Carlo Brera. Istituto Superiore di Sanità Reparto OGM e Xenobiotici di origine fungina. Corso di Formazione ed Aggiornamento Professionale

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1 ASL 9 Trapani Corso di Formazione ed Aggiornamento Professionale Problematiche legate alla fase analitica nella determinazione delle micotossine nei prodotti alimentari Carlo Brera Istituto Superiore di Sanità Reparto OGM e Xenobiotici di origine fungina Erice, 3-4 maggio 2006

2 Gestione del rischio Buone pratiche agricole (Codici di buona pratica) Conoscenza dell effetto del processing Piani HACCP (punti critici di controllo) Provvedimenti (legislazione, norme standard internazionali, linee guida) Controllo Ufficiale Programmi di Vigilanza e Sorveglianza Valutazione del rapporto costi/rischi/benefici Diagnostica

3 Gestione del rischio Interazioni a livello centrale (nazionale) Interazioni a livello locale (regionale)

4 A livello centrale Recepimenti normativi Emissione di linee guida Controllo ufficiale Piani di sorveglianza Validazione di metodi di analisi Proposizione di linee progettuali Corsi di formazione e aggiornamento

5 A livello locale Attuazione delle normative nazionali e comunitarie Proposizione di linee guida regionali Organizzazione di corsi di formazione e aggiornamento Interazioni con gli operatori della filiera agro-alimentare Adozione di sistemi di allerta regionali

6 Normativa L efficacia dei provvedimenti legislativi è data dalla efficacia dei controlli in termini di: distribuzione sul territorio interpretazione corretta della normativa reazioni del mondo produttivo organizzazione tra gli Enti preposti al controllo Formazione

7 REGOLAMENTO (CE) N. 882/2004 DEL PARLAMENTO EUROPEO E DEL CONSIGLIO del 29 aprile 2004 relativo ai controlli ufficiali intesi a verificare la conformità alla normativa in materia di mangimi e di alimenti e alle norme sulla salute e sul benessere degli animali campionamento per l'analisi": il prelievo di un mangime o di un alimento oppure di una qualsiasi altra sostanza (anche proveniente dall'ambiente) necessaria alla loro produzione, trasformazione e distribuzione o che interessa la salute degli animali, per verificare, mediante analisi, la conformità alla normativa in materia di mangimi e di alimenti e alle norme sulla salute degli animali;

8 Campionamento Preparazione del campione Analisi

9 Coefficiente di variabilità (%) Campionamento (kg 21,8) Sottocampionamento (g 1100) Analisi (2 aliquote) Concentrazione di aflatossine nella partita (p.p.b.) Coefficiente di variabilità connesso alle fasi di campionamento, sottocampionamento ed analisi del programma di indagine sul contenuto in aflatossine dei semi di arachide.

10 UNA RIFLESSIONE.. TLC HPLC LC-MS Piano di campionamento (solo uno!!!!) GC-MS Biosensori NIR ELISA FAST test, Test Cards PCR e altri ancora.

11 Indipendentemente dagli obiettivi, raramente in uno studio è possibile esaminare ogni singolo elemento dell'intera popolazione. (risorse economiche limitate, personale, laboratori ecc.); Pertanto, l'esame di un campione, ossia di un numero ridotto di osservazioni, invece dell'intera popolazione consente di superare i problemi ora accennati. Un campione non è altro che un sottoinsieme della popolazione. Scegliere un campione da una popolazione significa effettuare un «campionamento».

12 Anche se.. La necessità è quella di disporre di metodi rapidi che siano in grado di fornire un risultato accurato in tempi rapidi (camion in attesa, cicli produttivi in attesa, navi parcheggiate ai porti, silos posti in vincolo sanitario, ecc.)

