ALTERAZIONI DEL DIFFERENZIAMENTO SESSUALE:VIE METABOLICHE E GENETICHE. CASI CLINICI PARADIGMATICI

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1 UNIVERSITA DEGLI STUDI La Sapienza di Roma FACOLTA DI MEDICINA E CHIRURGIA I Dipartimento di Pediatria UOC Terapia Intensiva Neonatale UOC Pediatria d Urgenza e Terapia Intensiva Pediatrica Master Universitario di II livello in Terapia Intensiva Neonatale e Pediatrica ALTERAZIONI DEL DIFFERENZIAMENTO SESSUALE:VIE METABOLICHE E GENETICHE. CASI CLINICI PARADIGMATICI Relatore: Chiar.mo Prof. Corrado MORETTI Candidato Dott.ssa Maria Gabriella BURATTINI

2 La determinazione sessuale, che dipende dall assetto cromosomico dell embrione, viene stabilito da molteplici eventi molecolari che dirigono lo sviluppo delle cellule germinali, la loro migrazione verso la plica urogenitale e la formazione di testicoli (in presenza del cromosoma Y) o di ovaie (in presenza del cromosomaxx) La determinazione sessuale pone le basi per la differenziazione sessuale e per la risposta sesso-specifica dei tessuti agli ormoni prodotti dalle gonadi che si sono differenziate. Sono stati scoperti numerosi geni che contribuiscono sia al processo precoce della determinazione e differenziazione sessuale sia al processo tardivo.

3 Un po di storia I cromosomi sessuali dei mammiferi si sono evoluti da una coppia di OMOLOGHI ANCESTRALI MONOMORFI per riduzione progressiva di uno degli omologhi che avrebbe poi dato origine al CROMOSOMA Y Molti dei geni inizialmente presenti sul cromosoma Y sono stati trasferiti sul cromosoma X durante il processo evolutivo che ha reso eteromorfa la coppia dei cromosomi sessuali

4 DETERMINAZIONE DEL SESSO MASCHILE indispensabile Gene SRY (Sex Determining Region del braccio corto cromosoma Y) L espressione di SRY deve raggiungere un determinato livello soglia in un periodo di tempo ben definito, nei precursori delle cellule di sostegno, altrimenti in tali cellule si avvia la formazione delle ovaie. X Y SRY (TDF) X X TESTICOLO la sua assenza determina la differenziazione in senso femminile OVAIO

5 SRY: meccanismo d azione Sry codifica per una proteina che presenta un dominio di legame con il DNA di circa 70 amminoacidi. Questo legame è caratteristico delle proteine High Mobility Group e perciò chiamato HMG box. Si pensa che la proteina si leghi alle regioni regolatorie di altri geni che intervengono nel differenziamento delle gonadi, a valle di Sry, e nei confronti dei quali Sry svolgerebbe dunque la funzione di regolatore trascrizionale.

6 GENI DELLA DIFFERENZIAZIONE SESSUALE A valle della cascata enzimatica guidata da SRY esistono altri fattori quali SOX 9, SOX 8, DAX1, FGF9 importanti nella differenziazione e nella funzione delle cellule del Sertoli. Sox 9 agisce precocemente nella via di determinazione del sesso in senso maschile. Altri geni sono stati individuati sul cromosoma Y che controllano aspetti diversi dello sviluppo sessuale: AZF(azoospermia factor) GCY(growth control Y) GBY (gonadoblastoma) maturazione testicolare e spermatogenesi crescita staturale non mediata da ormoni oncogene nella disgenesia gonadica

7 in letteratura La HMG box di Sry è altamente conservata in tutti i mammiferi in cui è stata sequenziata. Sono state descritte molte mutazioni della HMG box della proteina SRY umana, in femmine XY (reversione del sesso). Nessun polimorfismo è stato trovato nel dominio HMG di maschi normali. La sequenza della HMG box, quindi, è determinante per lo sviluppo del sesso maschile, in quanto ogni sua variazione produce alterazioni della proteina le quali, inficiandone la funzione, risultano in reversione del sesso.

