Istituto Superiore di Sanità Centro Nazionale per la Qualità degli Alimenti e per i Rischi Alimentari Reparto - OGM e Micotossine
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1 Istituto Superiore di Sanità Centro Nazionale per la Qualità degli Alimenti e per i Rischi Alimentari Reparto - OGM e Micotossine La problematica delle micotossine nella filiera agro-alimentare: stato dell arte e prospettive novembre 2007 Aspetti generali legati all accreditamento delle prove secondo la norma UNI/CEI EN 17025:2005 1
2 SOMMARIO Perché l accreditamento Come l accreditamento Percorso di accreditamento 2
3 PERCHÉ Il riconoscimento della competenza dei laboratori di prova sia preposti al controllo ufficiale dei prodotti alimentari sia impegnati nelle attività di prova ai fini dell autocontrollo dei prodotti alimentari, è un requisito richiesto dalle disposizioni nazionali ed europee in materia di sicurezza alimentare. Lo schema dell accreditamento è stato messo in piedi dall Unione Europea al fine di avere dei riferimenti univoci per permettere la libera circolazione delle merci e prodotti sul territorio comunitario senza necessità di controlli ripetitivi da parte delle autorità dei vari paesi. L Organismo di Accreditamento essendo indipendente e rappresentativo di tutte le parti interessate, garantisce gli utenti nella competenza dei laboratori nella effettuazione delle prove accreditate 3
4 In Italia tale funzione è assolta dal SINAL. Il SINAL contribuisce a ridurre le barriere tecniche che ostacolano il commercio internazionale stipulando accordi di mutuo riconoscimento e/o di reciprocità con gli analoghi organismi di altri Paesi: -stipulando, in ambito EA (European co-operation for Accreditation), un accordo multilaterale di mutuo riconoscimento con gli organismi nazionali di Accreditamento di numerosi Paesi europei ed extraeuropei -siglando, l'accordo internazionale ILAC (International Laboratory Accreditation Cooperation), operativo dal 2001, a cui partecipano gli organismi di accreditamento di oltre 30 paesi di tutto il mondo. 4
5 L operato del SINAL e dei suoi analoghi europei è quello di verificare e sorvegliare nel tempo la conformità dei laboratori rispetto: alla norma ISO IEC (Criteri generali per la competenza dei laboratori ad eseguire prove e/o tarature delle apparecchiature) ai documenti EA (European co-operation for Accreditation) alle prescrizioni aggiuntive che lo steso SINAL elabora (Procedure e Documenti Tecnici o Generali, DT, DG, PT o PG) Il SINAL accerta e vigila sui requisiti tecnici ed organizzativi dei Laboratori di prova
6 PERCHÉ Regolamento (EC) N o 882/2004 del Parlamento Europeo e del Consiglio del 29 Aprile 2004 relativo ai controlli ufficiali intesi a verificare la conformità alla normativa in materia di mangimi e di alimenti e alle norme sulla salute e sul benessere degli animali 6
7 PERCHÉ Regolamento (EC) No 882/2004 (17) I laboratori che partecipano all'analisi di campioni ufficiali dovrebbero operare secondo procedure approvate internazionalmente o a norme di efficienza basate su criteri e usare metodi di analisi che siano stati convalidati nei limiti del possibile. Detti laboratori dovrebbero in particolare disporre di attrezzature che consentano la corretta determinazione di standard quali i livelli massimi di residui fissati dalla normativa comunitaria. 7
