UNIVERSITA CATTOLICA DEL SACRO CUORE Facoltà di Medicina e Chirurgia A. Gemelli Roma Scuola di Specializzazione in Ortognatodonzia

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1 UNIVERSITA CATTOLICA DEL SACRO CUORE Facoltà di Medicina e Chirurgia A. Gemelli Roma Scuola di Specializzazione in Ortognatodonzia Direttore: Chiar.ma Prof.ssa Cristina Grippaudo TESI DI SPECIALIZZAZIONE VALUTAZIONI CLINICHE E GENETICHE NELLA DIAGNOSI DEL FALLIMENTO PRIMARIO DI ERUZIONE (PFE) RELATORE: Chiar.ma Prof.ssa Cristina Grippaudo SPECIALIZZANDO: Dott.ssa Isabella D Apolito CORRELATORE Dott.ssa Concetta Cafiero Anno Accademico 2014/2015 1

2 Ai miei genitori, a mia sorella Gabriella che mi hanno sostenuto in questo cammino 2

3 Indice: Introduzione 1. La permuta e le sue caratteristiche 5 2. L'eruzione dentale.9 3. Embriologia dei tessuti dentari Eziologia delle anomalie di eruzione Il fallimento primario di eruzione (PFE) Correlazione genotipo-fenotipo Gene candidato Scopo della tesi Materiali e metodi Risultati Discussione Conclusione.50 Ringraziamenti..51 Bibliografia 52 3

4 Introduzione Il nostro studio ha l'obiettivo di comprendere le basi biologiche delle alterazioni dell'eruzione dentale riscontrate nella pratica clinica ortodontica, introducendo un nuovo paradigma nella diagnosi: quello di personalized medicine. Attraverso un approccio medico personalizzato è possibile effettuare un trattamento individualizzato integrando le conoscenze della biologia molecolare con la diagnosi clinica per un ottimale management terapeutico del paziente. Le informazioni acquisite dall'esame genetico sono state indirizzate a individuare anomalie dell'eruzione correlate a mutazione del Gene PTH1R che è responsabile, secondo quanto riportato in ampia letteratura, di un quadro clinico chiamato Fallimento Primario di Eruzione (Primary Failure of Eruption, PFE). In questo modo si è aperta la strada a un nuovo approccio per la diagnosi ortodontica che permetterà di integrare le informazioni rilevate attraverso un attento esame clinico del paziente, con le conoscenze acquisite attraverso la diagnosi genetica. 4

5 CAPITOLO 1 La permuta e le sue caratteristiche Lo sviluppo dell occlusione umana è un processo complesso costituito da fasi evolutive quali dentizioni e dentature. La dentizione è un processo dinamico caratterizzato dalla permuta degli elementi dentari decidui e dalla successiva eruzione degli elementi dentari permanenti. Le dentature si distinguono in decidua e permanente. Nel corso dello sviluppo occlusale distinguiamo una: Dentatura decidua: dai 6 mesi ai 6 anni; Dentizione mista: dai 6 ai 12 anni; Dentatura permanente: dai 12 anni in poi La dentatura decidua si sviluppa tra i 6 e i 36 mesi di vita e si accompagna a una fase di intensa crescita di tutte le componenti del complesso maxillofacciale. Gli elementi dentari che compaiono in arcata in questa fase dello sviluppo sono: incisivi centrali inferiori (6 mesi), incisivi centrali superiori (10 mesi), laterali superiori (11 mesi), laterali inferiori (13 mesi), primi molari (16 mesi), canini (20 mesi), secondi molari inferiori (27 mesi), secondi molari superiori (29 mesi). 1 La dentizione mista è caratterizzata dalla presenza di elementi sia della serie decidua che di quella permanente. Il concetto di dentizione mista è quindi legato al processo di permuta nella quale distinguiamo tre fasi: Prima fase di permuta (6-8 anni): fase che prevede l esfoliazione degli incisivi decidui e l eruzione dei primi molari, incisivi centrali e laterali permanenti; Periodo intertransizionale (8-10 anni): fase in cui si riscontra la presenza di incisivi e primi molari permanenti, canini e molari decidui; Seconda fase di permuta (10-12 anni): periodo che prevede l esfoliazione di canini e molari decidui, e l eruzione di canini, primi premolari, secondi premolari e secondi molari permanenti. 1 Soltanto dopo l eruzione del secondo molare permanente si può parlare di dentatura permanente, dentatura che raggiungerà il numero di 32 elementi dopo i 18 anni, in seguito all eruzione del terzo molare (quando presente). 5

6 I fattori coinvolti nella permuta dentale sono numerosi: ciascuno ha una specifica finalità nel processo d eruzione e, di conseguenza, un possibile ruolo nello sviluppo di disturbi ad essa correlati. Tali fattori sono: 1) La regione apicale, 2) La dimensione dei denti decidui e permanenti, 3) Le riserve di spazio, 4) La fase pre-eruttiva e la rizalisi dei decidui, 5) La fase eruttiva e il contatto occlusale. 1) La regione apicale. Il concetto di regione apicale è stato introdotto da Van der Linden 2 negli anni 70 in seguito a studi condotti su crani umani. La definizione di regione apicale è la porzione di osso alveolare che nelle diverse fasi dello sviluppo dentario è occupata da radici e corone di elementi decidui e permanenti. In dentatura decidua, comprende le radici dei denti decidui e le gemme dei permanenti; in dentizione mista è occupata dalle radici di tutti gli elementi dentari ad eccezione di quelli che devono ancora erompere; in dentatura permanente comprende gli apici formati di tutti i denti della serie permanente. Le regioni apicali sono distinte topograficamente in anteriore, media e posteriore limitate rispettivamente l anteriore dalle superfici coronali, radicolari o apicali mesiali ai canini (in base allo stadio della dentizione), la media dalle regioni apicali anteriori e posteriormente dalle superfici coronali, radicolari o apicali mesiali dei primi molari permanenti e la posteriore situata distalmente alle regioni apicali medie. La regione apicale è classificata in base alla dimensione in larga, media e stretta in funzione alla capacità di alloggiamento degli elementi della serie permanente. La crescita della regione apicale differisce in base alla sede considerata: la regione apicale anteriore del mascellare superiore aumenta di dimensioni grazie alla presenza della sutura palatina mediana e della sutura incisivocanina mentre la regione apicale anteriore inferiore interrompe il proprio accrescimento all età di quattro anni per la presenza della sinfisi mandibolare. Le regioni apicali mediane non modificano le proprie dimensioni, non avendo capacità di crescita interstiziale. Infine le regioni apicali posteriori sia del mascellare che della mandibola si modificano in 6

7 seguito a processi di rimodellamento osseo, caratterizzato da riassorbimento ed apposizione a livello della tuberosità nel mascellare e da apposizione nella zona del condilo e sul versante posteriore del ramo e riassorbimento sul versante anteriore del ramo mandibolare nella mandibola. 2 2) La dimensione dei denti decidui e permanenti La differenza di dimensioni 3 tra denti decidui e permanenti consente il corretto alloggiamento degli elementi dentari in arcata. Non tutti i denti della serie decidua hanno dimensioni inferiori rispetto ai denti permanenti: infatti gli incisivi e i canini decidui presentano dimensioni mesio-distali rispettivamente pari al 75% e all 85% degli elementi corrispondenti della serie permanente; al contrario, il primo molare deciduo superiore ha dimensioni uguali al primo premolare, mentre il secondo molare deciduo superiore è pari al 133% del premolare da cui sarà sostituito. Nell arcata inferiore il primo molare deciduo ha una dimensione mesio-distale pari al 115% di quella del permanente, mentre il secondo molare deciduo pari al 138%. Tale differenza dimensionale tra i molari decidui e i premolari permanenti costituisce una riserva di spazio detta leeway space. Il valore dimensionale di questa riserva di spazio è pari a 0.9 mm per emiarcata superiore, 1.7 mm per emiarcata inferiore: questo spazio è utilizzato dai primi molari permanenti inferiori per scivolare mesialmente in misura maggiore rispetto ai primi molari permanenti superiori con l'obiettivo di ottenere un rapporto molare di Classe I. 4 3) Le riserve di spazio Le riserve di spazio permettono ai denti permanenti di sostituirsi ai denti decidui che li precedono realizzando un allineamento armonico privo di diastemi o affollamenti. Questi sono: Diastemi Incremento della distanza intercanina Dentatura permanente in posizione vestibolare Leeway space. Diastema è un termine di origine greca che significa intervallo e intende la presenza di una distanza fra due denti vicini. La presenza di diastemi precanino superiormente e post-canino inferiormente è fisiologica. Quest ultimo permette l incremento della distanza intercanina e 7