13 Premessa Errate procedure di campionamento rappresentano la fonte di errore principale per analiti distribuiti in modo eterogeneo all interno di un lotto. L ampiezza dell errore di campionamento è di gran lunga più significativa di quella derivante dall analisi quantitativa

14 Distribuzione delle micotossine In considerazione della percentuale di contaminazione da micotossine che in media si riscontra nelle merci sfuse, che varia dall 1% al 3%, e della distribuzione estremamente eterogenea è stato calcolato un errore dovuto al campionamento pari al 90% USDA/GIPSA

15 Truck containing 20ppb aflatoxin contaminated corn Sample Size Kernels Variability (estimate) (ppb) 10.0 lbs 30, lbs 15, lbs 7, lbs 3,

16 Variabilità /Precisione Matrice Numero di semi per unità di peso Campione globale Campione globale Variabilità Grano 30 semi per grammo semi + Mais 3semi per grammo 30 kg semi Arachidi 1seme per grammo semi + Precisione

17 Campionamento: fonti di errore Basso numero dei campioni incrementali Scarsa rappresentatività dei punti di campionamento Inadeguata grandezza del campione globale

18 Metodologie per prelevare un campione La condizione è che ogni campione elementare deve avere la stessa probabilità di essere scelto (Random sampling). Campionamento statico Campionamento dinamico

19 Campionamento statico Sili + Vagoni Sacchi Confezioni

20 Campionamento dinamico Più semplice da realizzare Prelievo di campioni elementari da nastri trasportatori Utilizzo di campionatori automatici

21 Campionamento dinamico In base allo schema descritto dal Regolamento si dovranno prelevare campioni incrementali (CI) che saranno successivamente riuniti a formare un unico campione globale da destinare all analisi. Il numero di campioni incrementali dipenderà dalle dimensioni del lotto da testare e saranno prelevati ad intervalli regolari di tempo secondo la formula Durata dello scarico (in minuti) /N. di CI Secondo la formula citata, per un lotto di 40 q, si dovranno prelevare (ad es. per i cereali) minimo 40 campioni incrementali di 100 grammi ciascuno secondo frequenze di tempo costanti. Se ad es. la velocità di scarico fosse di 50 q all ora, la durata dello scarico di 40q sarebbe di 48 minuti e si dovrebbe prelevare ciascuno dei 40 CI ogni 1,2 minuti (72s). I campioni incrementali saranno riuniti a formare un campione globale di 4 kg. Il campione globale sarà omogeneizzato e macinato prima di effettuare l analisi.

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23 Campionamento statico

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33 Si passa da 10 9 chicchi a chicchi

34 NORMATIVA

35 L 70/12 - Gazzetta ufficiale dell Unione europea REGOLAMENTO (CE) N. 401/2006 DELLA COMMISSIONE del 23 febbraio 2006 relativo ai metodi di campionamento e di analisi per il controllo ufficiale dei tenori di micotossine nei prodotti alimentari

36 Metodi di campionamento per: Campo di applicazione Cereali e prodotti derivati (AFs, OTA, FT) Frutta secca ed i prodotti derivati (AFs), uva secca (OTA) Fichi secchi, Arachidi, Frutta a guscio (AFs) Spezie (AFs) Latte e prodotti lattiero-caseari, alimenti per lattanti e di proseguimento, compresi il latte per lattanti ed il latte di proseguimento (AFM 1 ) Caffè tostato e prodotti a base di caffè (OTA) Succhi di frutta (PAT), compresi i succhi d uva (OTA), i mosti d uva (OTA), il sidro (PAT) ed il vino (OTA) Prodotti solidi a base di mela, succo di mela, prodotti solidi a base di mela destinati ai lattanti ed alla prima infanzia (PAT) Alimenti per bambini, ed alimenti trasformati a base di cereali destinati ai lattanti ed alla prima infanzia (AFs, OTA, FT, PAT)

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38 Campione globale = 30 kg Campioni di laboratorio 10 kg A L I Q U O T E A L I Q U O T E Campioni incrementali N=100 Campioni di laboratorio omogeneizzati e macinati - 10 kg A L I Q U O T E Luogo dove avviene il campionamento Laboratorio

39 La procedura pertanto. individua nel laboratorio il luogo dove formare le aliquote ufficiali alla presenza dell Autorità preposta al prelievo e del delegato della Azienda prevede la stesura di due verbali, uno redatto all atto del prelievo dei campioni elementari ed un secondo all atto della formazione delle aliquote

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53 Espressione del risultato Regolamento 401/2006/CE Calcolo dei fattori di recupero Calcolo della incertezza

54 Calcolo dei fattori di recupero Il risultato analitico deve essere riportato corretto o non corretto per il recupero. Il livello di recupero deve essere riportato. Per la valutazione della conformità sarà usato il risultato analitico corretto per il recupero

