Capitolo 1. Le micotossine. Una buona nutrizione può contribuire a ridurre la prevalenza di molte

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1 Capitolo 1 Le micotossine 1.1 Sicurezza alimentare e salute dell uomo Una buona nutrizione può contribuire a ridurre la prevalenza di molte malattie diffuse attualmente in Europa, come ad esempio le malattie cardiovascolari, il cancro, il diabete, l obesità e l osteoporosi. Le abitudini alimentari e l assunzione di alimenti dipendono da scelte individuali (influenze culturali, preferenze alimentari), nonché da fattori socioeconomici e ambientali (economicità e disponibilità di alimenti, qualità e sicurezza dei prodotti ecc.) [FDA, 1994]. I fattori socioeconomici e ambientali sono a loro volta influenzati da politiche che rientrano nelle responsabilità degli Stati membri e della Comunità. L articolo 152 del trattato CE stabilisce che la Comunità Europea deve assicurare un elevato livello di protezione della salute umana nella definizione e nell attuazione di tutte le politiche e attività. Poiché quello della nutrizione è un fattore determinante della salute, è essenziale che le componenti nutrizionali di tutte le politiche comunitarie contribuiscano ad assicurare un elevato livello di protezione della salute umana *. In base a tali considerazioni chiaramente espresse dalla Commissione Europea e recepite sul piano nazionale dal Ministero della Salute appare chiaro come priorità strategica il raggiungimento degli standard più elevati * Tratto integralmente dalla Relazione sullo stato dei lavori della Commissione europea nel campo della nutrizione in Europa, Commissione europea, Direzione generale per la Salute e la tutela dei consumatori Ottobre

2 possibili di sicurezza alimentare, come principale azione a tutela della salvaguardia della salute dei cittadini. [European commission, 2006; Miraglia M, 2002 ] La strada da percorrere a tale scopo si snoda attraverso varie tappe: l applicazione del nuovo quadro giuridico del settore alimentare che riflette la politica dai campi alla tavola andando a coprire l intera catena alimentare; l attribuzione al mondo della produzione della responsabilità primaria di una produzione alimentare sicura; l esecuzione di appropriati controlli ufficiali; la capacità di attuare rapide ed efficaci misure di salvaguardia di fronte ad emergenze sanitarie che si manifestino in qualsiasi punto della catena alimentare; l attenzione verso nuove problematiche emergenti. 1.2 I funghi e la formazione delle micotossine Le micotossine costituiscono una notevole gamma di composti, alcuni dei quali possono avere anche caratteristiche di genotossicità, cancerogenicità, immunotossicità, mutagenicità, nefrotossicità e teratogenicità e la loro presenza negli alimenti costituisce un indubbio pericolo per salute umana [Peraica M, 1999; Hussein HS, 2001]. Il termine micotossina unisce la parola greca mykes, fungo, alla parola latina toxicum, velenoso ed è usato per i composti tossici prodotti da 2

3 diverse specie di funghi che possono contaminare varie tipe di matrici. Le micotossine sono metaboliti secondari (MS) prodotti dalle muffe (funghi microscopici) che colonizzano le derrate alimentari [Puschner B, 2002] e sono costituite da piccole molecole generalmente stabili e difficilmente degradabili. Tali metaboliti non sono essenziali per la crescita, lo sviluppo o la riproduzione della pianta o dell'organismo che li produce. Per questo vengono detti "secondari" e la loro funzione è normalmente di natura ecologica come ad esempio svolgere azione di difesa contro erbivori o patogeni [Etzel RA, 2002]. Le muffe sono praticamente ubiquitarie ed è impossibile evitarne la presenza, per questo le micotossine rappresentano una questione di tipo mondiale [D Mello JPF, 1999]. Ogni micotossina può essere prodotta da una o più specie di funghi, così come in alcuni casi una singola specie fungina può formare più tossine. L Aflatossina, ad esempio, può essere formata da differenti specie quali Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus e altri Aspergilli, mentre l Ocratossina viene prodotta da A. ochraceus nelle regioni tropicali e da P. verrucosum nelle aree temperate [Shephard GS, 2008]. Tuttavia, la contaminazione di un fungo che produce tossine non implica automaticamente la presenza della tossina associata, in quanto diversi fattori sono coinvolti nella formazione di micotossine, così come, l assenza del fungo non garantisce l assenza della micotossina, soprattutto a causa della stabilità e della persistenza di tali composti [Chu FS, 1991]. 3