8 rappresenta l ultima possibilità di crescita dell arcata inferiore considerata immodificabile dall età di nove anni. Il posizionamento vestibolare dei denti permanenti rispetto ai corrispettivi decidui nel settore anteriore è il risultato della spinta della lingua dei permanenti stessi dalla sede di formazione delle gemme (linguale rispetto ai corrispettivi decidui) alla sede definitiva nella cavità orale. Il posizionamento vestibolare dei denti permanenti ne determina la disposizione secondo un arco di cerchio di dimensioni maggiori e, di conseguenza, un incremento del diametro dell arcata. 1 Il lee-way space, come precedentemente detto, è la differenza tra i diametri mesio-distali dei molari decidui e i diametri mesio-distali dei premolari permanenti succedanei. La fase pre-eruttiva e la rizalisi dei decidui, la fase eruttiva e il contatto occlusale sono fattori che possono essere presi in considerazione valutando in maniera più specifica l eruzione dentale. 8

9 CAPITOLO 2 L eruzione dentale L eruzione dentale è definita come quel movimento assiale e/o occlusale che conduce un dente dalla sua posizione di sviluppo, nella mandibola o nel mascellare, fino al piano occlusale dove raggiunge la sua sede funzionale. 5, 6 Nella storia sono state avanzate numerose teorie a spiegazione dei fattori responsabili dell eruzione dentaria alcune non del tutto confermate: Teoria dell allungamento radicolare: secondo tale teoria la spinta dell elemento dentario nella cavità orale è dovuta al progressivo allungamento della radice sostenuta dall osso sottostante; 7 Teoria dell apposizione ossea: secondo questa teoria, la neo-apposizione ossea tra l estremità della radice in sviluppo e l osso già esistente, determinerebbe lo spostamento dell intero dente verso il tavolato occlusale. 7 Teoria del gubernaculum dentis: secondo questa teoria, il gubernaculum dentis, ovvero il canale connettivale che unisce il follicolo dentale in formazione alla mucosa gengivale, determinerebbe l eruzione attraverso i residui della lamina dentaria presenti a livello della rete di cellule epiteli che ne rivestono il tessuto connettivo fibroso. 7, 8 Teoria del legamento parodontale: la contrazione delle cellule del legamento parodontale in posizione obliqua causerebbe la spinta eruttiva dentale. Questa teoria è controversa perché l organizzazione del legamento parodontale inizia quando l eruzione dentale è già iniziata e procede in 7, 9, 10 senso corono-apicale. Teoria della pressione sanguigna: la polpa presente a livello dell apice radicolare beante e i fluidi interstiziali svilupperebbero la pressione sanguigna necessaria a generare la spinta eruttiva dell elemento dentario in eruzione. Questa teoria è avvalorata dal ruolo rivestito dagli ormoni nella regolazione della pressione sanguigna e nel processo di eruzione: tale ruolo è stato confermato da esperimenti condotti sui roditori e dalle evidenze scientifiche nell uomo, dove le disendocrinie per eccesso/ difetto sono associate ad eruzione dentaria ed esfoliazione dentale precoce/ ritardata. 7, 9 Teoria del follicolo dentario: il follicolo dentario è considerato un fattore determinante nella fase iniziale del processo eruttivo in quanto regolante il processo di riassorbimento osseo che accompagna il tragitto eruttivo del 9

10 7, 11 dente Analizzando le sei teorie riportate, si può concludere che le prime tre non sono valide in quanto non convalidate da ricerche sperimentali. Infatti, è stato dimostrato come le radici inizino la propria formazione dopo l eruzione coronale ed è stato dimostrato anche come si verifichi l eruzione in assenza del gubernaculum dentis; per quel che concerne il rimodellamento osseo, l apposizione e il riassorbimento osseo costituiscono parte del normale processo adattivo funzionale, non limitabile alla sola eruzione dentale. Per quel che concerne le ultime tre teorie, sono inserite all interno di un quadro esplicativo del processo eruttivo, il più accreditato attualmente, secondo quest ordine: in una prima fase sono la pressione sanguigna o la pressione interstiziale ad essere responsabili delle forze eruttive, in una seconda fase è il follicolo dentario, regolando il riassorbimento osseo ed infine è la contrazione delle cellule del legamento parodontale che assicura un ulteriore spinta verso il contatto occlusale. 7 Il percorso di eruzione può essere modificato da due fattori: il contatto con i denti adiacenti in eruzione e le dimensioni della regione apicale. La sequenza di eruzione risulta condizionata dalla posizione delle gemme nel processo alveolare e dalle condizioni di spazio del mascellare in cui deve avvenire l eruzione. 1 Come precedentemente detto L eruzione dentale è definita come quel movimento assiale e/o occlusale che conduce un dente dalla sua posizione di sviluppo, nella mandibola o nel mascellare, fino al piano occlusale dove raggiunge la sua sede funzionale. Durante l eruzione si distinguono: 1. fase pre-eruttiva, prevede un percorso endosseo, dal sito di formazione della gemma fino al piano gengivale; 2. fase eruttiva è costituita da: - periodo pre-funzionale che inizia con la comparsa della corona nella cavità orale; 1 - periodo funzionale o eruzione passiva, in cui la corona mantiene il contatto occlusale. 1, 6 L eruzione è un processo che si perora per tutta la vita in funzione alla crescita dei mascellari e alla continua usura funzionale delle superfici masticatorie. Questa eruzione continua è un processo compensatorio alle 10

11 richieste funzionali dell apparato masticatorio: nel momento in cui questa compensazione non fosse sufficiente si possono manifestare anomalie di posizione e malocclusioni. 6 Fase pre-eruttiva Lo sviluppo dei denti decidui avviene all interno di ossa inizialmente molto piccole all interno delle quali i denti sono affollati. In seguito alla crescita ossea, gli elementi dentari decidui anteriori si spostano in senso anteriore e occlusale, mentre i decidui posteriori si portano indietro e in fuori verso la cavità orale. Lo sviluppo dei denti permanenti si verifica all interno della stessa cripta in cui è avvenuto lo sviluppo del corrispondente deciduo: quando il dente deciduo erompe in arcata, le corona degli incisivi e dei canini permanenti sono poste lingualmente rispetto all apice radicolare del deciduo corrispondente mentre i premolari sono disposti tra le radici dei molari decidui. I molari permanenti, che sono elementi dentari monofisari, ovvero che non presentano predecessori nella serie decidua, originano da una propaggine distale della lamina dentaria detta lamina dentaria accessoria. La sede di formazione dei molari inferiori corrisponde all area di congiunzione del corpo e della branca montante della mandibola, mentre i molari superiori si sviluppano a livello della tuberosità del mascellare. I molari inferiori presentano una direzione d eruzione con inclinazione mesiale mentre i molari superiori presentano una direzione d eruzione secondo un inclinazione distale per poi subire entrambi un raddrizzamento in direzione occlusale. Man mano che procede lo sviluppo delle ossa corrispondenti, la migrazione mesiale del primo molare fornisce lo spazio per lo sviluppo del secondo molare nella medesima sede che sarà a sua volta occupata dal terzo molare, una volta che il secondo molare avrà abbandonato la sua posizione di sviluppo. 7 Per raggiungere il piano occlusale i denti devono attraversare progressivamente l osso, la tonaca propria e l epitelio soprastante. I fenomeni biologici ed istologici che caratterizzano questo movimento sono rappresentati dalla formazione della radice e del parodonto e da un intenso processo di rimodellamento osseo: quando l elemento dentario si sposta all interno della propria cripta di sviluppo si verifica un processo di apposizione ossea ad opera degli osteoblasti sulla superficie della cripta che 11

12 il dente si appresta ad abbandonare (creando così un alloggiamento alla radice in formazione) ed un processo di riassorbimento osseo ad opera degli osteoclasti sulla superficie della cripta verso la quale la corona si sta muovendo. Il rimodellamento osseo è accompagnato dalla riorganizzazione dei tessuti epiteliale e connettivo sovrastanti. Il rimodellamento connettivale si caratterizza per una fibrogenesi che darà origine al sistema di fibre dentogengivali, mentre dall epitelio soprastante si svilupperà l epitelio del solco gengivale e giunzionale. 7 Sotto l aspetto istologico si può osservare che nel corso dello sviluppo, ogni elemento dentario risulta circondato da tre strati di tessuto connettivo. Il primo strato è quello del follicolo dentario che è costituito da tessuto fibroso denso. Il secondo strato è costituito da tessuto connettivo lasso, il connettivo perifollicolare. Infine il terzo strato è costituito dall endostio dell osso che circonda la cripta. L inizio del riassorbimento osseo è segnato dalla comparsa di monociti sulla superficie coronale del follicolo dentario, monociti destinati a trasformarsi in osteoclasti che iniziano il riassorbimento osseo. Il gubernaculum dentis fornisce la direzione di eruzione, come dimostrato dalla presenza di osteoclasti disposti lungo la loro parete. Nello stesso tempo si verifica il riassorbimento delle fibre collagene e della sostanza fondamentale della tonaca propria della gengiva e la contemporanea proliferazione delle cellule epiteliali sia dell epitelio gengivale che dell epitelio adamantino esterno. Si forma quindi un tappo di cellule epiteliali tra la corona e la cavità orale. La parte centrale di tale tappo degenera mentre le cellule periferiche persistono per dare origine all epitelio giunzionale e sulculare. 7 Fase eruttiva. L eruzione dentale si interrompe nel momento i sui i denti incontrano i loro antagonisti funzionali. Tuttavia si possono verificare due tipologie di eventi che determinano la ricomparsa dei fenomeni responsabili del movimento dentale. Questi sono: l eruzione riattivata e lo slittamento. 7 L eruzione riattivata consiste in una ripresa del movimento in direzione coronale che si può verificare in seguito a: crescita del mascellare e della mandibola, 12