55 Incertezza (approccio fit-for-purpose) nel caso di mancanza di metodi di analisi validati da prove interlaboratorio, potrà essere utilizzato il concetto di funzione di incertezza che specifica i livelli massimi di incertezza considerati come adatti allo scopo U f = [(LR/2)2+ (α x C) 2] ½ dove α=fattore numerico costante dipendente da C LR=limite di rivelazione Il risultato analitico dovrà essere espresso come X ± U (incertezza espansa) Dove U = 2U c U c = ΣU U (camp+prepcamp+anal)

56 Criteri di accettazione di un lotto Accettazione di una partita o sottopartita - Per le arachidi, i frutti a guscio, la frotta secca e il granoturco destinati alla selezione o ad altri trattamenti fisici nonché per le spezie: - accettazione, se il campione globale o la media dei sottocampioni sono conformi al limite massimo, tenendo conto dell'incertezza di misurazione e della correzione per il recupero, - rifiuto, se il campione globale o la media dei sottocampioni superano il limite massimo al di là di un ragionevole dubbio tenendo conto dell'incertezza di misurazione e della correzione per il recupero. - Per le arachidi, i frutti a guscio, la frutta secca e i cereali destinati al consumo umano diretto e i cereali, ad eccezione del granoturco, destinati ad essere selezionati o subire altri trattamenti fisici: - accettazione, SE NESSUNO DEI SOTTOCAMPIONI supera il limite massimo, tenendo conto dell'incertezza di misurazione e della correzione per il recupero, - rifiuto, se uno o più dei sottocampioni superano il limite massimo oltre un ragionevole dubbio tenendo conto dell'incertezza di misurazione e della correzione per il recupero,

57 Regolamento 406/2001/CE

58 Campionamento mangimi DM 20 aprile 1978 GU N. 165 del Mangimi alla rinfusa Campioni elementari (>4 kg) per lotti < 2,5 t 7 Per lotti > 2,5 t 20 volte il numero di t del lotto con max 40 Dimensioni del lotto in t/campioni globali 1/1 2-10/ /3 >40/4

59 Campionamento mangimi DM 20 aprile 1978 GU N. 165 del Mangimi in confezioni Dimensioni del lotto in numero di confezioni /Campioni elementari 1-4/Tutte le confezioni 5-16/4 >16/ numero di confezioni con max 40 Dimensioni del lotto in numero di confezioni/campio ni globali 1-16/ / /3 >800/4

60 Campioni finali Da ogni campione globale si ottengono campioni finali da destinare all analisi il cui peso non deve essere inferiore a 500 grammi

61 Campionamento al dettaglio

62 Regolamento 401/2006 Prelevamento al dettaglio Se il peso dei CE è superiore a 100g o 300g, il peso del CG sarà superiore a 10kg o 30kg. Se il peso di un CE è molto superiore ai 100g o 300g si apre la confezione e si prelevano 100g o 300g. Nel caso di CE da 500g o 1 kg si preleva un numero inferiore di CE purché il peso del CG sia quello previsto Se il peso del CE è inferiore a 100g o 300g e la differenza non è significativa una confezione può essere considerata come un CE Se il peso del CE è di molto inferiore a 100g o 300g un CE sarà formato da più confezioni aventi peso complessivo di 100g o 300g

63 Come prelevare l aliquota? C A M P I O N I E L E M E N T A R I Aliquote

64 DPR 26 marzo 1980, n. 327 Art. 6, 3. NORME GENERALI DA SEGUIRE PER IL PRELIEVO DEI CAMPIONI DA ANALIZZARE c) Nel caso di sostanze o prodotti non omogenei contenuti in un unico recipiente e conservati alla rinfusa, se ne prelevano quantità parziali nella parte superiore centrale e inferiore della massa, l insieme delle quantità parziali rappresentative della partita vengono riunite e mescolate per ricavare il campione per l analisi. d) Nel caso di sostanze o prodotti non omogenei contenuti in più recipienti, se ne prelevano quantità parziali da diversi recipienti scelti a caso e rappresentativi della partita; le quantità parziali prelevate vengono riunite e mescolate per ricavare il campione per l analisi. e) Nel caso di sostanze o prodotti contenuti in confezioni originali chiuse e quando la natura di tale sostanza o prodotto, e il tipo di controllo analitico da effettuare ne consentano l apertura si prelevano a caso, da un numero di confezioni rappresentative della partita, aliquote campione per l analisi. di sostanza o prodotto dalle quali, riunite e mescolate, si ricava il f) Nel caso di sostanze o prodotti contenuti in confezioni originali chiuse e quando la natura delle sostanze o prodotti, e il tipo di controllo analitico da effettuare non ne consentano l apertura si preleva a caso, dalla partita, un numero rappresentativo di confezioni per formare il campione per l analisi.