4 Pur essendo le micotossine soltanto recentemente caratterizzate e studiate, l effetto tossico della contaminazione nelle derrate alimentari è noto fin dal medioevo. Già da allora, ad esempio, si era a conoscenza che la malattia nota con il nome di fuoco di Sant Antonio era un effetto dell intossicazione a seguito di assunzione di pane di segale contaminato da Ergot o segala cornuta, nome comune dell ascomiceta Claviceps purpure [Woolf A, 2000]. I principali generi di funghi micotossigeni sono Aspergillus, Penicillum e Figura 1: Aspergillus, Penicillum e Fusarium. Fusarium mostrati in Figura 1. La presenza di micotossine negli alimenti coinvolge tutta la filiera produttiva: dal campo alla tavola. È noto, infatti, che non solo le tecniche agronomiche e l andamento meteorologico possono condizionare la contaminazione, ma anche le operazioni di post-raccolta nonché le fasi domestiche di conservazione o di manipolazione degli alimenti. 4

5 Le muffe, possono svilupparsi principalmente su derrate alimentari di origine vegetale sia a seguito di stress ambientali cui la pianta è stata sottoposta come ad esempio condizioni di estrema aridità del campo, mancanza di un assorbimento bilanciato di nutrienti, sia a causa di fattori ambientali come condizioni climatiche, temperatura, umidità, attacco da insetti e volatili. In condizioni favorevoli allo sviluppo di funghi tossigeni, le micotossine possono essere formate in una qualunque delle fasi di produzione e di trasformazione di un prodotto alimentare. In particolare, le micotossine possono essere prodotte nelle piante infette in pieno campo; nel corso delle operazioni di raccolta, nelle derrate immagazzinate (stoccaggio, trasporto), nel corso delle trasformazioni tecnologiche e delle preparazioni alimentari [Peraica M, 2001]. Durante la fase di coltivazione l attacco delle piante da parte degli insetti e dei parassiti agevola l infezione e la formazione di muffe tossigene. La contaminazione nelle fasi successive alla raccolta è influenzata dall epoca della raccolta, dal livello di maturazione e di umidità, dalle operazioni fisiche svolte (danni meccanici al prodotto). Durante la fase di stoccaggio sono le condizioni di temperatura e umidità insieme ai tempi di permanenza in ambienti chiusi (per esempio nei silos) a influenzare l attacco da parte delle muffe. Mentre la sintesi delle micotossine da Fusarium (zearalenone, vomitossina, ecc.) avvengono principalmente durante la fase di coltivazione, quelle da Aspergillus e Penicillium (Aflatossina, Ocratossina) si verificano soprattutto durante lo stoccaggio degli alimenti. Al contrario di quanto si 5

6 verifica durante la coltivazione (formazione di aflatossine in paesi tropicali e sub-tropicali) [Reddy DVR, 2000], la sintesi delle aflatossine durante lo stoccaggio può avvenire anche nelle zone temperate e più fredde come nel nostro paese. [Decastelli L, 2007] Il tipo di substrato è l'elemento che probabilmente più di ogni altro influenza la tossinogenesi. E' noto che i vegetali favoriscono la produzione di micotossine, più dei substrati animali; la presenza soprattutto di amido sembra incrementare la micotossinogenesi e, in particolare, la presenza di zinco limitatamente alla sintesi di aflatossine. I cereali, i semi oleaginosi e la frutta secca sono al vertice degli alimenti più frequentemente contaminati da aflatossine, tra i quali mais, arachidi e semi di cotone rappresentano i prodotti più a rischio. I cereali sono invece i principali veicoli di Ocratossina. In tutti i Paesi le derrate alimentari a rischio sono i cereali, alcune specie di frumento, mais, segale, orzo. Non sono esenti dal problema altri prodotti vegetali, come certe oleaginose, e complementari, quali vino, caffè, cacao, spezie e frutta secca [Özay G, 1991; Trucksess MV, 2008]. In Tabella 1 vengono indicate le principali specie fungine che producono micotossine e per quali alimenti si riscontra generalmente la contaminazione. La maggior parte delle micotossine presenti nelle varie matrici alimentari sono state isolate e caratterizzate chimicamente per struttura e composizione [Gilbert J, 1999] e sono da tempo studiate anche dal punto di vista tossicologico e classificate come composti di Classe I 6