8 Regolamento (EC) No 882/2004 Articolo 12 (1, 2, 3)-Laboratori Ufficiali 1 -Le analisi di campioni presi durante il controllo ufficiale sono eseguite da laboratori che sono stati riconosciuti per tale attività dalle autorità competenti 2 -Le autorità competenti, tuttavia, possono designare soltanto i laboratori che operano, sono valutati e accreditati conformemente alle seguenti norme europee: ISO/IEC/17025 (Criteri generali per la competenza dei laboratori ad eseguire prove e/o tarature delle apparecchiature) EN (Criteri generali per la valutazione dei laboratori di prova) EN (Sistema di accreditamento dei laboratori di prova e taratura. Prescrizioni generali per la gestione e il riconoscimento) tenendo conto dei criteri per i diversi metodi di prova stabiliti nella normativa comunitaria in materia di mangimi e di alimenti. 3 -L accreditamento e la valutazione dei laboratori di prova possono riguardare singole prove o gruppi di prove. 8
9 REGOLAMENTO (CE) N. 2076/2005 DELLA COMMISSIONE che fissa disposizioni transitorie per l attuazione dei regolamenti del Parlamento europeo e del Consiglio (CE) n. 853/2004, (CE) n. 854/2004 e (CE) n. 882/2004 e che modifica i regolamenti (CE) n. 853/2004 e (CE) n. 854/2004 (18) A norma dell articolo 12 del regolamento (CE) n. 882/2004, i laboratori che effettuano l analisi dei campioni prelevati durante i controlli ufficiali devono essere accreditati. I laboratori che la precedente normativa comunitaria non sottoponeva all obbligo di accreditamento potrebbero aver bisogno di tempo supplementare per ottenere il pieno accreditamento, in quanto la relativa procedura è complessa e gravosa. È opportuno dare a tali laboratori il tempo di espletare le necessarie formalità. Articolo 18- Accreditamento di laboratori In deroga all articolo 12, paragrafo 2, del regolamento (CE) n. 882/2004, l autorità competente può designare un laboratorio non accreditato, purché quest ultimo: a) dimostri di aver avviato e di stare portando avanti le procedure di accreditamento conformemente al regolamento (CE) n. 882/2004; b) fornisca all autorità competente garanzie soddisfacenti che i sistemi di controllo della qualità per le analisi da esso condotte ai fini dei controlli ufficiali saranno operativi entro il 1 gennaio 2006.
10 Come ISO/IEC 17025: Criteri generali per la competenza dei laboratori ad eseguire prove e/o tarature delle apparecchiature I requisiti per l Accreditamento sono contenuti nella norma UNI CEI EN ISO/IEC e nei documenti del SINAL. 10
11 ISO IEC ISO/IEC 17025: Criteri generali per la competenza dei laboratori ad eseguire prove e/o tarature delle apparecchiature L'ISO ha emesso il 15 dicembre 1999 la nuova norma di riferimento per i laboratori: ISO/IEC 17025, General requirements for the competence of testing and calibration laboratories, che ha sostituito la Guida 25 ISO e la EN come riferimento per l'accreditamento dei laboratori. Particolare enfasi è stata riposta nelle prescrizioni riguardanti: - la validazione dei metodi; - l'incertezza di misura; - l'assicurazione della qualità dei risultati, ISS novembre
12 ISO IEC 17025:2005 Cosa chiede in più la versione del 2005? La consapevolezza del personale nell applicazione del SQ La comunicazione da parte della Direzione dei processi e dell efficacia del SQ Il miglioramento continuo assicurando, in conformità alla ISO/IEC 17025, l efficacia del sistema che dovrà essere dimostrato, valutato e pianificato. La soddisfazione del cliente attraverso il la valutazione della soddisfazione adottando specifiche indagini L analisi dei dati di controllo qualità e la pianificazione delle necessarie attività correttive. 12
13 Il Percorso di accreditamento Molti fattori determinano la correttezza e l affidabilità delle prove, questi includono contributi da Fattori umani (par 5.2) Postazione di lavoro e condizioni ambientali (5.3) Metodi di prova e Validazione (5.4) Apparecchiature (5.5) Riferibilità delle misure (5.6) Campionamento (5.7) Manipolazione dei dispositivi da provare o da tarare (5.8) Questi fattori contribuiscono all incertezza totale delle misure effettuate dal laboratorio (in misura differente da prova a prova; devono essere presi in considerazione e gestiti in modo da garantire le competenze del Laboratorio di prova 13, ISS novembre 2007
