METODI DI ANALISI PER LA DETERMINAZIONE DELLE AFLATOSSINE NEGLI ALIMENTI

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1 METODI DI ANALISI PER LA DETERMINAZIONE DELLE AFLATOSSINE NEGLI ALIMENTI Elena Pannunzi Istituto Superiore di Sanità Centro Nazionale per la Qualità degli Alimenti e per i Rischi Alimentari Reparto OGM e Xenobiotici di Origine Fungina

2 AFLATOSSINE NUCLEO BIS-FURANO CUMARINICO SERIE B: ANELLO PENTENONICO SERIE G: ANELLO LATTONICO A SEI TERMINI AFM 1 : METABOLITA OSSIDRILATO DELLA AFB 1 SCALA DI TOSSICITÁ: AFB 1 >AFM 1 AFG 1 >AFB 2 >AFG 2

3 ALIMENTI SUSCETTIBILI DI CONTAMINAZIONE DA AFLATOSSINE ARACHIDI, PISTACCHI, FRUTTA SECCA SPEZIE CEREALI MANGIMI ALIMENTI PER L INFANZIA LATTE E FORMAGGI

4 Metodi ufficiali AOAC e CEN Micotossina Matrice Riferimento Metodo Aflatossine (AFB 1 e AF tot ) Cereali, frutta a guscio e prodotti derivati AOAC CEN EN 12955:1999 IAC-HPLC con derivatizzazione post colonna e rivelazione fluorimetrica Aflatossine (AFB 1, AFB 2, AFG 1, Mais AOAC ELISA AFG 2) Aflatossina B 1 Mangimi AOAC CEN EN ISO 17375:2006 Aflatossina B 1 Baby foods AOAC IAC-HPLC con derivatizzazione post colonna e rivelazione fluorimetrica IAC-HPLC con derivatizzazione post colonna e rivelazione fluorimetrica

5 Metodi ufficiali AOAC e CEN Micotossina Matrice Riferimento Metodo Aflatossine (AFB 1, AFB 2, AFG 1, AFG 2 ) Aflatossine Aflatossine Burro di arachidi, pasta di pistacchio, pasta di fichi, paprika Nocciole e prodotti derivati Mandorle, arachidi, pistacchi, nocciole brasiliane AOAC CEN EN 14123:2003 AOAC AOAC IAC-HPLC con derivatizzazione post colonna e rivelazione fluorimetrica HPLC con derivatizzazione fotochimica post colonna Mycosep-HPLC Aflatossine Burro di arachidi AOAC ELISA Aflatossine Arachidi e mais AOAC TLC

6 Metodi ufficiali AOAC e CEN Micotossina Matrice Riferimento Metodo Aflatossina M 1 Aflatossina M 1 Aflatossina M 1 Latte e latte in polvere Latte e latte in polvere Latte e formaggio AOAC IAC-HPLC con CEN EN ISO 14501:1999 CEN EN ISO 14675:2003 AOAC rivelazione fluorimetrica ELISA TLC

7 HPLC ELISA TLC MS VANTAGGI Eccellenti performance Bassi livelli di rivelabilità Sicurezza per l operatore Risultati rapidi Alto numero di campioni Non richiede attrezzature costose Semplice da utilizzare dopo un breve training dell operatore Fase di automatizzazione Permette determinazioni precise (per livelli superiori a 2ng/g) Costi limitati Universale Altamente sensibile e selettiva Possibilità di determinare diverse micotossine contemporaneamente Possibilità di ridurre ed eliminare la fase di clean-up SVANTAGGI Costoso Richiede addestramento dell operatore Tempi di analisi Possibilità di falsi positivi Reazioni collaterali Interferenza della matrice Precisione meno attendibile rispetto ai metodi di laboratorio jn HPLC Uso di solventi considerati pericolosi per l ambiente Costi elevati Richiede addestramento dell operatore Elevati costi di manutenzione