13 abrasione e attrito delle superfici occlusali, perdita della forma occlusale in seguito a carie o trauma, restauri incongrui e perdita dell antagonista. Le forze responsabili dell eruzione riattivata non sono ancora state del tutto chiarite, tra queste si annoverano la pressione sanguigna e dei fluidi 9, 10 interstiziali e la contrazione delle fibre del legamento parodontale. Lo slittamento è caratterizzato da un cambiamento di posizione dell elemento dentario che si riscontra più frequentemente in direzione mesiale, ma che può anche presentarsi come rotazione o inclinazione. Tale fenomeno si verifica in conseguenza di: crescita del mascellare e della mandibola, attrito delle superfici di contatto di denti adiacenti, carie, restauri incongrui e malattia parodontale. Le forze responsabili dello slittamento non sono state ancora pienamente chiarite, sono ipotizzate: le forze occlusali e incisali che insieme all inclinazione dell asse dentario possono produrre un movimento in direzione mesiale, la pressione delle guance e della lingua e la contrazione delle fibre transettali. 7 E da mettere in luce anche un fenomeno di natura opposta, ovvero in cui l eruzione riattivata si interrompe in maniera improvvisa. Si può verificare il fenomeno di anchilosi dentale, condizione finale di un processo caratterizzato da progressiva atrofia del legamento parodontale, riduzione delle fibre e delle cellule del legamento, inesorabile diminuzione di tutto lo spazio del legamento parodontale, assottigliamento, atrofia e perdita di osso 6, 12 alveolare. Rizalisi degli elementi dentari decidui Affinché i denti permanenti erompano in arcata, è necessaria l esfoliazione degli elementi decidui. L esfoliazione dei denti decidui prevede una prima fase di riassorbimento dell osso tra il follicolo del permanente e il dente deciduo e una seconda fase di riassorbimento dei tessuti duri dell elemento dentario. 7 Mentre per gli incisivi e i canini il processo inizia dalla superficie linguale della radice, il riassorbimento dei molari inizia dalla superficie inter-radicolare e nell area apicale. 1 Tale processo non avviene in modo continuo ma secondo fasi alterne di attività e di quiescenza. Il riassorbimento della radice è ad opera degli odontoclasti per la componente di tessuti duri dentali e ad opera di macrofagi e fibroblasti per il tessuto pulpare. Il riassorbimento osseo è determinato dagli osteoclasti. 13 Il fattore 13

14 diretto di induzione del meccanismo che sottende all esfoliazione dentale è ancora sconosciuto: sembra che un ruolo fondamentale sia svolto dal follicolo dentario del permanente che rappresenterebbe lo stimolo primario al riassorbimento, anche se, in alcuni casi, è stata riscontrata la rizalisi dei denti decidui privi del corrispondente permanente. Questo fenomeno si verifica probabilmente in seguito al sovraccarico masticatorio cui è sottoposto il dente deciduo, dal momento che non è programmato per resistere alle forze masticatorie di un adulto. 14 Al contrario un dente deciduo non sottoposto a stress masticatorio è in grado di persistere anche per molti anni nella cavità orale. I meccanismi di riassorbimento interno sono coinvolti soltanto nelle fasi finali del processo quando la polpa si è ormai trasformata in tessuto di granulazione in seguito all infezione proveniente dalla cavità orale attraverso le tasche parodontali che si sviluppano intorno al dente riassorbito. 7 14

15 CAPITOLO 3 Embriologia dei tessuti dentari I molari si sviluppano, come tutti gli elementi dentari, dalla lamina dentaria. La lamina dentaria si inizia a formare, a livello dello stomodeo, tra la VI-VII settimana di vita intrauterina. Tale struttura si presenta come una striscia di ectoderma ispessito lungo quella zona dove sorgerà la futura cresta alveolare. Le cellule epiteliali della lamina dentaria si moltiplicano, proliferano e si approfondano nel tessuto mesenchimale sottostante, formando una struttura a ferro di cavallo nota come benderella epiteliale primitiva o cresta dentaria che si divide in due processi, interno ed esterno. Il processo esterno o buccale è detto lamina vestibolare, dalla quale si formerà il solco vestibolare. Il processo interno prende il nome di lamina dentale. Da tale struttura originano alcuni rigonfiamenti epiteliali rotondeggianti che rappresentano l organo dello smalto dei denti decidui. 7 In particolare la lamina dentaria: Nella propria componente mesiale vestibolare (a partire dal II mese di vita intrauterina) presenta i precursori di elementi dentari quali incisivi, canini e molari decidui; Nella componente mesiale linguale, nota come lamina dentaria secondaria (dal V mese di vita intrauterina al X mese post-natale) presenta incisivi, canini e premolari permanenti; Nella parte distale evidenzia una propaggine nota come lamina dentale accessoria dove si sviluppano gli abbozzi degli elementi dentari che non hanno predecessori nella dentatura decidua, quali primo molare (IV mese gestazionale), secondo e terzo molare (la cui formazione inizia soltanto dopo la nascita). 7, 5 Alla formazione dell abbozzo dentario, segue lo sviluppo dell elemento dentario che può essere distinto nelle seguenti fasi: Stadio di gemma Stadio di cappuccio Stadio di campana Differenziazione cellulare con conseguente sviluppo di tessuti duri quali smalto (amelogenesi) e dentina (dentinogenesi) Mineralizzazione dei tessuti 7 15

16 Ogni elemento dentario origina da una gemma dentaria costituita dall organo dello smalto, le cui cellule derivano dall epitelio del cavo orale. L organo dello smalto presenta uno strato periferico di cellule basse e di forma cilindrica e una parte centrale di cellule di forma poligonale. Nella porzione apicale di tale struttura si assiste ad una proliferazione di cellule mesenchimali provenienti dalla cresta neurale che dà luogo alla formazione della papilla dentale e del sacco dentale. La proliferazione delle cellule epiteliali dell organo dello smalto permette di inglobare le cellule mesenchimali all interno di una struttura che viene denominata cappuccio (stadio di cappuccio). In questo stadio di sviluppo, l organo dello smalto è costituito da un epitelio adamantino esterno, formato dalle cellule che si trovano lungo la convessità dell organo stesso, e da un epitelio adamantino interno formato dalle cellule che si trovano lungo la faccia concava dello stesso organo. Le cellule poligonali che si trovano inglobate tra i due strati di cellule epiteliali prendono il nome di reticolo stellato. Con il procedere dello sviluppo si assiste alla proliferazione delle cellule della papilla dentaria che si invaginano nello spazio delimitato dalle cellule dell epitelio adamantino interno dando luogo ad una struttura caratteristica a forma di campana (stadio a campana). In questa fase l epitelio adamantino esterno risulta formato da piccole cellule cubiche; il reticolo stellato è costituito da cellule poligonali fornite di lunghi ed esili prolungamenti tra i quali si deposita una sostanza intercellulare ricca di glicosaminoglicani; infine l epitelio adamantino interno risulta costituito da una sola fila di cellule cilindriche. Ciascun tipo cellulare va incontro a un sempre maggiore livello di citodifferenziazione con lo scopo di poter formare i tessuti duri del dente. Infatti le cellule epiteliali dell organo dello smalto danno origine allo smalto dentario; le cellule mesenchimali della papilla dentaria formano la dentina e la polpa del dente; mentre il sacco dentale darà origine al cemento e legamento parodontale. Tuttavia le cellule mesenchimali si differenziano in odontoblasti solo se sono in rapporto con l epitelio adamantino interno che a sua volta non inizia la deposizione dello smalto se non è prima avvenuta la deposizione di minerali nella matrice organica extracellulare secreta dagli odontoblasti. 16