14 REQUISITI TECNICI Fattori umani Postazione di lavoro e condizioni ambientali Metodi di prova e Validazione LAB ACCREDITAMENTO METODO di PROVA Apparecchiature Riferibilità Campionamento delle misure Manipolazione dei dispositivi da provare o da tarare 14
15 Fattori umani- PERSONALE Identificazione dei profili/specifiche Informazione e formazione per inserimento Individuazione attività formative Registrazione Attività Valutazione apprendimento ed efficacia Qualifica e mantenimento della qualifica Motivazione del personale Le competenze del personale devono essere evidenziate tramite Elenco prove con indicazione del personale qualificato Registrazione sulle schede del personale delle qualifiche Valutazione dell efficacia, 15
16 Postazione di lavoro e condizioni ambientali Disponibilità di locali e impianti idonei alle leggi vigenti Analisi dei fattori indicati come critici (fattori ambientali che possono influenzare) sulle prove Controllo/ monitoraggio delle condizioni critiche Separazione di settori vicini con attività incompatibile tra loro (cross contamination) L accesso e l utilizzo di aree che hanno influenza sulla qualità delle prove deve essere controllato. 16
17 Metodi di prova e Validazione I metodi ufficiali e normati devono essere disponibili nell ultima edizione Il metodo deve essere QUALIFICATO internamente prima del suo utilizzo I metodi sviluppati dal laboratorio devono essere VALIDATI (ciò vale anche per metodi normalizzati utilizzati fuori dallo scopo e campo di applicazione prefissato e nel caso di estensioni e modifiche) Deve essere definito un indice della stesura dei metodi di prova Le validazioni devono essere documentate (risultati); deve essere redatta una dichiarazione finale circa l idoneità del metodo per l utilizzo previsto CRITERI DI SCELTA DEL METODO PROGETTAZIONE E SVILUPPO DEI METODI INTERNI (stesura) VALIDAZIONE METODI INTERNI E NORMALIZZATI UTILIZZATI AL DI FUORI DELLO SCOPO QUALIFICAZIONE DEI METODI NORMATI CALCOLO INCERTEZZA DI MISURA 17
18 Metodi di prova e Validazione Regolamento (EC) No 882/2004 ALLEGATO III CARATTERIZZAZIONE DEI METODI DI ANALISI 1. I metodi di analisi devono essere caratterizzati dai seguenti criteri: a) esattezza; b) applicabilità (matrice e gamma di concentrazione); c) limite di rilevazione; d) limite di determinazione; e) precisione; f) ripetibilità; g) riproducibilità; h) recupero; i) selettività; j) sensibilità;
19 Apparecchiature Programmazione delle attività di taratura per gli strumenti che hanno un effetto significativo sulle prove (frigoriferi, HPLC) Etichettatura delle apparecchiature in cui deve esserci evidenza dello stato di taratura Procedure per l utilizzo e manipolazione degli strumenti Le apparecchiature e sistemi di misura, prima di essere messe in servizio devono essere collaudate per verificarne la capacità tecnica di soddisfare I requisiti specificati nel capitolato di acquisto TIPOLOGIE ED ELENCHI ID APPARECCHIATURE ISTRUZIONI D USO PROGRAMMI DI MANUTENZIONE E TARATURA REGISTRAZIONE MALFUNZIONAMENTI ROTTURE FUORI TARATURA COLLAUDO E QUALIFICAZIONE DELLA APPARECCHIATURE 19
20 Riferibilità delle misure Le apparecchiature e gli strumenti per l esecuzione delle prove devono essere tarati prima della loro messa in servizio e ad intervalli regolari nel corso del periodo di utilizzo Programmazione di taratura che assicuri la riferibilità delle misure a unità del SI Le tarature ESTERNE devono essere a carico di centri esterni che possono essere o istituti metrologici primari o essere centri secondari (lab di taratura accreditati SIT). Questi centri devono rilasciare certificati con attestazione delle incertezze di taratura associate all oggetto della taratura Le tarature delle apparecchiature o dei sistemi di misura devono essere effettuate utilizzando materiali o campioni di riferimento certificati da organismi nazionali E7o internazinali riconosciuti allo scopo (SI) [pesi cert da centro SIT; materiali di riferimento certificati; termometri certificati da centro SIT] 20
