui si differenzia prima la forma conidica e poi quella scleroziale. Gli sclerozi, che si accompagnano alle cariossidi, contengono fino all 1% di alcaloidi tossici. Ingeriti sono causa di ergotismo.

79 Ergot-Alcaloids Ergoline as basic structure Ergotine as the mycotoxine Dehne, Oerke & Steiner 2005

80 Effetti biologici delle ergoline raggruppati in base al sito di azione: effetti periferici - vasocostrizione (Sindrome gangrenosa) e contrazione dell utero; effetti neuroumorali - antagonismo verso adrenalina e serotina; effetti sul SNC - riduzione dell attività dei centri vasomotori e stimolazione di quella dell ipotalamo (Sindrome allucinogenica e convulsiva). Il consumo degli sclerozi con i cereali e le farine contaminate da parte dell uomo e degli animali in produzione zootecnica determina la comparsa di Ergotismo, spesso confuse nel Medioevo con la possessione.

81 Painting at the Isenheim Triptichon at Colmar Mathias Grünewaldt about 1512 "The Attempt of St. Anton" the figure down left represents intoxication of ergót alkaloids. Dehne, Oerke & Steiner 2005

82 Dehne, Oerke & Steiner 2005

83 Ergotismo cronico nel bestiame gangrena delle estremità zampe posteriori, coda, orecchie rossore, gonfiore, mancanza di sensibilità media zoppaggine si riprende se si elimina mangime

84 % of samples Incidence of Ergot-contamination in cereals in Switzerland: ergot sclerotia in mg / kg grain Dehne, Oerke & Steiner 2005

85 Fumonisine Quattro serie di fumonisine caratterizzate Il composto più diffuso e tossico: fumonisina B 1 (FB 1 ) Prodotta da F. verticillioides e F. proliferatum Agenti di fusariosi del culmo e di marciume rosato della spiga di mais. La FB 1 si ritrova essenzialmente nelle cariossidi e negli insilati di mais, e nei mangimi e alimenti a base dei mais.

86 Non sono dotate di tossicità acuta ma: FB 1 somministrata al ratto: tumori al fegato e ai reni FB 1 sospettata di causare nell uomo la comparsa di un tumore dell esofago. Per tale attività cancerogena, la FB 1 è stata inclusa tra le sostanze del Gruppo 2B: sostanze sicuramente cancerogene per gli animali e possibilmente anche per l uomo. Sintomi di marciume della spiga di mais e difetti neonatali nel tubo neurale di topi indotti da FB1.

87 Le fumonisine sono responsabili della comparsa negli allevamenti di diverse sindromi: ELEM (leucoencefalomalacia equina), una neurotossicosi letale degli equini, con formazione di nuclei degenerativi nell encefalo; edema polmonare del maiale; epatiti e immunodeficienza dei bovini e delle specie aviarie. tremori muscolari, vertigini, incapacità di deglutire, depressione lesioni macroscopiche o microscopiche della materia bianca nel cervello

88 MODALITA DI AZIONE DELLE FUMONISINE Le Fumonisine alterano il metabolismo sfingolipidico mediante inibizione dell enzima ceramide sintetasi Accumulo di sfinganina (SA) e conseguente aumento del rapporto sfinganina - sfingosina (SA/SO) nei liquidi biologici o tessuti

89 Fluorescence (mv) CROMATOGRAMMI HPLC DI URINA DI RATTO PRIMA E DOPO ESPOSIZIONE A MANGIMI CONTAMINATI DA FUMONISINE (15 mg/kg) SA SO SO = sphingosine SA = sphinganine Time (min)

90 Intestinal epithelium cells of pigs after infection with pathogenic Escherichia coli bacteria : left = fodder with Fumonisin B 1 right = without mycotoxin contamination a. Oswald et al Dehne, Oerke & Steiner 2005

91 Marciumi post-raccolta e patulina Penicillium expansum Marciume verde-azzurro di mele e pere Penicillium griseofulvum Prima segnalazione in Italia (Spadaro et al 2011) Sequenziamento del genoma (Banani et al 2016)

92 Tossicità, limiti, presenza Sintomi acuti: convulsioni, edema, infiammazione intestinale e vomito. Effetti cronici: genotossicità, immunotossicità e neurotossicità nei roditori Clear apple juices Cloudy apple juices Mixed juices Total juices Positive (%) ppb per succhi di mela e sidro 25 ppb per prodotti solidi a base di mela 10 ppb per baby food Positive (%) Mean (µg l-1) Succhi di mela puri e misti: 34,8% (media: 6,42 µg kg -1 ). Spadaro et al., 2007, Food Control Succhi di pera, pesca, albicocca e misti. 32,0% (3,53 µg kg -1 ) Spadaro et al., 2008, Food Addit Contam B