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66 Preparazione del campione: fonti di errore RAPPRESENTATIVITA Scarsa omogeneità della granulometria Dimensioni delle parti granulari

67 Preparazione del Campione Macinazione: a secco o tramite la formazione dello slurry? Ripartizione (granulometria, setacci) Quantità di campione da destinare all analisi Composizione della matrice

68 Come ridurre la varianza Aumentare la grandezza del campione Macinare più finemente (slurry) Aumentare la grandezza della aliquota Aumentare il numero delle aliquote

69 Rappresentatività 50 grammi di mais corrispondono a circa chicchi 1. L aliquota di campione, se proveniente da un campionamento correttamente effettuato, cioè tramite omogeneizzazione e macinazione del CG, conterrà un eguale numero di frammenti rappresentativi di tutti i chicchi del campione globale 2. Viceversa nel campione prelevato nella maniera non corretta sarà contenuto un numero di frammenti rappresentativi di non più di chicchi dell intero campione globale che statisticamente non configura una condizione di rappresentatività

70 Preparazione del campione Preparazione dello slurry

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73 Campione dopo slurry

74 Materiale da saggio Pistacchi senza guscio Arachidi Con guscio Tempo di sbucciatura Rapporto ponderale 60 min per 1 kg Frutto/guscio 1: min per 1 kg Frutto/guscio 1:0.4 Arachidi senza guscio Noci brasiliane 30 min per 1 kg Frutto/guscio 1:1.3 Noci con guscio 30 min per 1 kg Frutto/guscio 1:1.2 Rapporto nello slurry Matrice/acqua Tempo di preparazione dello slurry 1:1.3 5 min 1: min 1:1.2 5 min 1:1 5 min 1: min MAIS 1: min Mangimi 1: min Noci senza guscio 1:1.2 5 min

75 ANALISI

76 Allegato III Reg. 882/2004 Caratterizzazione dei metodi di analisi Criteri applicativi: Esattezza: concordanza tra il valore ottenuto ed un valore di riferimento accettato Applicabilità: matrice e campo di concentrazione Limite di Rivelazione: la più piccola concentrazione di analita che può dare una risposta significativamente diversa da quella del bianco Limite di quantificazione: la più piccola concentrazione di analita che può essere quantificata con accuratezza e precisione Precisione: accordo tra misure replicate Ripetibilità: accordo di risultati ottenuti con lo stesso metodo, sullo stesso materiale, nello stesso lab, con lo stesso operatore Riproducibilità: accordo di risultati ottenuti con lo stesso metodo, sullo stesso materiale in lab differenti con operatori differenti Recupero: rapporto espresso in % tra la concentrazione misurata e quella aggiunta inizialmente Selettività: capacità di un metodo di discriminare tra l analita che si intende misurare e le altre sostanze Robustezza: stabilità del metodo al variare delle condizioni operative Incertezza di misura: partametro associato al risultato di una misurazione che caratterizza la dispersione dei valori attorno al valore medio

77 Metodi di prova (NORMA ISO 17025) Il laboratorio deve utilizzare metodi validati compresi tra: Metodi ufficiali Metodi interni Metodi di riferimento comunitari modificati Metodi di conferma Metodi rapidi Validazione esterna e/o interna Il metodo deve essere validato prima dell utilizzo in routine, verificato per il mantenimento delle caratteristiche e sottoposto o a riesame periodico della validazione

78 Metodi Quantitativi Metodi Quantitativi Metodi cromatografici (TLC-HPLC-EC) Metodi strumentali (spettrofluorimetriafluorodensitometria)