17 La differenziazione cellulare prosegue in direzione apicale attraverso la presenza di una estensione detta ansa del colletto, costituita da epitelio adamantino esterno ed interno che evolverà nella guaina della radice di Hertwing, responsabile dello sviluppo della radice del dente. In questa struttura, priva delle cellule del reticolo stellato, le cellule dell epitelio adamantino interno non evolvono in ameloblasti ma hanno la sola funzione di indurre la differenziazione delle cellule della papilla dentaria in odontoblasti. Nei denti con più radici si formano delle pieghe all interno della guaina che crescono verso l interno e daranno origine ad una guaina per ciascuna radice. L inizio della deposizione di dentina segna anche la fine della guaina di Hertwing, la cui involuzione risulta funzionale all arrivo delle cellule mesenchimali del follicolo dentario che daranno origine al 7, 15 cemento radicolare. L inizio della formazione dei tessuti duri si riscontra in corrispondenza del margine incisale e della cuspide, ovvero nella cresta corrispondente alla futura giunzione tra smalto e cemento. Il normale processo di mineralizzazione dei tessuti biologici prevede la secrezione di una matrice da parte di cellule di origine mesenchimale. Odontoblasti, cementoblasti e osteoblasti sono tutte cellule di origine mesenchimale che danno origine rispettivamente a dentina, cemento e osso. Ciò che accomuna queste cellule è l analogo meccanismo di secrezione di una matrice proteica, il cui principale costituente è il collagene che permane all interno di una struttura dove avviene la nucleazione e l accrescimento dei cristalli minerali. Diverso è il meccanismo di formazione dello smalto le cui cellule costituenti, gli ameloblasti, sono di origine ectodermica e sintetizzano una matrice formata da amelogenine ed enameline e priva di collagene. La differenza sostanziale tra questi due tipi di mineralizzazione risiede nel fatto che, nella matrice dello smalto la componente proteica viene eliminata per lasciare il posto a cristalli minerali di grandi dimensioni che assumono una disposizione molto regolare e la cui lunghezza può eguagliare l intero spessore dello smalto. Alla nascita si possono riscontrare tutti gli stadi di sviluppo dei denti: gli incisivi sono gli elementi che presentano il maggior grado di sviluppo rispetto a canini e molari decidui. 7 Le gemme dei molari permanenti, compresa la gemma del secondo molare, si trovano distalmente alle radici dei denti che li precedono e la loro 17

18 eruzione in arcata viene assicurata dai processi di rimodellamento mandibolare. In particolare la crescita in lunghezza del corpo della mandibola è resa possibile dal riassorbimento del margine anteriore del ramo e dall apposizione sul margine posteriore dello stesso. La direzione di eruzione del secondo molare segue un arco di cerchio a concavità superiore, da distale verso mesiale movimento in cui sembra avere un ruolo importante la radice distale del primo molare. E proprio durante tale fase eruttiva intraossea che si può verificare una anomalia del decorso eruttivo tale per cui il molare impatta contro la radice distale del dente che lo precede, rimanendo incluso o ritenuto. La conseguenza di questo fenomeno può esitare nel possibile riassorbimento radicolare dell elemento mesiale. Al contrario, La fase eruttiva in arcata risulta condizionata dall equilibrio tra la forza centrifuga della lingua e quella centripeta della muscolatura geniena. 1 I molari sono gli unici denti che non hanno predecessori nella dentatura decidua. Il loro processo di mineralizzazione inizia solo dopo la nascita. In particolare la mineralizzazione del secondo molare inizia tra anni e si verifica in maniera progressiva dalla corona fino alla radice. 1 Nella maggior parte degli elementi dentari, l eruzione si verifica quando la radice ha raggiunto i 2/3 del suo sviluppo. In maniera diversa si comportano i secondi molari che erompono 1-3 anni dopo che le radici si sono formate per ¾ della loro lunghezza. 16 Il timing d eruzione dei secondi molari è stato valutato da diversi autori: Cozza e altri autori riportano un età media tra 11 e 13 anni, senza distinzioni di sesso 1 ; Helm e Seidler hanno riportato un età media d eruzione del molare mascellare rispettivamente di 12.4 per i maschi e di 11.9 anni per le femmine, mentre per il secondo molare mandibolare l età media era di 11.9 per i maschi e di 11.4 anni per le femmine. 18

19 CAPITOLO 4 Eziologia delle anomalie di eruzione Un normale processo eruttivo prevede il passaggio dei denti attraverso l'osso e l'epitelio orale in una sequenza temporale precisa e bilaterale che deve essere coordinata alla crescita di mascellare e mandibola nei tre piani dello spazio. I tre elementi che controllano in maniera precisa e raffinata tale processo sono: il riassorbimento dell'osso e della mucosa alveolare sovrastante la gemme dentale, e la progressiva formazione delle radici dentali. Studi microchirurgici nel cane hanno dimostrato come una volta che sia stato creato un preciso tragitto eruttivo, il dente in eruzione si muove attraverso questo stesso tragitto per emergere nella cavità orale. 17 (Cahill, 1969). Il fattore che regola questo processo è il follicolo dentario ovvero, una sacca di tessuto connettivo lasso che circonda l'organo dello smalto di ciascun dente, che è destinato a diventare al termine della fase eruttiva intraossea, legamento parodontale. Durante la fase intraossea dell'eruzione, che guida il dente dalla sua cripta ossea verso il tavolato occlusale, sono necessari processi sia di riassorbimento che di neo apposizione ossea. Osservazioni al SEM nei cani hanno mostrato l'esistenza di tre zone nel follicolo: una regione coronale costituita da osso in fase di riassorbimento, una zona intermedia inattiva e una zona apicale consistente in osso apicale in formazione. 18 Il riassorbimento osseo è risultato dell'osteoclastogenesi, non necessita della pressione del dente ed è un evento geneticamente programmato. 17, 19 (Cahill, 1969; Wise, 2002). Prima dell'eruzione si verifica un afflusso di cellule mononucleate nella parte coronale del follicolo dentale e un aumento di osteoblasti nella parte inferiore del follicolo dentario. 20 (Marks, 1983).Il fattore molecolare che probabilmente svolge il ruolo più importante durante l'inizio del processo cellulare, è il CSF-1. Quest'ultima molecola insieme a MCP-1 (moncyte chemotactic protein) svolge il ruolo di fattore di attrazione chemiotattico nei confronti delle cellule mononucleate, precursori delle cellule osteoclastiche che permetteranno l'attivazione del processo eruttivo. La sintesi e la secrezione di entrambe queste chemochine sono regolate da fattori di segnalazione paracrini tra il follicolo dentario e il reticolo stellato, fattori quali il TGF-beta (trasforming growth factor beta), IL-1alfa (interleukin 1 alfa), e PTHrP, EGF (epidermal growth factor) e CSF-1. 19

20 Come conseguenza di questi eventi l'espressione genica di RANKL, come marker per osteoclastogenesi risulta aumentata nella parte coronale del follicolo dentario, mentre l'espressione della proteina ossea morfogenetica (BMP2), marker per la formazione ossea risulta aumentata nella metà apicale dello stesso follicolo. 21 (Wise et al, 2009) All'interno dello stesso follicolo sono presenti le cellule del reticolo stellato che secernono l'ormone paratiroideo peptide correlato (PTHrP) che stimola CSF1 (il fattore stimolante le colonie 1) e RANKL (recettore attivatore di NfkB ligando) che differenzia i monociti in osteoclasti, responsabili del riassorbimento nella metà coronale del follicolo. Nello stesso tempo si verifica una maggiore espressione della proteina morfogenetica (BMP2), responsabile dell'osteogenesi nella parte apicale del follicolo dentario. La complessità di questo processo sia a livello cellulare che molecolare può determinare l'insorgenza di problematiche di eruzione dovute a fattori locali, sistemici, genetici o di natura multifattoriale. 22 (Proff, 2006) È possibile distinguere il Fallimento di eruzione secondario dovuto a un ostacolo del tragitto eruttivo come la presenza di cisti, altri elementi dentari in posizione anomala, alterata posizione della lingua. Tale anomalia eruttiva si caratterizza per un normale tragitto eruttivo che consente una normale eruzione dentale una volta che l'ostacolo sia stata rimosso. Tuttavia l'ostacolo può anche essere integrale, ovvero dovuto alla fusione totale tra osso e cemento radicolare. Tale condizione di anchilosi non consente un normale tragitto eruttivo nemmeno qualora sia stato rimosso l'ostacolo poiché il fisiologico spazio del legamento parodontale risulta del tutto assente. 20