21 Campionamento Il laboratorio deve dotarsi di piani e procedure di CAMPIONAMENTO qualora questo rientri fra le sue attività e responsabilità I dati e le operazioni relativi ai campionamenti devono essere registrati Il Campionamento deve essere eseguito in conformità a normative o con procedure definite internamente al laboratorio, purchè siano garantite: Rappresentatività dl campione La sufficiente quantità del campione Strumentazione utilizzata per il campionamento PIANI DI CAMPIONAMENTO MODALITÀ (ISTRUZIONI) DI CAMPIONAMENTO CONTROLLO FASI DI TRASPORTO, MOVIMENTAZIONE E CONSERVAZIONE AL DI FUORI DEL LABORATORIO REGISTRAZIONI ATTIVITÀ, ISS novembre
22 Manipolazione dei dispositivi da provare o da tarare Procedure per il trasporto, ricezione, manipolazione, protezione, immagazzinamento, conservazione ed eliminazione dei campioni Sistema di identificazione univoca del campione Monitoraggio, controllo e registrazione delle condizioni di conservazione del campione Registrazione anomalie o scostamenti rispetto alle condizioni specificate Verifica della quantità di materiale Integrità della confezione e metodo di conservazione Procedura con le modalità di smaltimento del campione secondo i criteri di sicurezza previsti dalla normativa GESTIONE DEL CAMPIONE DA PROVARE CONTROLLO DEL RICEVIMENTO IDENTIFICAZIONE DEL CAMPIONE DATI GREZZI 22
23 REQUISITI TECNICI Validazione ESATTEZZA Assicurazione della qualità dei risultati di prova e taratura PRECISIONE Campione RAPPORT O DI PROVA Sistema di qualità Presentazione dei risultati Archiviazione del campione 23
24 Validazione Conferma, sostenuta da evidenze oggettive, che i requisiti relativi ad una specifica utilizzazione o applicazione prevista sono stati soddisfatti. (UNI EN ISO 9000:2000). uso di materiali di riferimento certificati confronto con altri metodi confronti interlaboratorio verifica dei contributi all incertezza di misura, etc. È richiesto il riesame periodico della validazione dei metodi. Il Responsabile deve firmare la dichiarazione circa l idoneità del metodo per lo scopo previsto. 24
25 Validazione Durante la progettazione della validazione di un metodo, dovranno essere definiti: i criteri di accettabilità della validazione: limite di ripetibilità, compatibilità dei risultati ottenuti con quelli riportati nel certificato di un materiale di riferimento (ESATTEZZA) compatibilità con i criteri di accettabilità dell organizzatore di un circuito interlaboratorio (CONTROLLO QUALITÀ) compatibilità con risultati di un metodo di riferimento i parametri del metodo da determinare (es. ripetibilità, recupero, incertezza); il livello/livelli di validazione cominciando dal livello del tenore massimo definito dal REGOLAMENTO (CE) N. 1881/
26 Validazione Per le micotossine alcuni criteri sono suggeriti dal REGOLAMENTO (CE) N. 401/2006 relativo ai metodi di campionamento e di analisi per il controllo ufficiale dei tenori di micotossine nei prodotti alimentari Prescrizioni specifiche Criteri di rendimento per RECUPERO, PRECISIONE (RDS R RDS r ) differenziati per intervalli di contaminazione a) Criteri di rendimento per le aflatossine b) Criteri di rendimento per l ocratossina A c) Criteri di rendimento per la patulina d) Criteri di rendimento per il desossinivalenolo e) Criteri di rendimento per lo zearalenone f) Criteri di rendimento per le fumonisine B1 e B2 g) Criteri di rendimento per le tossine T-2 e HT Criterio dell idoneità allo scopo per Uf (l incertezza massima standard, μg/kg), ISS novembre