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9 GONADE BIPOTENTE (compare intorno alla V settimana) TESTICOLO OVAIO CELLULE GERMINATIVE (sacco vitellino creste) spermatogoni oociti CELLULE MESENCHIMALI cell. Leydig cell. Teca e stroma CELLULE MESODERMICHE cell. Sertoli cell. Granulosa

10 Stadio bipotenziale Alla sesta settimana gli organi riproduttivi hanno la potenzialità di svilupparsi in strutture maschili o femminili La proteina SRY indirizza la gonade a trasformarsi nei testicoli che producono testesterone e MIFche provoca la degenerazione del dotto di Muller L assenza di MIFpermette alla gonade di trasformarsi nelle strutture femminili. Il dotto di Wollf degenera

11 Nel maschio

12 Cresta genitale WT1 SF1 WT1 SF1 Gonade bipotenziale MASCHIO FEMMINA SRY SOX9 FOXL2 SRY SOX9 DAX1 WNT4 Testicolo Ovaio INSL3/LGR8 Discesa nello scroto Nelle femmine non vi sono geni e fattori essenziali per la differenziazione del fenotipo F durante lo sviluppo fetale e prepuberale. La iperespressione di alcuni geni, quale DAX1 e WNT4, ha un effetto anti-testicolare sopprimendo l effetto di SRY e SOX9 e determinando lo sviluppo di una femmina XY sexreversal.

13 DIFFERENZIAZIONE SECONDARIA MIF T Dotti di Muller: tube utero III sup. vagina Dotti di Wolff: vasi deferenti epididimo vescicole seminali

14 Classificazione delle ambiguità sessuali Disturbi della differenziazione genitale Pseudoermafroditismo maschile Errori congeniti della biosintesi del testosterone Deficit 5-α-reduttasi Resistenza periferica agli androgeni Pseudoermafroditismo femminile Iperplasia surrenalica congenita Assunzione o produzione materna (tumori) ormoni a eff.virilizzante

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16 IERI Intersessualita DSD OGGI Pseudoermafroditismo maschile Ridotta virilizzazione e mascolinizzazione del maschio XY Pseudoermafroditismo femminile Eccessiva virilizzazione e mascolinizzazione della femmina XX 46, XY DSD 46, XX DSD Ermafroditismo vero Maschio XX o XX sex reversal DSD ovotesticolare DSD testicolare 46,XX Femmine XY sex reversal Disgenesia gonadica completa 46,XY

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18 DSD dei Cromosomi sessuali 46,XY DSD 46,XX DSD 45,X(sindrome di Turner e varianti) Disordini nello sviluppo del testicolo: (1) disgenesia gonadica completa (sindrome di Swyer); (2) disgenesia gonadica parziale; (3) regressione gonadale; (4) DSD ovotestis Disordini nello sviluppo dell ovaio: (1)DSD ovotestis; (2)DSD testicolare(es.sry+,duplicazioni di SOX9); (3)disgenesia gonadica. 47,XXY (sindrome di Klinefelter e varianti) 45,X/46,XY (MGD, DSD ovotestis) Disordini nella sintesi o nell azione degli androgeni: (1) Difetti nella sintesi degli androgeni (es. 17-OH steroido deidrogenasi, 5αRD2, mutazioni StAR); (2) (2) Difetti nell azione degli androgeni (es. CAIS, PAIS); (3) Difetti del recettore dell ormone luteinizzante (es. ipoplasia-aplasia delle cellule di Leydig); (1) (4) Disordini dell ormone antimuleriano e del recettore antimuleriano (sindrome da persistenza dei dotti di Müller) Eccesso di androgeni: (1) fetali (es deficit di 21- idrossilasi; (2) fetoplacentari (deficit di aromatasi,por[p450 ossidoreduttasi])e (3) materni (luteoma, farmaci ecc.) Altri (es.estrofia della cloaca,atrofia vaginale,murcs[anomalie dei dotti di Muller,dei reni,delle vertebre cervicotoraciche],altre sindromi.

19 46, XY DSD DIFETTO SINTESI TESTOSTERONE INSENSIBILITA PERIFERICA AGLI ANDROGENI DEFICIT 5aR

20 46, XX DSD IPERPLASIA SURRENALICA CONGENITA FARMACI VIRILIZZANTI ASSUNTI DALLA MADRE (medrossiprogesterone, danazolo) TUMORI VIRILIZZANTI MATERNI O FETALI (tumori ovarici, surrenalici)

21 DSD 46,XX da eccesso di androgeni L esposizione in utero agli androgeni determina dopo la 12a settimana di gestazione esclusivamente ipertrofia clitoridea nelle fasi più precoci della differenziazione persistenza del seno urogenitale e fusione labioscrotale se sufficientemente precoce, la fusione delle labbra permette la formazione di uretra peniena Grumbach MM & Conte FA 1992