21 CAPITOLO 5 Il fallimento primario di eruzione Il termine PFE (difetto di eruzione primario) descrive una condizione in cui denti, non anchilosati, falliscono nel loro processo eruttivo parzialmente o completamente senza che sia identificabile alcuna interferenza meccanica o patologia sistemica. Il termine difetto primario di eruzione (PFE: primary failure of eruption) è stato coniato da Proffit e Vig (1981) 23 per indicare un malfunzionamento nel meccanismo eruttivo che colpisce i denti non anchilosati. Ciò che caratterizza questi denti è l'incapacità di percorrere il tragitto eruttivo che è stato già creato dall'attività degli osteoclasti. Tali denti possono erompere parzialmente e poi rimanere inclusi o semi-inclusi, sebbene non mostrino segni di anchilosi. Infatti i denti colpiti, una volta esposti chirurgicamente, risultano mobili nella cripta e quindi, non anchilosati. É stato ipotizzato che un'alterazione nel bilancio tra il riassorbimento e la neo apposizione ossea che dovrebbero regolare l'eruzione dentaria, sia responsabile dell'insorgenza di forme di PFE. 24 (Silvya A. Frazier-Bowers, 2010) Il PFE colpisce solo i denti posteriori, con conseguente open-bite nella zona posteriore dell'arcata. Tale condizione è raramente simmetrica, più frequentemente risulta monolaterale. Una caratteristica cruciale per questi elementi dentari è la scarsa o nulla risposta al trattamento ortodontico che impedisce la loro trazione in arcata. Questa condizione si manifesta nei pazienti intorno a 8-9 anni quando si riscontra una certa asimmetria nella permuta. Nel percorso diagnostico risulta fondamentale escludere fattori locali, sistemici o endocrini che possono essere in qualche modo correlati con l'anomalia eruttiva. Per fare dunque diagnosi di PFE devono essere presenti alcune, ma non tutte, di queste caratteristiche: i denti posteriori sono più frequentemente coinvolti; i denti colpiti dall'anomalia possono erompere parzialmente per poi interrompere il loro tragitto eruttivo oppure non iniziare del tutto il loro cammino; Sia la dentizione decidua che quella permanente possono essere interessate; Il coinvolgimento dei denti può essere unilaterale o bilaterale; 21

22 I denti colpiti hanno la tendenza ad andare in anchilosi, soprattutto qualora sia applicata una trazione ortodontica; Il quadro clinico si manifesta in maniera isolata senza coinvolgimento sistemico. 23 (Proffit, 1981). In alcuni casi si riscontra un totale fallimento del meccanismo eruttivo, mentre in altri casi il dente può emergere nella cavità orale senza però completare il cammino di eruzione. Questa diversa presentazione clinica ha suggerito ai ricercatori che il PFE possa insorgere con due diversi meccanismi oppure che possa avere due diverse manifestazioni dello stesso meccanismo. 25 (Ahmad 2006) Proffitt e Vig ipotizzarono che un'anomalia genetica a penetranza incompleta ed espressività variabile, sia la reale causa del PFE. Infatti la recente scoperta che alterazioni nel gene che codifica per il Recettore dell'ormone Paratiroideo di Tipo 1 (PTH1R) siano responsabili di alcuni casi di familiarità per il PFE, ha consentito di ipotizzare che il PTH1R sarebbe coinvolto in tutti quei disturbi di eruzione che non prevedono la presenza di barriere meccaniche, ovvero dei casi di fallimento primario di eruzione (PFE). Tuttavia resta da capire come un difetto genetico di PTH1R sia in grado di determinare un'anomalia eruttiva nonostante il percorso di eruzione sia già stato creato dal riassorbimento osseo. La spiegazione di questo processo si deve ricercare nella connessione esistente tra PTH1R e PTHrR che è secreto dalle cellule del reticolo stellato e responsabile dell'induzione di CSF1 e RANKL. Questa connessione fornisce una base eziologica del legame esistente tra PTH1R, PFE e mediatori dell'eruzione necessari per un corretto rimodellamento osseo. Di conseguenza è stato ipotizzato che una variazione genetica del PTH1R potrebbe alterare il bilancio esistente tra riassorbimento osseo necessario per creare il percorso eruttivo e neo-apposizione ossea necessaria a ricostituire osso una volta avvenuto il passaggio del dente, contribuendo in questo modo al PFE. Gli studi di Raghoebar hanno dimostrato come PFE a Anchilosi potrebbero essere strettamente correlati, dal momento che in entrambe le condizioni sono state descritte anomalie a livello del legamento parodontale. Infatti, studiando istologicamente 26 molari di 20 pazienti, è stato evidenziato che alla base di queste anomalie eruttive c'è un errato meccanismo di 22

23 sostituzione di cementoblasti con osteoblasti a causa di un'anomalia nel legamento parodontale durante il fisiologico processo di riassorbimento osseo. Uno studio della Frazier (2007) 26 ha dimostrato come il 26% dei casi di PFE siano familiari; Raghoebar invece aveva riscontrato familiarità nel 10% dei casi analizzati. Anche lo studio della Frazier ha dimostrato che nei pedigree analizzati la modalità di trasmissione sia autosomica dominante con penetranza completa ed espressività variabile. Gli elementi dentari interessati da quest'anomalia eruttiva hanno una scarsa o nulla risposta al trattamento ortodontico con tendenza ad andare incontro ad anchilosi. Inoltre il comportamento simil-anchilotico di questi elementi dentari si evidenzia in seguito all'applicazione di forze ortodontiche, dal momento che gli elementi dentari adiacenti vanno incontro a un progressivo movimento intrusivo. Figura1: pathway intracellulare attivato dall Ormone Paratiroideo mediante attivazione del Recettore dell Ormone Paratiroideo di Tipo 1. 23

24 CAPITOLO 6 Correlazione genotipo-fenotipo La possibilità di guardare alle anomalie di eruzione da una prospettiva genetica ha consentito di spostare l'attenzione alle basi biologiche delle anomalie dentarie, fornendo le basi per una diagnosi clinica standardizzata e una terminologia unitaria. In questo modo i disordini di eruzione possono essere identificati in base alla loro natura eziologica piuttosto che sulla base di un'imprecisa descrizione morfologica consentendo una più netta distinzione tra i disordini di eruzione di natura biologica quale il fallimento primario di eruzione (PFE) e i disordini di eruzione di natura meccanica (MFE) dovuti alla presenza di un ostacolo fisico all'eruzione. 26 L'identificazione di mutazioni del gene PTH1R ci consente di differenziare i casi di PFE da quelli che in precedenza venivano etichettati come anchilosi. Infatti l'incompleta eruzione in arcata di un elemento dentario, unita all'assenza dello spazio del legamento parodontale, visibile radiograficamente, indirizzava il clinico ad una superficiale diagnosi di anchilosi senza possibilità di indagare sulla natura eziologica del problema. 27 Analizzando la variabilità fenotipica delle diverse anomalie eruttive è stato possibile identificare due tipologie di PFE. Il PFE tipo I si identifica per un open-bite progressivo che dal primo dente affetto procede in maniera progressiva coinvolgendo anche gli elementi distali. Per questo tipo di anomalia è stato ipotizzato che il medesimo difetto di eruzione sia espresso nello stesso momento da tutti i denti affetti. Il PFE tipo II, invece, pur presentandosi con un open-bite posteriore, evidenzia un variabile grado si eruzione del dente subito distale a quello infraoccluso, ovvero il secondo molare. È stato ipotizzato che in questo tipo di anomalia eruttiva il momento di insorgenza del disturbo sia correlato al diverso grado di formazione delle radici dei denti diversamente coinvolti. 26 La distinzione diagnostica tra anchilosi, ritenzione secondaria e PFE è importante in relazione alla possibilità di determinare se il dente distale al primo molare, che più comunemente è colpito, sia interessato o meno all'anomalia eruttiva. 26 Un dilemma clinico molto comune è quello di confondere il PFE con l'anchilosi dal momento che entrambe le condizioni presentano una simile 24

25 apparenza clinica. Risulta tuttavia molto importante distinguere le due condizioni per non inficiare le possibilità di successo terapeutico. 28 Se viene fatta una diagnosi di PFE, dopo aver identificato una variante genetica del PTH1R, il dente colpito dall'anomalia eruttiva non sarà responsivo al trattamento ortodontico. Le poche opzioni di trattamento nei casi di PFE includono piccolo osteotomie segmentarie, e restauri protesici dal momento che la possibilità di trattamento ortodontico con arco continuo deve essere esclusa poiché si potrà verificare solo un peggioramento dell'open-bite, causando un notevole danno biologico ed economico per il paziente. 29 Al contrario, se viene convalidata la diagnosi di anchilosi perché non è dimostrata la presenza di varianti del gene PTH1R, allora i restanti elementi dentari risponderanno al trattamento ortodontico, dopo l'estrazione del dente affetto. 26 In questo modo, avendo compreso i fattori biologici e genetici che controllano l'eruzione dentale, è possibile riconsiderare la classificazione delle anomalie eruttive, in passato basata sulla sola evidenza morfologica, per indirizzarci verso una più corretta caratterizzazione biologica e genetica. Le caratteristiche fenotipiche che possono indirizzare verso la diagnosi di PFE sono state evidenziate in un lavoro di Rohads e Frazier che hanno classificato un gruppo di 64 pazienti in base all'evidenza fenotipica riscontrata all'esame clinico e radiografico. 30 Le caratteristiche fenotipiche sono state: Simmetria (unilaterale, bilaterale); Arcate coinvolte (mascellare, mandibola, entrambe) Denti coinvolti (I premolare, I e II molare) Localizzazione nell'osso alveolare (sopra-sottocrestale) Tipologia di PFE (Tipo I e Tipo II) III classe scheletrica Radici dilacerate Altre anomalie dentarie. In base a questo studio è stato evidenziato che le caratteristiche sopra elencate rappresentano il fenotipo calzante per i pazienti in cui si sono riscontrati variante geniche del PTH1R. Tale caratterizzazione consente di 25