8 INTENSITÁ COLORAZIONE INTENSITÁ COLORAZIONE SAGGI ELISA IMMUNO-ENZIMATICI Preparazione del campione Saggio immunoenzimatico con kit Lettura al colorimetro SAGGIO DIRETTO ANTICORPO TOSSINA SAGGIO COMPETITIVO ENZIMA CONIUGATO ALLA TOSSINA TOSSINA SUBSTRATO CROMOFORO ANTICORPO-ENZIMA ANTICORPO SUBSTRATO CROMOFORO CONCENTRAZIONE TOSSINA CONCENTRAZIONE TOSSINA

9 KIT ELISA QUANTITATIVI IN COMMERCIO FORNITORE Test Kit Aflatossine Totali Range di quantificazione Limite di rivelabilità Tempo di incubazione 1-20ppb 1ppb 20min 4-40ppb 3ppb 20min Aflatossina M ppt 5ppt 130min Aflatossine Totali 1-20ppb 1ppb 15-20min Aflatossina M ppt 5ppt 120min Aflatossine Totali Aflatossina M ,5ppb 5ppb 60min 1,7-45ppb 1,7ppb 15min 5-80ppt 5ppt (latte) 50ppt (form.) 60min ppt <3670ppt 15min

10 KIT ELISA QUANTITATIVI IN COMMERCIO FORNITORE Test Kit Range di quantificazione Limite di rivelabilità Tempo di incubazione 2-80ppb (cereali) 2ppb 15min Aflatossine Totali 3-100ppb (cereali) 3ppb 40min 1-16ppb (paprica) 1ppb 50min - (qualitativo) 5ppb 3min - (qualitativo <20ppb o >20ppb 20min Charm Toxi-Test Transia Diagnostix Tepne Neogen Diffchamb Strategic Diagnostics Inc International Diagnostic Systems Elisa-Tek Vicam Idexx

11 DETERMINAZIONE SIMULTANEA LC-ESI-MS/MS DI 39 MICOTOSSINE IN CEREALI SENZA CLEAN-UP API 4000 Q trap LC-MS/MS M. Sulyok, F. Berthiller, R. Schuhmacher, R. Krska Rapid Commun. Mass Spectrom. 2006; 20:

12 IN GENERALE GLI STEPS TIPICI PER L ANALISI DELLE AFLATOSSINE SONO: ESTRAZIONE CLEAN-UP RIVELAZIONE

13 METODO PER LA DETERMINAZIONE DI AFB 1 E TOTALI IN MAIS E MANGIMI METODO INTERNO VALIDATO ESTRAZIONE: Pesare 50.0g di campione in blender + 5.0g di NaCl Estrarre con 250ml MeOH:H 2 O 80:20 (v:v) Filtrare su filtro di carta Prelevare 20ml di filtrato Diluire con 20ml di PBS* Filtrare su filtro a microfibra di vetro *Phosphate Buffered Saline ph= g di cloruro di potassio 0.20g di di-idrogenofosfato di potassio 1.16g di idrogeno fosfato disodico anidro 8.00g di cloruro di sodio in 900 ml di acqua bidistillata Portare a ph 7.4 con HCl (0,1 mol/l) o con NaOH (0,1 mol/l). Portare ad un litro con acqua bibistillata.

14 CLEAN-UP: Colonnine di immuno-affinità (IAC) INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO L estratto viene fatto passare attraverso la colonnina. La micotossina si lega al sito specifico dell anticorpo. Il materiale estraneo viene eliminato tramite lavaggio con acqua. Il legame aflatossina-anticorpo è rimosso mediante eluizione con opportuno solvente. Condizionare la colonnina di immunoaffinità con 5.0ml di PBS Passare in IAC 20ml di campione Lavare la IAC con 10ml di H 2 O Eluire con 1000 l l di MeOH per HPLC Portare a volume in matraccio da 5ml con H 2 O bidistillata