7 (cancerogeni) e di Classe II (potenziali cancerogeni) [Liu BH, 2002; Chu FS,1994]. MICOTOSSINE Aflatossine B1, B2, G1,G2 Zearalenoni Zearalenone Zearalenoio Ocratossina Ocratossina A Ocratossina B Tricoteceni Tossina T2 Deossinilvaenalo Nilvaenalo (NIV) Fumonisine Rubratossine Rubratossine A Rubratossine B FUNGO PRODUTTORE Asperagillus flavus, A.parasitticus Fusarium graminearum, F. cuimorum Aspergillus ochraceus, nigri, Penicillium verrucosum F. rosum, F. solani, F. tricintumed altri fusarium Fusarium sporotrichioides, tricinctum, culmorum, graminearum, croockwellwnse F. verticilloides, oroliferatum P. rubrum P. purpurogenum, altri Penicillum spp. ALIMENTO CONTAMINATO Arachidi ed altre leguminose, mais ed altri cereali, semi oleosi, noci e mandorle Mais ed altri cereali Orzo mais ed altri cereali. Pane pasta ed altri prodotti da forno Orzo mais ed altri cereali Mais e prodotti a base di mais mais ed altri cereali Citrina Penicillum spp. Cereali Tabella 1: Principali specie fungine, relative micotossine prodotte ed alimento contaminato Molte micotossine sono chimicamente stabili anche dopo la cottura, resistendo anche alle elevate temperature come quelle raggiunte durante la panificazione o durante la produzione industriale di vari prodotti alimentari a base di farinacei, per cui risulta indispensabile potere approntare screening veloci, sensibili ed affidabili per ricercare una possibile contaminazione soprattutto a livello delle materie prime utilizzate [Binder EM, 2007]. 7

8 1.3 I vari tipi di micotossine Le Aflatossine Le Aflatossine sono prodotte da tre specie di funghi Aspergillus, A. flavus, A. parasiticus e A. nominus e costuiscono un gruppo di circa 20 metaboliti, anche se soltanto le aflatossine B1, B2, G1 e G2, si trovano normalmente in alimenti quali i cereali, le noci, i fichi e la frutta secca, ma in Italia è stata recentemente dimostrata la contaminazione di thè, spezie e alcune piante medicinali [Romagnoli B, 2007]. Tali composti rappresentano una delle principali categorie di micotossine che contamina il latte e i suoi derivati, poiché vengono assunti dagli animali attraverso la somministrazione di mangimi contaminati, per questo motivo i controlli dovrebbero essere eseguiti anche sui prodotti lavorati. [CVRAD-FAO]. Le aflatossine M1 e M2 sono metaboliti idrossilati delle aflatossine B1 e B2 e Figura 2: formula molecolare delle Aflatossine B1 e M1 8

9 sono prodotte quando le mucche o altri ruminanti ingeriscono mangimi contaminati da queste micotossine (Fig. 2). Le aflatossine sono solubili in solventi moderatamente polari come il cloroformio, metanolo e solfossido dimetilico e si dissolvono in acqua nella misura di mg/litro. Sono particolarmente fotosensibili e fluorescenti alle radiazioni UV. Le aflatossine purificate sono stabili soprattutto in assenza di luce e di radiazioni UV, e rimangono stabili a temperature superiori ai 100ºC. A causa delle loro caratteristiche chimiche le aflatossine rimangono stabili negli alimentii, poiche resistenti alla degradazione. Dal punto di vista tossicologico è noto da tempo l effetto epatotossico dell' AflatossinaB1 [Li F-Q, 2001], per cui l'esposizione cronica, di lunga durata, anche a livelli estremamente bassi nella dieta può essere considerata un rischio per la salute umana. Attualmente nelle zone temperate e sviluppate del mondo, l'avvelenamento acuto degli animali è raro e nell'uomo è estremamente improbabile soprattutto per merito dei controlli effettuati sugli alimenti, anche se nel 1960 si verificò un intossicazione acuta negli allevamenti di pollame del Regno Unito, che causò la morte di più tacchini, a causa di concentrazioni estremamente alte di aflatossine che contaminarono il mangime. Ciò ha permesso di mettere al corrente l'industria ed i governi sui potenziali effetti devastati di un allevamento da parte delle aflatossine. La tossicità acuta dell'aflatossina è stata dimostrata, in passato, in una vasta gamma di mammiferi, i pesci, uccelli, conigli, cani e primati. Soprattutto 9