26 differenziare ulteriormente il PFE dall'anchilosi: infatti il 74% dei pazienti analizzati aveva una localizzazione in entrambe le arcate e nel 53% dei casi bilaterale con multipli denti infraocclusi a differenza dell'anchilosi che spesso presenta una localizzazione singola. Inoltre gli elementi affetti erano più spesso i I molari, con apparenza clinica di PFE tipo II e nel 31% dei casi è stata riscontrata una III classe scheletrica suggerendo che un generalizzato disturbo del metabolismo osseo potesse in qualche modo inibire non solo l'eruzione dei denti ma anche la crescita in avanti e verso il basso dell'intero mascellare. 30 Infine uno studio di Shalish ha evidenziato la correlazione esistente tra denti infraocclusi (soprattutto decidi) e altre anomalie dentarie come agenesia, microdonzia degli incisici laterali, canini dislocati palatalmente e secondi premolari mandibolari inclinati distalmente

27 CAPITOLO 7 Gene candidato Il fallimento primario di eruzione è dunque un'anomalia eruttiva la cui causa si deve ricercare in mutazioni del gene che codifica per il recettore 1 del Paratormone (PTH1R, MIM ), situato sul cromosoma 3p (Decker, 2008) 32 La reale incidenza è sconosciuta, ma è stato stimato che si manifesta approssimativamente nello 0,6% della popolazione (Stellzig- Eisenhahuer, 2010) 33 Il gene PTH1R codifica per un recettore a elica transmembrana accoppiato a proteina G costituito da 593 amminoacidi: un peptide di segnale formato da 28 amminoacidi, un grande dominio extracellulare formato da 150 amminoacidi con il sito di legame per l'ormone, sette domini a elica trasmemebrana e un dominio intracellulare. Il domino di legame extracellulare risulta attivato da due specifici ligandi: PTH (ormone paratiroideo), che agisce principalmente a livello del fegato e degli osteociti e PTHLP (parathyroid hormone-like peptide). (Datta e Abou-Samra, 2009) 34 Entrambi questi ligandi consentono la regolazione dei livelli di calcio e favoriscono il metabolismo osseo. Mentre il PTH è un fattore endocrino che agisce sul metabolismo del calcio stimolando la formazione dell'osso, il PTHLP è un ormone regolatorio autocrino /paracrino che regola i meccanismi di ossificazione encondrale e le interazioni tra epitelio e mesenchima durante la formazione della ghiandola mammaria e dei denti. Mentre il PTH è prodotto solo dalle ghiandole paratiroidi, il PTHrP è prodotto da diversi tessuti compreso il tessuto epiteliale, l'endotelio, i condrociti, la muscolatura liscia, osso, fegato, tessuto nervoso, e le gemme dentarie. Il PTH1R è espresso dove il PTH e PTHrP sono biologicamente attivi, ovvero osteoblasti e cellule tubulari renali. (Lavi-Moshayoff, 2010) 35. PTH e PTHrP hanno solo il 16% di sequenze omologhe e tali sequenze si trovano in corrispondenza dell'estremità N terminale. Mentre il PTH regola il metabolismo osseo e quello del calcio a livello sistemico, il PTHrP agisce a livello locale (Cornish, 2010) 36. Di conseguenza è richiesta una fine coordinazione tra PTH/PTHrP/PTH1R affinché si abbia un normale sviluppo scheletrico. (Frazier-Bowers, 2014) 37 Il contributo genetico del PTHrR nello sviluppo dei denti e del tessuto scheletrico è dimostrato da 27

28 numerosi studi animali e non solo (Philbrick, 1998) 38 Durante lo sviluppo della dentatura umana l mrna del PTH1R è espressi dagli osteoblasti dell'osso alveolare che sono in prossimità delle gemme dentali in via di formazione, mentre PTHLH ligando è espresso nelle cellule epiteliali della lamina dentale. Questo complesso pattern è in linea con l'ipotesi in base alla quale si ritiene che il pathway di segnale PTHLH/PTH1R è responsabile del rimodellamento osseo necessario per lo sviluppo della dentatura e l'eruzione dentale. 37 Il PTH1R nella specie umana è composto da 14 esoni, e si compone di 3 domini: il dominio N-terminale extracellulare, il dominio J che ci compone dell'elica transmembrana e della loop di connessione e il dominio C terminale intracellulare. Il dominio N-terminale ha una funzione regolatoria, interagisce con la porzione Carbossi-Teminale del PTH e del PTHrP per consentire l'interazione con il dominio J. Quest'ultimo è un dominio funzionale, e interagisce con la porzione N terminale del PTH e PTHrP. Una volta che il PTH1R è stato attivato, il ligando viene fosforilato e quindi inattivato. Lo stesso recettore viene quindi internalizzato per poi essere riutilizzato. Studi di biologia cellulare e molecolare della porzione N- terminale del PTH1R hanno suggerito che PTH1R è attivo in una forma dimerica e che solo la porzione N-terminale è richiesta per questo tipo di interazione. La porzione C-terminale è importante per il meccanismo di segnalazione intracellulare. Mutazioni del PTH1R si verificano proprio a livello del dominio N-terminale, ostacolando la dimerizzazione e il legame con il ligando. In questo modo viene impedita la cascata del segnale intracellulare. Quando la mutazione è autosomica recessiva (ovvero quando entrambe le copie del gene sono mutate), ne risulta un fenotipo grave con interessamento di tutto il tessuto scheletrico. Tuttavia anche una singola mutazione può causare una grave condizione autosomica dominante qualora venga impedita la dimerizzazione (dominio extracellulare), alterata l'attivazione del ligando (dominio transmembrana), e modificati i meccanismi di segnalazione intracellulari accoppiati a proteine G (dominio intracellulare). Solitamente sono due le proteine G che vengono attivate: l'adenilato ciclasi e la fosfolipasi C (PLC). Mentre l'attivazione dell'adenilato ciclasi si verifica ad una concentrazione fisiologica dell'agonista (subnanomolari), l'attivazione del PLC richiede concentrazioni 28

29 micromolari dell'agonista (Bringhurst, 1993) 39. E' possibile che l'attivazione del PLC sia il risultato di una concentrazione estremamente alta di PTHrP in zone ricche di PTH1R come si verifica a livello delle zone di crescita o di formazione delle gemme dentali. Questo pathway di segnale dosedipendente (PLC) potrebbe essere importante nello sviluppo dell'osteoartrite e del PFE (Becher, 2010) 40. Dati biochimici e studi di cristallografia a raggi X hanno evidenziato che solo il dominio extracellulare è necessario per la dimerizzazione del recettore (Mierke, 2007) 41. Una sola copia normale di PTH1R è necessaria e sufficiente a svolgere le sue funzioni nella maggior parte dei tessuti, tuttavia nello sviluppo dei denti sono necessarie significative quantità di PTH1R. Infatti il fenotipo del PFE potrebbe essere il risultato di un'inattivazione dose-dipendente di PTH1R. Ciò potrebbe spiegare perché alcuni individui, pur avendo una mutazione di PTH1R, non mostrano il fenotipo clinico. Un'ulteriore osservazione da fare è che mutazioni autosomiche dominanti nel PTH1R non interessano i denti anteriori o altre strutture scheletriche fatta eccezione per l'osteoartrite. Recenti studi hanno confermato l'associazione tra osteoartrite e bassi livelli di PTH1R nei condrociti dei ratti (Becher, 2010) 40. Anche la Frazier ha individuato in due famiglie l'associazione tra mutazioni del PTH1R e osteoartrite. Di conseguenza, le mutazioni del gene PTH1R sono associate ad alcune patologie del tessuto osseo. La completa o quasi completa inattivazione di entrambi gli alleli del gene PTHR1 è associata alla condrodisplasia di Blomstrand (BOCD), una displasia autosomica-recessiva del tessuto scheletrico caratterizzata da avanzata ossificazione endocondrale e prematura ossificazione. Al contrario, la perdita di funzione del PTH1R è causa di una patologia autosomica dominante nota come condrodisplasia metafisiaria di Jansen, caratterizzata da dismorfismi che sono il risultato di un'alterata differenziazione dei condrociti. Un'altra condizione nota come encondromatosi o Sindrome di Ollier che si manifesta con tumori cartilaginei multipli, associata a deformità scheletriche, può essere causata da una mutazione autosomica dominante del gene PTH1R. Infine la sindrome di Eiken è una rara displasia scheletrica autosomica recessiva, caratterizzata da displasie multiple epifisarie e da ritardata ossificazione delle estremità. La mutazione autosomica dominante del gene PTH1R, 29