27 Validazione a) esattezza; b) applicabilità (matrice e intervallo di concentrazione di concentrazione); c) limite di rilevazione; d) limite di determinazione; e) precisione: ripetibilità intralaboratorio (nell ambito di un laboratorio), riproducibilità intralaboratorio (in un laboratorio e tra laboratori) risultante da dati provenienti da prove condotte in collaborazione e, laddove siano stati stabiliti criteri di rendimento per i metodi analitici, prove di conformità ai criteri piuttosto che considerazioni sull incertezza delle misurazioni; f) recupero; g) linearità; h) incertezza 27
28 Validazione Contenuto dei metodi interni identificazione appropriata del metodo; scopo; descrizione del materiale da provare; parametri, grandezze e campi di misura da determinare; attrezzature e apparecchiature, compresi i requisiti tecnici di prestazione; campioni di riferimento e materiali di riferimento richiesti; condizioni ambientali e periodo di stabilizzazione richiesto; descrizione della procedura, comprendente: manipolazione, trasporto, immagazzinamento e preparazione del campione; verifiche da effettuare prima di iniziare le attività: verifiche del buon funzionamento dell'apparecchiatura e, se richiesto, taratura e messa a punto prima dell'utilizzo; metodi di registrazione delle osservazioni e dei risultati;tutte le misure di sicurezza da osservare; criteri e/o requisiti per l'approvazione / rifiuto; dati da registrare e i metodi di analisi e di presentazione;, ISS novembre 2007 incertezza o le procedure di stima dell'incertezza. 28
29 Esattezza Grado di concordanza tra il valore medio di una serie di risultati ed il valore di riferimento accettato (ISO ) Nel caso della validazione all interno del laboratorio per la determinazione dell esattezza possono essere utilizzati metodi alternativi: uso di materiali di riferimento; con preferenza data all uso di materiali di riferimento certificati (CRM), su cui si effettuano un numero significativo di prove (almeno 10) e dai risultati ottenuti viene calcolato il valore medio e lo scarto tipo che vengono confrontati con i rispettivi valori dell analita nel materiale di riferimento. Da tale confronto viene calcolata l esattezza in termini di errore percentuale secondo la formula: Errore percentuale %= Valoreosservato Valoreteorico Valore teorico uso di campioni addizionati (aggiunte/recuperi). Quando non siano disponibili CEM, una verifica dell esattezza del metodo può essere eseguita ricorrendo al metodo delle aggiunte di quantità note di analita a bianchi matrice o in assenza a campioni positivi, procedendo successivamente al calcolo dei recuperi. È necessario che grande attenzione sia posta ll omogeneità della matrice e all accuratezza con cui vengono svolte le operazioni di aggiunta dell analita c Re c% oss c c spk bianco
30 Precisione Grado di concordanza tra i risultati di misurazioni indipendenti dello stesso misurando, condotte sotto condizioni definite, applicando lo stesso metodo. Comprende i concetti di ripetibilità, cioè il grado di concordanza tra i risultati ottenuti con lo stesso metodo, sugli stessi campioni, nello stesso laboratorio, dallo stesso operatore, usando la stessa apparecchiatura entro brevi intervalli di tempo e riproducibilità, cioè il grado di concordanza tra i risultati ottenuti con lo stesso metodo sugli stessi campioni, in laboratori diversi, da operatori diversi, e diverse apparecchiature. (ISO ) (ISO ). La ripetibilità intermedia esprime la variabilità all interno del laboratorio: giorni differenti, analisti differenti, apparecchiature differenti, ecc. (The fitness for purpose of analytical methods, EURACHEM).