22 46, XX DSD Genitali Interni Femminili Genitali Esterni: - Clitoromegalia isolata - Completa fusione labioscrotale 46, XY DSD QUADRI CLINICI Genitali Interni Maschili Genitali Esterni: -Aspetto completamente femminile (Sindrome Morris o Femminilizzazione Testicolare Completa) - Ipospadia

23 LA CLINICA Amoebas at start were not complex: they tore themselves and started sex (Arthur Guiterman)

24 DIAGNOSI Anamnesi familiare Esame obiettivo Esami di laboratorio e strumentali: - cariotipo - elettroliti - dosaggi ormonali: 17-OHP, T, DHT,DHEA- S,Androstenedione, ACTH - ecopelvi - genitografia o laparoscopia

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26 colesterolo 1 Δ 4 progesterone 11 desossicorticosterone DOC corticosterone (composto B) 18 idrossicorticosterone aldosterone Δ 5 pregnenolone 3 17-OH pregnenolone 2 17-OH progesterone 4 11 desossicotisolo (composto S) cortisolo DHEA Δ 4 androste 5 10 nedione testosterone DHEA-S estrone 17-β estradiolo 1: 20,22 desmolasi 2: 3-β ol-deidrogenasi tutti 3: 17-α idrossilasi (gene unico codifica enzima anche con attività n. 5: pazienti con uno od entrambi i difetti) glicocorticoidi e sessuali 4: 21 idrossilasi 6: 11- β idrossilasi glico-mineralcorticoidi 7: 18 idrossilasi 8: 18 deidrogenasi mineralcorticoidi 5: 17,20 desmolasi 9: 17-βOH steroido-deidrogenasi sessuali 10: aromatasi

27 SINTOMATOLOGIA delle DIFFERENTI FORME di DEFICIT ENZIMI SURRENALI 20, 22 desmolasi 3-β idrossisteroidodeidrogenasi 17-α idrossilasi 21 idrossilasi Blocco sintesi glico-mineralcorticoidi (accumulo 17-α OHP) M: genitali esterni normali F: virilizzazione genitali esterni di vario grado Entrambi i sessi: possibile perdita di sali dopo il 4-5 g di vita a sintomatologia variabile possibile ipertensione 11-β idrossilasi desmolasi 17-β OHsteroido-deidrogenasi i

28 DEFICIT 21 IDROSSILASI alla nascita nel sesso femminile: ambiguità genitali esterni di grado variabile fino all aspetto di maschio con anorchia Esame strumentale consigliato: ecografia pelvica nel sesso maschile: assenza di sintomi in entrambi i sessi (potenzialmente letale): oltre ai sintomi su descritti vomito e dimagramento tardivi (a partire dal 5-6 giorno di vita)

29 DIAGNOSI GENETICA CYP21: gene funzionale CYP21P: pseudogene SEDE: cromosoma 6p21.3

30 DIAGNOSI GENETICA LOCUS CYP21 (6p21.3) CYP21 CYP21: gene funzionale CYP21P: pseudogene CYP21P CYP21 CYP21P Gene e pseudogene, entrambi di 10 esoni, presentano una sequenza nucleotidica omologa al 98% per la parte esonica e al 96% per la parte intronica.

31 - NORMALE ACTH + + CORTISOLO - + PREANDROGENI + ACTH + DEFICIT 21-OH - CORTISOLO

32 Rare Deficit 11 beta idrossilasi Deficit 3 beta idrossisteroido deidrogenasi 5 alfa reduttasi

33 T 5 α REDUTTASI DHT Pene Scroto Uretra TUBERCOLO GENITALE PLICHE LABIO SCROTALI PLICA URETRALE Clitoride Grandi labbra Piccole labbra FENOTIPO MASCHILE FENOTIPO FEMMINILE

34 CASI CLINICI Amoebas at start were not complex: they tore themselves and started sex (Arthur Guiterman)

35 NAOMI EG: 38 settimane, SGA TC per diagnosi prenatale (24 a sett.) di malformazione cardiaca e dilatazione borderline IV ventricolo Anamnesi OSTETRICA: - Infezione materna da toxoplasma nel I trimestre - Cariotipo materno: 46 XX t (2;9) (p13; p13) - Cariotipo fetale (LA): 46 XY, -9, +der (9) t(2;9) (p13; p13) APGAR 5-7: ventilazione con AMBU