79 Metodi di screening Metodi di screening Test biologici (colture di cellule e tessuti, prove biotossicologiche Test immunologici (RIA, ELISA, IA) Biosensori (principi ottici, onde acustiche superficiali, elettrochimici) PCR

80 Metodi di conferma Metodi di conferma Tecniche Ifenate (LC-MS, LC-MS/MS, GC- MS) - Ionizzazione con tecniche ElettroSpray, TermoSpray, Chimica. - Identificazione tramite Trappola ionica - Quantificazione tramite Triplo Quadrupolo (Sistema di rivelazione multimicotossina) Reazioni di derivatizzazione (Aflatossine, Fumonisine, Ocratossina)

81 ESTRAZIONE DEL CAMPIONE Omogeneizzare e pesare il campione Miscelare con il solvente di estrazione (acqua-metanolo) Filtrare DILUIZIONE E FILTRAZIONE Diluire un aliquota del campione estratto (acqua o PBS) Filtrare IMMUNOAFFINITÀ Passare il filtrato attraverso la colonna di immunoaffinità Lavare la colonna con opportuno solvente Eluire le micotossine con METANOLO QUANTIFICAZIONE Iniettare in HPLC

82 Schema generale per la valutazione delle micotossine per HPLC POMPA ANALITICA VALVOLA DI INIEZIONE VALVOLA A T T R I V E L A T O COLONNA CROMATOGRAFICA R E FASE 2 POMPA MOBILE REATTIVO DERIVATIZZANTE

83 Soluzioni acquose di solventi organici (Alcol metilico Acetonitrile) Soluzioni acquose di Sali alcalini (Cloruro di sodio, Bicarbonato di Sodio) Solventi alogenati (Diclorometano, Cloroformio)

84 Agitazione con UltraTurrax o Blender (3 max) Omogeneizzazione con agitatore a braccia (30-45 ) Centrifugazione

85 FILTRAZIONE Glass Microfiber (GMF) Filters Filtro a pieghe

86 Fase di purificazione IA SPE TLC

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88 Basic steps of immunoaffinity column procedure Blending, extraction and dilution of sample Filtration Passage of sample through the immunoaffinity column Washing the immunoaffinity column with distilled water Destroying the antibody with solvent and collecting the toxin in the immunoaffinity column eluate Detection (HPLC, TLC, UV Light, etc)

89 Rapid Immunoaffinity Columns for AFLATOXIN Analysis Screening & Confirmation RDT immunoaffinity columns set the international standard for performance The principle of immunoaffinity column technology The immunoaffinity column contains a monoclonal antibody which is specific to a particular mycotoxin. The sample extract containing the mycotoxin is passed through the column. The antibody isolates and concentrates the mycotoxin and retains it in the column. Passage of an eluant through the column denatures the antibody and releases the mycotoxin for analysis. BACK FLUSHING

90 Analisi quantitativa (HPLC) Fasi inverse C18 C8 - Endcapped Fasi Mobili Acqua - Acetonitrile - Alcol Metilico Flussi ml/min

91 PRE-COLONNA EMIACETALE (acido trifluoroacetico TFA) POST-COLONNA IODIO/BROMO DERIVATO

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93 Derivatizzazione post colonnna Formazione dello IODIO derivato utilizzando una soluzione satura di iodio. Formazione del BROMO derivato utilizzando: Pyridine hydrobromide perbromide (PBPB)* KOBRA CELL (formazione elettrochimica) Dissolvere 25 mg di PBPB in 500 ml di acqua. Mantenendo la soluzione al buio, la si può utilizzare per quattro giorni.

94 PRINCIPIO DELLA KOBRA CELL Il principio della tecnica consiste nel far passare nella KOBRA CELL la fase mobile contenente un sale di bromo (precursore dell agente derivatizzante) e le aflatossine; il sistema genera bromo ELETTROCHIMICAMENTE applicando un potenziale costante agli elettrodi di lavoro. Fase mobile + KBr pompa colonna KOBRA CELL R

95 DERIV. PRE-COLONNA Formazione dell emiacetale per addizione di acqua al doppio legame furanico DERIV. POST-COLONNA Soluzione satura di iodio è pompata dalla pompa B (0.7 ml/min), la reazione avviene in un tubo di Teflon termostatato (60 C) DERIV. POST-COLONNA Soluzione di PBPB (0.05mg/ml) pompata dalla pompa B (0.4ml/min) DERIV. POST-COLONNA