31 Precisione Nel caso della validazione tramite studi collaborativi la precisione è valutata in termini di riproducibilità (R) e di ripetibilità (r) all interno del circuito. Nel caso invece della validazione all interno del laboratorio viene determinata la ripetibilità (r) del metodo sui campioni normalmente analizzati. In questo caso l uso di materiali di riferimento è sconsigliabile in quanto hanno solitamente un grado di omogeneità superiore a quello dei campioni in analisi e ciò potrebbe portare ad una sovrastima della precisione. Per la valutazione della ripetibilità vengono innanzitutto individuati i livelli di concentrazione a cui essa va determinata (è possibile estrapolare il valore sino ad un massimo del 20%, consigliabile 10%). Per ciascuno livello viene effettuato un numero significativo di analisi replicate dello stesso campione. L analisi statistica: n S r i 1 x x i n 1 Il calcolo della ripetibilità si basa sulla formula seguente: r t sr n 2 2 xi = valore delle singole analisi xm = valore medio n = numero di analisi generalmente 2,8 sr dove t = t del test di Student per n repliche Il valore di ripetibilità viene utilizzato per la verifica delle prove in doppio: X 1 X 2 r dove X1 e X2 sono i 2 risultati e r è la ripetibilità dichiarata dal metodo o calcolata
32 Assicurazione della qualità dei risultati di prova e taratura Procedure per monitorare la validità della prova Gestione dei dati per verificare le linee di tendenza (TREND) Metodiche di assicurazione di qualità più comuni: Partecipazione a circuiti interlaboratorio Per le prove accreditate o in accreditamento Per prove mai eseguite prima Registrazione delle Carte di Controllo degli esiti delle partecipazioni (in termini di z score) Inserimento nel flusso dei campioni di materiali a caratteristiche note Verifiche intermedie, tramite valutazione dell andamento della prova su dati grezzi Statistica delle non conformità UTILIZZO DI CAMPIONI CERTIFICATI CIRCUITI INTERLABORATORIO UTILIZZO CAMPIONI CIVETTA CARTE DI CONTROLLO 32
33 Carte di Controllo Per l elaborazione di carte di controllo, si utilizza il tipo Shewart (riferimento: ISO 8258:1991, Shewart control charts ) dove i limiti di accettabilità vengono stabiliti sulla base dello scarto tipo dei dati moltiplicato per un fattore di copertura: 3 e 2, rispettivamente per i limiti di controllo e di attenzione; il limite di controllo costituisce un limite da non superare, il limite di attenzione è un limite che deve far scattare le indagini per prevenire un eventuale non conformità. Per l interpretazione dei punti, si possono utilizzare test che forniscono i criteri che possono essere seguiti nella valutazione dell andamento dei dati: Run test: osservando una serie di valori in una carta di controllo, la probabilità che 8 punti successivi cadano tutti dalla stessa parte rispetto alla linea centrale, è talmente bassa (meno dell 1%) da far sospettare che vi sia un reale spostamento del processo, anche se nessun punto cade fuori dei limiti di controllo; Regole di Westergard: per la valutazione dei fuori controllo : -2s: regola di attenzione, nei casi in cui i dati cadono fuori dell intervallo U ± 2s, -3s: la serie viene rifiutata quando una misura di controllo cade fuori dell intervallo U ± 3s, -2s: la serie viene rifiutata quando 2 misure di controllo successive cadono fuori dell intervallo U ± 2s, -4s: la serie viene rifiutata quando la differenza tra due misure di controllo successive supera il valore di 4s, -1s: la serie viene rifiutata quando 4 misure di controllo successive cadono fuori dello stesso limite, + 1s o - 1s, 10xm: la serie viene rifiutata quando 10 misure di controllo successive cadono dalla stessa parte del valore medio.
34 Presentazione dei risultati I risultati delle prove devono essere riportati su un Rapporto di Prova Il rapporto di prova deve contenere informazioni sul recupero e sull incertezza di misura. L incertezza di misura deve essere corredata delle seguenti informazioni: deve tener conto del numero delle ripetizioni eseguite nella routine deve essere indicata nelle stesse unità di misura del risultato della prova (non sempre è quindi valida la %) deve essere indicato il fattore di copertura (k) I metodi devono essere indicati come sigla, anno di edizione e, per i metodi interni, indice di revisione 34
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