36 Esame obiettivo: cianosi tachipnea soffio 3/VI FENOTIPO FEMMINILE STIGMATE DISMORFICHE (impianto basso delle orecchie, clinodattilia V ) Necessità di intubazione e somministrazione di Surfattante dopo 2 ore dalla nascita

37 ESAMI DI LABORATORIO CARIOTIPO 46 XY, -9, +der (9) t(2;9) (p13; p13) TESTOSTERONE 66.4 ng/dl (v.n. O<20 O ) Androstenedione nella norma DHEA nella norma 17-OH-P nella norma hcg test: NON INCREMENTO DEI LIVELLI DI T E DHT Studio SRY e cromosoma 9 +

38 IPOTESI DIAGNOSTICHE Fenotipo genitale femminile con derivati mulleriani presenti MUTAZIONE GENE SRY MUTAZIONI DI GENI COINVOLTI NELLA DIFFERENZIAZIONE TESTICOLARE SU CROMOSOMA 9? DELEZIONE 9p24 regola lo sviluppo del testicolo? DELEZIONE 10q26-q ter reversione sessuale?

39 DESCRIZIONE DI MASCHI XX, FEMMINE XY ED ERMAFRODITI IN LETTERATURA Non riferiti ad alterazioni del cromosoma 9 Berger et al, 1970 Kasdan et al, 1973 Skordis et al, 1987 De la Chapelle et al, 1987 Kuhnle et al, 1993 Riferiti ad alterazioni del cromosoma 9 Affara et al, 1989 Hoo et al, 1989 Bennet et al, 1993 Ion et al, 1998 Fleiter et al, 1998 Guioli et al, 1998 Veiol et al, 1998

40 Alessandro M.A. nato a termine, da parto eutocico, alla nascita presentava ipotonia generalizzata e rime palbebrali lievemente rivolte verso l alto: sospettata sindrome di Down. All esame obiettivo, i genitali esterni venivano descritti come maschili normali. Gli esami strumentali (Ecorenale ed Ecoencefalo) sono risultati nella norma. E stato quindi eseguito un cariotipo di tipo femminile: 46,XX. E stato ricontrollato il corredo cromosomico e confermata la presenza di un cariotipo femminile normale. E stata eseguita quindi la ricerca di sequenze Y specifiche: gene AMEL ed amplificazione SRY

41 Amplificazione di AMEL e SRY AMEL SRY XY XX 556/07 M XY 556/07 M Analisi delle microdelezioni del cromosoma Y.. Yp Yq ZFY SRY sy254 sy86 sy127 Yp Yq ZFY SRY sy84 sy134 sy255 XX XY 556/07 XX= femmina controllo XY= maschio controllo

42 FISH con sonda specifica di SRY (segnale rosso) che evidenzia il trasferimento del gene sull'estremità distale del braccio corto di un cromosoma X.

43 Lucia E. L. nata a termine da parto cesareo, presentava alla nascita: genitali esterni ambigui ed atresia anale, dismorfismi facciali Esami strumentali: Eco encefalo, reni e cuore nella norma, RMN non capace d individuare a livello perineale i meati di uretra, vagina e canale anale Intervento chirurgico: meato comune urinario-digestivo Cariotipo femminile normale Analisi molecolare del DNA negativa per geni cromosoma Y Sospetto clinico di SAG (virilizzazione genitali esterni) dosaggio 17 OH-progesterone

44 Esami di laboratorio Dosaggio 17OH-progesterone elevato Altri ormoni surrenalici nella norma Ricerca gene CYP 21 (specifico SAG): NEGATIVA + Drop-out CASO non risolto

45 PUNTI OSCURI Rimangono ancora oggi senza una spiegazione a livello molecolare la maggior parte dei casi di inversione del sesso XY, di inversione XX SRY negativa e di ermafroditismo. E necessario identificare nuovi geni o mutazioni fuori delle regioni codificanti, dei geni conosciuti. I progressi di questi ultimi anni lasciano solo intravedere la complessità dello sviluppo dell apparato riproduttivo. La comprensione del meccanismo d azione dei geni che governano il differenziamento e lo sviluppo embrionale resta forse la sfida più affascinante della genetica molecolare.

46 Prospettive future La sfida è trovare: i membri specifici di ogni famiglia che sono unici per ogni sistema particolare i geni target tessutali specifici che sono regolati tramite questa rete comune

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48 GRAZIE PER L ATTENZIONE