30 identificata nelle famiglie affette da PFE non sindromica, è caratterizzata da un recettore proteico tronco precedente al primo dominio trasmembrana che può o impedisce la dimerizzazione oppure portare ad una degradazione proteolitica prematura della proteina precursore. Ricerche sperimentali su animali hanno permesso di dimostrare che la gemma si sviluppa normalmente e che c'è una normale secrezione e maturazione della dentina e dello smalto. Solo successivamente il difetto di eruzione diventa evidente con alterazioni nel riassorbimento dell'osso alveolare. (Decker 2008) 32 Tuttavia la scoperta che evidenze cliniche di PFE si manifestano anche in pazienti senza mutazioni del gene PTH1R, ha portato alla conclusione che PFE è un'alterazione complessa, risultato di mutazioni di numerosi geni e di vari meccanismi molecolari. Figura2: banda rossa posizione del gene PTH1R sul braccio corto del Cromosoma 3 30

31 CAPITOLO 8 Scopo della tesi Il fallimento di eruzione primario è una condizione rara che ha elevata penetranza ed espressività variabile determinando infraocclusione dentale senza evidenza di ostacolo meccanico. Il malfunzionamento del meccanismo eruttivo è la causa della mancata eruzione dentale nonostante il tragitto sia stato creato dal riassorbimento osseo. Sono stati identificati 29 pazienti con un fenotipo clinico e radiografico di PFE con lo scopo di verificare la presenza di mutazioni del gene PTH1R. Lo studio ha uno scopo diagnostico e prognostico, perché in caso di variazione genetica la letteratura riporta l insuccesso delle terapie ortodontiche. Infatti il trattamento di quest'anomalia eruttiva risulta estremamente frustrante dal momento che il comportamento simil-anchilotico dei denti infraocclusi, determina un movimento intrusivo dei denti adiacenti su cui si scaricano le forze ortodontiche. Per ciascun paziente è stata effettuata un'indagine anamnestica per convalidare lo stato di salute escludendo condizioni di infiammazione o traumatico dentale pregresso ed eventuali patologie sistemiche che in qualche modo potesse giustificare l'anomalia eruttiva. E' stato ottenuto il consenso da ciascun adulto partecipante allo studio, e da un genitore nel caso di minori dopo aver ricevuto un'accurata spiegazione della natura e degli obiettivi dello studio. L'approvazione di questo studio è stata chiesta al Comitato Etico dell'università Cattolica del Sacro Cuore. 31

32 CAPITOLO 9 Materiali e metodi Tutte le fasi della sperimentazione sono state eseguite presso il laboratorio dell Istituto di Genetica Media e nel laboratorio di Clinica Odontoiatrica dell UCSC. Sono stati reclutati 29 pazienti nell Ambulatorio di Clinica Odontoiatrica del Policlinico A. Gemelli di Roma appartenenti a diverse famiglie (range di età compresa tra 7-45 anni). La selezione del campione di pazienti affetti da PFE è stata fatta mediante una valutazione che ha incluso: Foto intraorali Radiografia ortopanoramica o endorale I criteri per la diagnosi clinica di PFE hanno incluso le caratteristiche espresse da Proffit e Vig, ovvero: Coinvolgimento dei denti posteriori Assenza completa del dente in arcata o incompleto raggiungimento del piano occlusale Assenza completa di segni di eruzione oltre il fisiologico periodo di comparsa del dente in arcata; Normale riassorbimento osseo con la creazione di un tragitto eruttivo sulla corona del dente coinvolto; Interessamento dei denti sia decidui che permanenti Eventuale estensione dell'anomalia eruttiva ai denti distali a quello coinvolto; Coinvolgimento unilaterale o bilaterale Open-bite posteriore. Il difetto genetico nei pazienti studiati è stato caratterizzato mediante analisi di sequenza del gene PTH1R con metodo Sanger da DNA estratto da cellule salivari mediante utilizzo di brush salivare usati normalmente per tali tipi di prelievi. Il DNA da cellule salivari è stato estratto con l'utilizzo di kit commerciale Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega). La concentrazione di DNA è stata valutata con l'utilizzo dello spettrofotometro NANODROP- ND1000 (Nanodrop products, Wilmington, DE, USA). Il DNA ottenuto è stato amplificato mediante reazione di PCR (Polymerase 32

33 Chain Reaction). I primers per l'amplificazione di tutti gli esoni codificanti per il gene PTH1R e delle giunzioni esone-introne sono stati disegnati exnovo nel nostro laboratorio utilizzando il programma Genamics Expression (una nuova applicazione di Windows) per l'analisi di sequenza degli acidi nucleici e delle proteine. I primes ottenuti mediante l utilizzo di Genamics Expression sono stati poi inseriti in UCSC Genome Browser (University of California at Santa Cruz) all interno della sessione PCR Bioinformatics, un sistema in silico che permette di definire quale sia il template amplificato dai primer disegnati, la temperatura di annealing affinché il prodotto di amplificazione sia solo quello di nostro interesse. Tabella con le sequenze dei primers disegnati per PTH1R (Temperatura di annealing 55 C) GENE ESONE SEQUENZA PTH1R PTH1R PTH1R PTH1R PTH1R PTH1R PTH1R PTH1R PTH1R PTH1R PTH1R PTH1R 3 FORWARD 3 REVERSE 4 FORWARD 4 REVERSE 5 FORWARD 5 REVERSE 6 FORWARD 7 REVERSE 8 FORWARD 8 REVERSE 9 FORWARD 9 REVERSE 10 FORWARD 10 REVERSE 11 FORWARD 11 REVERSE 12 FORWARD 12 REVERSE 13 FORWARD 13 REVERSE 14 FORWARD 15 REVERSE 16 FORWARD 16 REVERSE AGCCTGACGCAGCTCTGCA CCCACAGTCCAGACATCCCA AGAGCAGATTCCCCACATGC TTCACCTGGCTCTGTATCCT TCCTCACCCATCGTCTCAGAT AAGAGCCAAGAAGCATGAGC AGATGTATTCATCCTTCTGGG TAAGGTTGCTGGAGGAGTCAAG AAATTCACTCCCACCCCACG TGGACAGGAAGCTGGGTTGT ACAACCCAGCTTCCTGTCCA AAGACGGGTTTGAGTGGCTG AAACGAAGCCTGCCCCTTC GCCTGGAATAGGGTCAGGAT GGAATGACCTTGTGGACAGC TAGCTGTTGAGGACACAGGG AGGGTCACAGGAGGCTACTT TGTCACTGCATCTCTGGGTG ATGCAGGTGAACTGGGTTG ACAGGGTGGAAGAATGGAGA AGGTGAACTGGGTTGTCCTC GAATGTCCTCAGGGGTGTTC CACTTGGCCTTGGAGTTTCC CCACCCATCTTTTGGTCC 33

34 I prodotti della reazione di PCR sono stati purificati con PCR Product Pre- Sequencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech), composto da una fosfatasi alcalina (SAP) e una esonucleasi (EXO I), in grado di degradare rispettivamente i dntps e i primers rimasti nel prodotto di PCR. La reazione di sequenza è stata effettuata con Big Dye Terminator 3.1 Cycle Sequencing Kit (Life Tecnologies, Carlsbad, CA, USA), purificata con Big Dye X-Terminator Kit (Life Tecnologies, Carlsbad, CA, USA) e analizzata su sequenziatore automatico ABI 3130 Genetic Analyzer (Life Tecnologies, Carlsbad, CA, USA). 34