10 alcune specie allevate quali anatre, tacchini e le trota si sono rivelate particolarmente suscettibili all azione tossica dell AflatossinaB1. Per la maggior parte della specie la LD50 (dose mortale) è fra 0.5 e 10mg/kg di peso corporeo. L'organo bersaglio principale è il fegato, anche se sono stati inoltre osservati effetti sui polmoni, sul miocardio e sui reni e addirittura sul cervello [Fung F, 2004]. L avvelenamento acuto da Aflatossina avviene raramente nell uomo, anche se sporadici, sono stati riportati principalmente in Africa o Asia a causa di consumo di cereali contaminati, il più delle volte granturco, riso e mandioca (yucca). L effetto tossico delle micotossine (come ad esempio le T2 e la fumonisina) può anche interessare il sistema immunitario [Fekete SGY, 2007; Bouhet S, 2004] e nervoso [Campbell AW, 2004]. L'AflatossinaB1 è un potente agente mutageno che causa aberrazioni cromosomiche in diverse cellule vegetali, animali e umane. La carcinogenicità e la mutagenicità delle aflatossine B1, G1 e M1 sembrano essere il risultato della formazione di epossido reattivo in posizione 8, 9 dell'anello terminale del furano e della successiva formazione di un legame covalente all acido nucleico. La carcinogenicità di AflatossinaB1 è stata studiata in almeno 12 specie differenti. Anche se le aflatossine G1 e M1 sono state meno studiate, sembrano essere tossicologicamente simili alla AflatossinaB1. 10

11 I metodi convenzionali per l analisi delle Aflatossine A causa delle caratteristiche di estrema tossicità delle Aflatossine in ogni parte del mondo moltissimi prodotti agro-alimentari e di derivati lattierocaseari sono prelevati sia dai produttori, che successivamente dagli importatori o dai fornitori dell'alimento per essere analizzati. In molti paesi si effettuano anche campagne sanitarie regolari per verificare l assunzione di tossine da parte della popolazione in modo da poter intraprendere azioni terapeutiche in caso di intossicazione. In alcuni alimenti come il burro di arachidi, nella frutta secca, specialmente nei pistacchi e nella noce del Brasile sono state infatti riscontrate alti livelli di contaminazione, fino a 1000 µg/kg. I metodi analitici convenzionali impiegati per l identificazione di Aflatossine nelle matrici alimentari sono essenzialmente di tipo cromatografico: quali la TLC (Thin Layer Chromatography) e la HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) [Ferreira I, 2004; Vahl M, 1998], anche se recentemente vengono considerati validi e applicati metodi di dosaggio che utilizzano gli anticorpi poli e monoclonali, quali i test ELISA (Enzyme Link Immuno Assay) e i biosensori immunologici [Ammida NHS 2006], a causa della relativa semplicità di utilizzo di tali sistemi analitici [Collin R, 1998; De Saeger S, 1996; De Saeger S, 1999]. L evoluzione dei sistemi immunologici ha portato allo sviluppo di biosensori che utillizzano anticorpi anche per il dosaggio delle micotossine [Van der Gaag B, 2003]. 11

12 Essendo molti degli alimenti nei quali vengono ricercate le micotossine matrici solide, è necessario in una fase preliminare dell analisi sia per cromatografia, che di tipo ELISA predisporre un pretrattamento dei campioni durante il quale l Aflatossina viene estratta in fase organica. L'estrazione con acetonitrile o metanolo acquoso, seguito da una pulizia delle soluzioni estratte usando colonne immunoaffini, fornisce risultati sensibili e selettivi per una vasta gamma di alimenti sia umani che animali. La rilevazione condotta mediante TLC o HPLC si basa sulla fluorescenza delle Aflatossine indotta dagli UV, anche se l'aflatossinab1 e l'aflatossina G1 hanno bisogno di essere derivatizzate (modificate nella loro struttura) per aumentare la fluorescenza ad un livello simile a quella della AflatossinaB2 e AflatossinaG2. I limiti di rilevazione con tali metodi risultano generalmente inferiori a 1 µg/kg e possono essere realizzati con una precisione analitica di ±30% per gli alimenti solidi e dell ordine di 0.05 µg /kg per l AflatossinaM1 in latte [Pestka JJ, 1991; TECNOALIMENTI]. 12