96 Ocratossina A Formazione dell estere metilico Formazione dell ammonio derivato Spettri di assorbimento ed emissione

97 Fumonisine Derivatizzazione con ortoftalaldeide (OPA) sciolta in una soluzione di tetraborato di sodiometanolo-mercaptoetanolo. Far reagire ed iniettare entro 3 minuti

98 Valutazione della Accuratezza MRC e/o MR Proficiency Testing Campioni artificialmente contaminati (spikes)

99 I Materiali di Riferimento Certificati sono materiali accompagnati da un documento, per il quale uno o più valori delle proprietà sono certificati da una procedura che stabilisce la loro riferibilità.

100 1. Procurano la riferibilità nelle misure chimiche 2. Danno la possibilità all analista analista di quantificare l accuratezza l dei suoi risultati 3. Sono necessari per calibrare le apparecchiature ed i metodi 4. Testano la efficienza del laboratorio 5. Sono necessari per la validazione di metodi analitici

101 Numero di riferimento T0437 T0438 T1610 e T1611 T1612 T1712 T1715 T1714 Matrice Mais Semi di girasole Succo di mela (chiaro) Purea di mela (Baby food) Succo di mela (opalescente) Caffè verde Caffè tostato Uva passa Analita Aflatossine totali (C TOT 3.66 ppb) Aflatossine totali (C TOT 3.74 ppb) Patulina Patulina Patulina Ocratossina A Ocratossina A Ocratossina A T2206 Mais Zearalenone T2207 Farina di grano DON

102 Dove acquistare i Materiali di Riferimento del FAPAS ORSELL s.r.l CARPI (Modena) Via B. Peruzzi, 26 Tel Fax rinaldi@orsell.it Dr Matteo Rinaldi

103 Criteri per la scelta di un metodo immunologico Alto Alto Numero di di campioni Necessità di di un un metodo rapido rapido di di screening quali/quantitativo Necessità di di utilizzare una una metodica facilmente adattabile a a diversi diversi tipi tipi di di matrici alimentari

104 Necessità di un metodo rapido di screening Un metodo di screening viene definito come un metodo che permette di eliminare velocemente un gran numero di campioni negativi con lo scopo di ridurre il numero di analisi da effettuare con una metodica più accurata Rapidità di esecuzione Percentuale di falsi negativi prossima allo zero Costi contenuti

105 Necessità di utilizzare una metodica facilmente adattabile a diversi tipi di matrici alimentari Applicabili a differenti matrici Verifica estrazione Interferenze legate alla matrice: legame micotossina-anticorpo lettura finale Impiego di standard positivo e negativo Partecipazione a proficiency testings

106 Fornitori kit diagnostici Diessechem Via Meucci, 61/b MILANO Tel diessefood@diessechem.com Internet: ORSELL s.r.l. Safe Food L&N srl Via B. Peruzzi, CARPI (Modena) Tel Fax rinaldi@orsell.it Dr Matteo Rinaldi Via S. Vitale, S. Vitale Baganza (PR) Tel matteo.luppi@safefood.it Internet: Dr Matteo Luppi Tecna Area Science Park - Padriciano, Trieste - Italy Tel Internet: tecna@tecnalab.com Dr Maurizio Paleologo

107 I METODI DEL PROSSIMO FUTURO Metodi multimicotossina Metodi automatici Biosensori PCR quantitativa Micro-Macro array

108 Per vostra informazione II Congresso Nazionale Le micotossine nella filiera agro alimentare Roma, ISS ottobre 2006 Proceedings del I Congresso Nazionale disponibili in forma cartacea e consultando il sito sso%20micotossine pdf Corso ISS Le problematiche delle micotossine nella filiera agroalimentare 6-7 Novembre 2006 Max Numero di partecipanti : 30

109 Ricordiamoci anche di loro.

110 Carlo Brera Istituto Superiore di Sanità Centro Nazionale per la Qualità degli Alimenti e per i Rischi Alimentari Tel Fax carlo.brera@iss.it

111 GRAZIE DELL ATTENZIONE