35 CAPITOLO 10 Risultati Le analisi genetico-molecolari della sequenza codificante del gene PTH1R, hanno evidenziato alcune varianti che sono state poi valutate tramite utilizzo dei seguenti database: 1. ENSEMBL, 2. GENBANK, =toolbar 3. UCSC, GENOMI: 5. POLYPHEN prediction of functional effect of human nssnps: Nel gruppo di pazienti analizzati, l'anomalia eruttiva ha interessato sia la dentatura decidua che permanente e si è manifestata per la maggior parte dei pazienti durante la fase sopraossea dell'eruzione dentale. In molti dei pazienti analizzati si sono riscontrati polimorfismi o varianti introniche non aventi un grande significato diagnostico; inoltre è stata riscontrata una variante missenso de novo non riportata in letteratura. I pazienti nei quali si è riscontrata la presenza di varianti sono stati raggruppati in una tabella in cui sono riportate le caratteristiche del PFE così come descritte in letteratura. Le caratteristiche dell anomalia eruttiva che sono state prese in considerazione sono: la simmetria (unilaterale, bilaterale); il coinvolgimento delle arcate (mascellare, mandibola o entrambe); denti coinvolti (I, II molare o altri elementi dentari), la sede nell osso alveolare (sopra o sotto crestale); la classificazione in PFE tipo I o tipo II, il riscontro di III classe scheletrica, la presenza di altre anomalie dentarie oppure di radici dilacerate. A queste caratteristiche abbiamo aggiunto la presenza di coinvolgimento di denti decidui, dal momento che è stata riscontrata la presenza di varianti geniche anche in pazienti con infraocclusione di elementi della dentatura decidua. 35

36 Si riportano nella tabella successiva, 8 dei 29 pazienti selezionati in cui è stata riscontrata la presenza di una variante patogenetica a livello del gene PTH1R. PAZIENTI Pz n.5 B.M. Pz n.13 M.A. Pz n.14 V.C. Pz n.15 B.N. Pz n.18 S.B. Simmetria PFE Unilaterale x x Pz n.25 A.N. Pz n.28 D.P.C Pz n.32 V.M. Bilaterale x x x x x x Coinvolgimento arcate Mascellare Mandibolare x x Entrambe x x x x x x Denti coinvolti I molare permanente x x x x x x II molare permanente Atri elementi dentari x x x x x x x Sede nell osso alveolare Sopracrestale x x x x Sottocrestale x Entrambe x x x Classificazione PFE Tipo I x x x x x Tipo II x x x III classe scheletrica x x x Altre anomalie dentarie Radici dilacerate Coinvolgimento di denti decidui x Agenesia x Cisti follicolari x x x x x 36

37 Paziente n.3 (B.M.): fenotipicamente sono state riscontrate le seguenti caratteristiche: III classe scheletrica e dentale sia destra che sinistra, agenesia del 12, open-bite latero-posteriore bilaterale, PFE tipo I a causa dell'infraocclusione dei seguenti elementi dentali: 54, 55, 64, 65, 74, 75, 84, 85, 16 e 26. E' stata riscontrata una variante a livello della regione regolatrice (CTCF Binding site) rs SNP c A>G presente a valle dell'esone 5 del gene. Nello stesso paziente si è riscontrata anche una frameshift deletion nell'esone 16 (position 3: ) c Del C, p.531/532. Variante rs SNP c A>G (CTCF Binding site) Frameshift deletion nell'esone 16 (position 3: ) c Del C, p.531/

38 Paziente n. 15 (B.N.): fratello del paziente n. 3, fenotipicamente sono state riscontrate le seguenti caratteristiche: III classe scheletrica e dentale sia destra che sinistra, PFE tipo I con oben-bite latero-posteriore a sinistra per infraocclusione dei seguenti elementi dentali: 54, 55, 74, 75, 84, 85, 16 e 46. Sono state riscontrate due varianti: la stessa variante presente nel fratello a livello dell'esone 5 (CTCF Binding site) rs SNP c A>G, ed una variante Sinonima che secondo studi in silico potrebbe avere valore patogenetico (position 3: ) c.1152 G>A a livello dell'esone 10 del gene. Variante rs SNP c A>G (CTCF Binding site) Variante Sinonima c.1152 G>A 38

39 Paziente n.13 (M.A.): dal punto di vista fenotipico si è riscontrata la presenza di III classe scheletrica e dentale sia destra che sinistra, contrazione arcata superiore, openbite latero-posteriore a sinistra, PFE tipo II con infraocclusione dell'elemento 36. Anche in questo paziente è stata riscontrata la stessa variante Sinonima c.1152 G>A riscontrata anche nel paziente 15. variante Sinonima c.1152 G>A 39

40 Paziente n. 25 (A.N.): le caratteristiche fenotipiche riscontrate sono state le seguenti: I classe scheletrica e dentale destra e sinistra, diastema interincisivo nell'arcata superiore, overbite aumentato, open-bite lateroposteriore bilaterale, PFE tipo I e infraocclusione dei seguenti elementi dentali: 54, 55, 64, 65, 74, 75, 84, 85, 16, 26, 36, 46. Anche in questo paziente è stata riscontrata la stessa variante Sinonima c.1152 G>A dei pazienti 13 e 15. variante Sinonima c.1152 G>A 40

41 Paziente n.18 (S.B.): le caratteristiche fenotipiche riscontrate sono: I classe scheletrica e dentale sia destra che sinistra, overjet e overbite aumentati, diastema interincisivo arcata superiore, PFE tipo II con infraocclusione dell'elemento deciduo 74. E' stata riscontrata una variante missenso, de novo, c.64 C>T p.22 A>V a livello dell esone 3 non riportata nei database dedicati. Tale variante missenso determina il cambiamento aminoacidico all'interno della proteina PTH1R, la sostituzione di un Alanina con una Valina p.22 A>V, aminoacidi con le stesse caratteristiche chimiche di carica. Tale variante cade all interno del dominio extracellulare della proteina PTH1R, coinvolto nel peptide segnale (fig.1). E stata inoltre effettuata un analisi per valutare un eventuale patogenicità di tale variante utilizzando come sistema in silico il software dedicato PolyPhen (prediction of functional effect of human nssnps) ma secondo tale sistema non cambiando la carica della proteina, la variante non viene considerata altamente patogenetica. variante missenso, de novo, c.64 C>T p.22 A>V 41

42 Paziente n.14 (V.C.): dal punto di vista fenotipico si è riscontrata con un'anomalia eruttiva coinvolgente i molari sia della dentizione decidua che permanente di entrambe le arcate (mascellare e mandibolare), per la presenza di cisti follicolari a carico degli stessi elementi dentari. I denti interessati dall'anomalia eruttiva sono i seguenti: 75, 85, 16, 26, 36, 46. In tale paziente è stata riscontrata una variante a livello dell esone 16 c.1765 T>C p.589 W>R, non riportata nei siti dedicati. Tale variante risulta particolarmente significativa in quanto determina il cambiamento aminoacidico all'interno della proteina che comporta un cambiamento nel dominio citoplasmatico della stessa, particolarmente importante per la sua funzione. variante nell'esone16 c T>C p.589 W>R. 42

43 Paziente n.32 (V.M.): fratello del paziente 14, il fenotipo risulta caratterizzato dalla presenza delle seguenti caratteristiche: overbite aumentato e classe dentale non valutabile per la presenza di un grave opebite coinvolgente i settori latero-posteriori sia del lato destro che sinistro e PFE tipo I con infraocclusione dei seguenti elementi dentari: 13, 17, 27, 34, 35, 36, 37, 38, 44, 45, 46, 47, 48. E' stata riscontrata la medesima variante nell'esone 16 c T>C p.589 W>R. variante nell'esone16 c T>C p.589 W>R. 43

44 Paziente n. 28 (D.P.C.): madre dei pazienti 14 e 32, fenotipicamente si evidenzia I classe scheletrica e dentale destra e sinistra, nessuna evidenza di PFE ma inclusione dei seguenti elementi dentali per alterato tragitto eruttivo: 13, 23 e 35. Anche in questo caso è stata riscontrata la medesima variante nell'esone 16 c T>C p.589 W>R. Variante nell'esone16 c T>C p.589 W>R. La variante missenso riscontrata nei 3 pazienti, variante familiare (riportata secondo la numerazione di ENSEMBLE in posizione 1765 T>C), determina la sostituzione di un A.a il Triptofano con un altro A.a l Arginina (p.589 W>R), aminoacidi con diverse caratteristiche chimiche; tale variante cade all interno del dominio citoplasmatico funzionale della proteina PTH1R, coinvolto nell interazione del recettore PTH1R con le proteine bersaglio, proteine G coinvolte nella cascata del segnale intracellulare. E stata inoltre effettuata un analisi per valutare il folding della proteina e l eventuale patogenicità di tale variante utilizzando come sistema in silico il software dedicato PolyPhen (prediction of functional effect of human nssnps). Si tratta di un software semplice e affidabile basato su considerazioni fisiche e comparative, che stima, mediante l utilizzo di determinate regole di base e di effetto di sostituzione, come l'impatto di un cambiamento aminoacidico influisca sulla struttura tridimensionale e sulla 44