15 CLEAN-UP COLONNINE DI IMMUNO AFFINITÀ (IAC) ESTRAZIONE IN FASE SOLIDA (SPE) VANTAGGI Alta selettività accuratezza e sensibilità (anticorpi specifici) Rapido Possibilità di analisi multimicotossina SVANTAGGI Costi elevati Monouso Minore selettività

16 RIVELAZIONE: HPLC/FLUORIMETRICA Le aflatossine B 1 e G 1 non hanno gruppi che diano elevata fluorescenza naturale alla molecola. È necessaria la formazione di un derivato stabile POST/COLONNA PRE/COLONNA PBPB Derivatizzatore elettrochimico Soluzione sovrasatura di iodio cristallino UV Acido Trifluoro Acetico (TFA) Brominazione del doppio legame Iodurazione del doppio legame Derivatizzazione fotochimica Idratazione del doppio legame furanico

17 RIVELAZIONE: HPLC/FLUORIMETRICA Corsa cromatografica senza agente derivatizzante Corsa cromatografica con agente derivatizzante

18 BPB (pyridine hydrobromide perbromide) : Una soluzione di PBPB 50mg/L è pompata a 0.4ml/min da una pompa esterna nella valvola a T DERIVATIZZATORE ELETTROCHIMICO : Si fa passare nel derivatizzatore la fase mobile contenente bromuro di potassio (precursore dell agente derivatizzante). Si genera bromo ELETTROCHIMICAMENTE applicando un potenziale costante agli elettrodi di lavoro I 2 : Una soluzione satura di I 2 è pompata a 0,7ml/min in tubo di Teflon a 60 C UV: Si irradia il campione mediante lampada UV a 254nm TFA: Formazione dell emiacetale per addizione di acqua al doppio legame furanico

19 SISTEMI DI DERIVATIZZAZIONE TFA PBPB/I 2 POMPA ANALITICA COLONNA CROMATOGRAFICA VALVOLA A T T POMPA DERIVATIZZANTE VALVOLA DI INIEZIONE FASE MOBILE/ F.M. + KBr UV/DERIV. ELETTROCH. RIVELATORE

20 PBPB DERIVATIZZATORE ELETTROCHIMICO I 2 UV TFA VANTAGGI Attendibilità e ripetibilità T ambiente Brevi tempi di analisi Non è necessaria una seconda pompa Assenza di agenti derivatizzanti Attendibilità e ripetibilità Automatizzazione Non necessita di preparazione di soluzioni Non è necessaria una seconda pompa Richiede una sola pompa per HPLC SVANTAGGI Richiede seconda pompa Manutenzione e pulizia delle linee Preparazione della soluzione Costo per uno strumento dedicato Manutenzione Richiede seconda pompa e bagno termostatico Manutenzione Preparazione della soluzione di fresco Aumento dei tempi di ritenzione Leggera perdita in sensibilità Pericolosità dell acido trifluoroacetico Scarsa ripetibilità

21 METODO PER LA DETERMINAZIONE DI AFB 1, G 1, B 2, G 2 IN BURRO DI ARACHIDI, PASTA DI PISTACCHIO, PASTA DI FICHI, PAPRIKA (CEN EN 14123:2003) Pesare 50.0g di campione in blender o in beuta da 500ml + 5.0g di NaCl Estrarre con 200/300ml MeOH:H 2 O 80:20 (v:v) + 100ml n-esano in blender per 3 min o con agitatore a braccia per 30 min (paprika) Filtrare su filtro di carta Prelevare 15ml di filtrato Diluire con 90ml di PBS (Phosphate Buffered Saline ph=7.4) Filtrare su filtro a microfibra Condizionare la colonnina di immunoaffinità (I.A.C.) con 5.0ml di PBS Passare in IAC 70ml di campione Lavare la IAC con 15ml di H 2 O Eluire con 500 l l di MeOH per HPLC Portare a volume in matraccio da 5ml con H 2 O bidistillata