93 CAST, 2003

94 Nei Paesi UE sono in vigore: una normativa sul contenuto massimo ammissibile di AB 1 nei mangimi, che a partire dal 1976 viene periodicamente aggiornata con un progressivo abbassamento della soglia tollerabile specialmente per i mangimi destinati alle lattifere e agli animali giovani una regolamentazione riguardante alcuni degli alimenti più a rischio. in attesa di una più completa normativa anche sulla scorta di direttive nazionali, come quella emanata in Italia.

95 Regolamento 466/2001 inoltre Aflatossine in noci, frutta secca, cereali, spezie e latte (R257/2002 e R 472/2002 e R 2174/2003) OTA in cereali e prodotti derivati e uva passa (R472/2002) OTA in vino, cacao e caffé (R 123/2005) Patulina in succhi di mela (R 1425/2003) Limiti di alcune micotossine negli alimenti per l'infanzia e negli alimenti dietetici a fini medici speciali (R 683/2004): 0,10 ppm per AFB 1, 0,025 ppm per AFM 1 e 0.50 ppm per OTA. Fusarium-tossine (R 856/2005): DON e ZEA. T-2, HT-2, FB1 e FB2.

96 Regolamento 1881/2006: ocratossine

97 Regolamento 1881/2006: ocratossine

98 Regolamento 1881/2006: patulina

99 Regolamento 1126/2007: DON

100 Regolamento 1126/2007: Zearalenone

101 Regolamento 1126/2007: fumonisine

102 Regolamento 165/2010: aflatossine Era 5 e 10 Era 5 e 10 Era 2 e 4 Era 2 e 4

103 Regolamento 165/2010: aflatossine

104 Regolamento 165/2010: aflatossine

105 Limiti di legge per AF (Reg 165/2010) Prodotti alimentari B 1 (μg/kg) Arachidi da sottoporli a cernita prima del consumo umano Mandorle e pistacchi da sottoporli a cernita prima del consumo umano Nocciole destinate al consumo diretto umano Somma B 1, B 2, G 1 e G 2 (μg/kg) 8,0 15,0 12,0 15,0 5,0 10,0

106 Per i reati di avvelenamento di acque o sostanze alimentari e di adulterazione e contraffazione di sostanze alimentari la guardia di finanza ha arrestato Francesco Casillo, amministratore e gestore di fatto del Molino Casillo di Corato (Bari), azienda leader in Italia nella produzione di semola di grano duro e tra i maggiori importatori mondiali di grano. IL SEQUESTRO - L'arresto di Casillo, 39 anni, di Corato (Bari) è legato al sequestro effettuato in settembre nel porto di Bari di una partita di grano duro proveniente dal Canada. Partita di ben 58 mila tonnellate, risultata contaminata da ocratossina, una sostanza fortemente nociva e cancerogena. L'arresto è avvenuto sulla base di un'ordinanza di custodia cautelare in carcere fatta dal gip del tribunale di Trani Michele Nardi su richiesta del sostituto procuratore della Repubblica Antonio Savasta.

107 LE MOTIVAZIONI - Secondo le Fiamme Gialle, l'imprenditore «che vanta una posizione di monopolio di fatto nel settore della commercializzazione dei cereali e dei suoi derivati», nonostante «fosse in possesso sin dal momento dell'acquisto concluso in Canada, di una certificazione della competente Autorità di controllo canadese attestante la presenza, seppur nei limiti previsti dalla normativa comunitaria, di una contaminazione da ocratossina del prodotto da importare». «In tal modo, producendo analisi di laboratorio da cui emergeva falsamente l'assenza di agenti patogeni o contaminanti pregiudizievoli alla salute pubblica, Casillo, inducendo in errore l'autorità Giudiziaria inquirente, riusciva nei primi giorni del mese di ottobre dello scorso anno ad ottenere il dissequestro dell'intero carico contaminato, così da poter introdurre nel commercio un prodotto acquistato a prezzi sensibilmente inferiori ai mercuriali dell'epoca, realizzando dolosamente spregiudicati margini di guadagno e destabilizzando l'equilibrio dell'intero settore». 11 gennaio 2006