22 CONDIZIONI CROMATOGRAFICHE Fase mobile AcCN : MeOH : H 2 O 17 : 29 : 54 Flusso: 1 ml/min Derivatizzazione post colonna con PBPB Flusso pompa derivatizzante 0.4 ml/min V inj = 150 l Colonna C18 250x4.6 mm 5 La colonna termostatata a 40 C 1 C Spettrofluorimetro: ecc = 365nm em = 435nm Cromatogramma mais AFB1 20µg/Kg Cromatogramma pistacchi AFB1 2µg/Kg

23 PARAMETRI DEI METODI Campo di applicazione Calibrazione e linearità Limite di rivelabilità 0,10-20 µg/kg 0,10-6,60 µg/kg MAIS 0,10-4,80 µg/kg PISTACCHI 0,03 µg/kg Limite di quantificazione Incertezza espansa 0,10 µg/kg 0,76 µg/kg (AFB 1 liv. 1,58 µg/kg) Recupero (n=10) Livello di contaminazione g/kg RSD(r)% Recupero % PISTACCHI AFB 1 88% AFB 2 93% AFG 1 92% AFG 2 93% MAIS AFB 1 87% AFB 2 91% AFG 1 90% AFG 2 70% > Criteri di rendimento per le aflatossine (REG. (CE) N. 401/2006)

24 FATTORE DI RECUPERO BIANCO SPIKE PROCEDURA ANALITICA Contaminazione spike Livello di contaminazione Contaminazione bianco X 100

25 METODO PER LA DETERMINAZIONE DI AFM 1 IN LATTE E LATTE IN POLVERE (CEN EN ISO 14501:1999) Latte in polvere: ricostituire 15g con 75 ml di acqua a 50 C Latte: preriscaldare il campione a 37 C Centrifugare per 15 min a 10000rpm Eliminare lo strato superiore di grasso Filtrare e raccogliere 50 ml CLEAN-UP: Passare in IAC 50 ml di filtrato Lavare la IAC con 15 ml di H 2 O Eluire con 1000 l l di AcCN per HPLC Portare a secco Riprendere con 1 ml di AcCN:H 2 O 90:10 (v/v)

26 METODO PER LA DETERMINAZIONE DI AFM 1 NEL FORMAGGIO ESTRAZIONE: CLEAN-UP: Pesare 10.0g di campione in blender + 5g di celite Estrarre con 80ml di CH 2 Cl 2 Lavare con 40ml di CH 2 Cl 2 Filtrare su filtro di carta Evaporare il filtrato al Rotavapor Sciogliere con 1ml di MeOH, 30ml H 2 O, 50ml n-esano Trasferire in imbuto separatore Recuperare la fase acquosa sottostante Lavare la fase organica 2 volte con 10ml H 2 O e riunire le fasi acquose Passare in IAC un volume noto di fase acquosa Lavare la IAC con 15ml di H 2 O Eluire con 500 l l l di AcCN per HPLC Portare a secco Riprendere con 500 l di AcCN:H 2 O 90:10 (v/v)

27 METODO ENZIMATICO PER LA DETERMINAZIONE DI AFM 1 NEL FORMAGGIO* ESTRAZIONE: Pesare 5.0g di campione in beuta Estrarre con 50ml di soluzione di pepsina allo 0,2% in HCl 0,1N Porre in stufa o bagno ad acqua a 42 C per tutta la notte (16 ore) sotto continua agitazione Centrifugare a rpm per 10 min Eliminare il grasso Filtrare su filtro di carta a pieghe Neutralizzare con NaOH 5N CLEAN-UP: Passare in IAC un volume noto di filtrato Lavare la IAC con 5ml di H 2 O Eluire con 1000 l l di MeOH per HPLC Portare a secco Riprendere con 1000 l di AcCN:H 2 O 25:75 (v/v) *UNIVERSITÁ CATTOLICA DEL S. CUORE DI PIACENZA A. PIETRI, T. BERTUZZI, P. FORTUNATI, G. PIVA

28 CONDIZIONI CROMATOGRAFICHE Fase mobile AcCN : H 2 O 25 : 85 Flusso: 1 ml/min V inj = 150 l Colonna C18 150x4.6 mm 5 La colonna termostatata a 40 C 1 C Spettrofluorimetro: ecc = 360nm em = 435nm Cromatogramma di un campione di latte 50ng/L Cromatogramma di un campione di formaggio 300ng/Kg

29 PARAMETRI DEI METODI Campo di applicazione Calibrazione e linearità LATTE ng/l FORMAGGIO ng/Kg LATTE ng/l FORMAGGIO ng/kg Limite di rivelabilità Limite di quantificazione LATTE 3 ng/l FORMAGGIO 30ng/Kg LATTE 7 ng/l FORMAGGIO 100 ng/kg Recupero (n=10) AFM 1 LATTE: 89% FORMAGGIO: 88% Livello di contaminazione (ng/kg) Recupero % > Criteri di rendimento per la Aflatossina M 1 (REG. (CE) N. 401/2006)

30 PREPARAZIONE DELLE SOLUZIONI DI RIFERIMENTO PER DILUIZIONE DI UNA SOLUZIONE DI RIFERIMENTO CERTIFICATA PORTANDO A VOLUME NOTO UNA QUANTITÁ NOTA DI POLVERE CON TOLUENE: ACETONITRILE 90:10 PER AFB 1, AFB 2, AFG 1, AFG 2 E CON CLOROFORMIO PER AFM 1 Il titolo esatto di tale soluzione è determinato mediante lettura allo spettrofotometro UV Amax M d 100 C. C. ρ= concentrazione delle aflatossine in μg/ml A max = assorbanza alla lunghezza d onda di massimo assorbimento M= peso molecolare dell aflatossina ε = coefficiente di estinzione molare dell aflatossina d= cammino ottico in centimetri C.C. = fattore di correzione Le soluzioni di riferimento di lavoro si preparano portando a secco sotto flusso di azoto una quantità nota di soluzione di riferimento a titolo noto e riprendendo con opportuno solvente

31 INIEZIONI DI 5 LIVELLI DI STD DI AFLATOSSINA M 1 INIEZIONI DI 5 LIVELLI DI STD DI AFLATOSSINA B 1, B 2, G 1, G 2

32 CURVA DI CALIBRAZIONE AFB 1 Numero minimo di punti dalle norme ISO: 5 Livello μg/kg (MAIS) μg/kg (PISTACCHI) ,10 2 1, , , , Coefficiente di correlazione r 2 = 0,999

33 CURVA DI CALIBRAZIONE M 1 LATTE - FORMAGGIO Livello ng/l (LATTE) ng/kg(formaggio) MASSIMO FATTORE DI CONVERSIONE LATTE FORMAGGIO = 9 Coefficiente di correlazione r 2 = 0,999

34 PROCEDURA DI DECONTAMINAZIONE Rif. JAOAC Vol.48, 681 (1965) American Ind.Hyg.Assoc.J., 42, 398 (1981) IARC Sci.Publ. N. 37 (1980) La vetreria, il materiale monouso e qualsiasi utensile sia stato a contatto con matrici alimentari possibilmente contaminate o con standard, DEVE essere decontaminato con una soluzione di IPOCLORITO di SODIO allo 1% PER TUTTA LA NOTTE. Gocce accidentali sulle mani o parti del corpo devono essere trattate con la stessa soluzione di ipoclorito di sodio 1% per 10, successivamente trattate con una soluzione acquosa di acetone al 5%, infine sciacquate con abbondante acqua. I quantitativi di matrici alimentari superiori ai 2 Kg (p.e. slurry), vengono decontaminati nella stessa maniera (2L almeno di soluzione NaClO 1%);in più per facilitare il successivo smaltimento si aggiunge una quantità di segatura sufficiente per assorbire il liquido.

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36 CONFERMA DELL IDENTITÀ DELL AFLATOSSINA B 1 Spettro di assorbimento della AFB 1 Spettro di emissione della AFB 1