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1 NOVEMBRE 2005 ANNO 44 - N. 452 ISSN X Poste Italiane spa - Sped. in A.P. - D.L. 353/2003 (Conv. in L. 27/02/2004 n 46) art. 1 comma 1 DCB TO - n. 11/ I.P. CHIRIOTTI EDITORI PINEROLO - Tel Fax info@chiriottieditori.it
2 SUMMARY The aim of this work is evaluating the effect of the monovarietal olive oil storage at different temperatures as regards phenolic fraction and oxidative stability of samples. In a previous research work, the AA demonstrated that the amount of olive oil phenolic compounds significantly decreased after a storage at - 43 C for one month. It has been highlighted a positive correlation between the phenolic fraction decrease and the oxidative stability of the olive oils. However, in this experimental work the olive oil samples are stocked at 4 and -18 C and compared with reference samples stored at room temperature. As a matter of fact these temperatures can be compared to storage conditions during winter. SOMMARIO Questa sperimentazione, condotta su oli extravergini di oliva monovarietali, ha la finalità di valutare gli effetti che la conservazione dell olio, in diverse condizioni termiche, ha sulla componente fenolica e sulla stabilità dei lipidi nei confronti delle reazioni ossidative. In un nostro precedente lavoro di ricerca è stato, infatti, dimostrato come la quantità di composti fenolici presenti negli oli extravergini di oliva vada incontro ad un significativo decremento, a seguito di uno stoccaggio del prodotto alla temperatura di -43 C, seppur mantenuta per un periodo di tempo limitato (un mese) e non confrontato con un campione di controllo mantenuto a temperatura ambiente. Nell attuale piano sperimentale l olio è stato invece conservato alle temperature di 4 e -18 C, ponendo come riferimento lo stesso prodotto mantenuto a temperatura ambiente. Tali condizioni termiche risultano, infatti, più vicine a quelle che possono essere realmente raggiunte quando l olio viene conservato durante la stagione invernale. MATTEO BONOLI-CARBOGNIN - LORENZO CERRETANI* - ALESSANDRA BENDINI - TULLIA GALLINA TOSCHI - GIOVANNI LERCKER Dipartimento di Scienze degli Alimenti, Università di Bologna - Piazza Goidanich Cesena - FC - Italia * lorenzo.cerretani2@unibo.it Prove di conservazione a diversa temperatura di olio da olive monovarietali The case of monovarietal olive oil: storage test at different temperature Parole chiave: olio d oliva, stabilità ossidativa, fenoli, conservazione, temperatura Key words: olive oil, oxidative stability, phenols, storage, temperature INTRODUZIONE Durante la conservazione, nell olio avvengono alcune trasformazioni ossidative che portano ad un deterioramento qualitativo del prodotto. È stato ampiamente dimostrato come l autossidazione causi, da una parte, la perdita di importanti componenti da un punto di vista dietetico e nutrizionale (Frankel, 1980) e dall altra la formazione di sostanze nocive alla salute (Frankel, 1982; Frankel, 1985), alcune delle quali, sono anche sgradite da un punto di vista sensoriale (Solinas et al., 1985; Solinas et al., 1987). La presenza dei componenti fenolici dell olio varia durante la conservazione in relazione probabilmente a processi idrolitici e di ossidazione degli o-difenoli; uno studio più approfondito riguardo ai cambiamenti che queste sostanze subiscono nel tempo, potrebbe permettere di comprendere meglio come la qualità dell olio vergine di oliva tenda a decadere durante il suo stoccaggio (Morellò et al., 2004; Cinquanta et al., 1997). L influenza che l insaturazione, la temperatura, la luce, la presenza di metalli pro-ossidanti, la presenza di pigmenti e la pressione parziale di ossigeno hanno sul processo ossidativo, è stata studiata a lungo su substrati modello come i metil-esteri di acidi grassi insaturi verificandone il processo di autossidazione. Per quanto riguarda l impiego delle basse temperature nella conservazione di qualsiasi prodotto alimentare, è noto che la determinazione della shelf-life dipende dalle caratteristiche intrinseche del prodotto. Lo sviluppo di reazioni chimiche negli alimenti congelati è difficilmente prevedibile a causa delle transizioni di fase dei composti che cristallizzano (acqua, zuccheri, lipidi). Infatti, come conseguenza dell abbassamento della temperatura, l alta viscosità e la bassa mobilità molecolare potrebbero causare una riduzione delle velocità delle reazioni chimiche, ma, allo stesso tempo, la Industrie Alimentari - XLIV (2005) novembre 1135
3 progressiva concentrazione dei reagenti potrebbe essere responsabile dell aumento delle stesse (Fu et al., 1997). Una delle più importanti reazioni chimiche che può portare ad un decadimento della qualità durante il congelamento, è l ossidazione lipidica. Negli alimenti congelati, e quindi anche nell olio di oliva, i lipidi si trovano in fase liquida, in fase solida o in diverse emulsioni solido/liquido (Lawler et al., 1998). Il loro stato fisico dipende dalla composizione e dalle condizioni di processo durante il raffreddamento e il congelamento (Sato, 1988). La cristallizzazione degli oli e dei grassi e la successiva transizione del tipo di cristallo, potrebbe promuovere le reazioni di ossidazione; infatti Kristott (2000) suggerisce che la fase liquida, che circonda i cristalli di ghiaccio, possa contenere una alta percentuale di acidi grassi insaturi in aggiunta all ossigeno concentrato disciolto. Come ben sappiamo, entrambi questi fattori sono in grado di promuovere l ossidazione (Calligaris, 2002). L obiettivo di questo lavoro è di indagare i cambiamenti a carico della frazione fenolica dell olio di oliva durante il processo di cristallizzazione. dalle diverse piante selezionate all interno di due oliveti confinanti (AB, AC), a due differenti stadi di maturazione (I e II). Effetto tempo-temperatura sulla conservazione di oli di oliva monovarietali I quattro campioni di olio sono stati conservati con modalità differenti. L olio appena prodotto, che verrà indicato in questo studio come olio fresco, è stato sottoposto immediatamente ad analisi. Per valutare l influenza del cambiamento dello stato fisico dell olio, sui parametri analitici considerati, è stata effettuata, dopo oltre due settimane dalla produzione (previo stoccaggio a temperatura ambiente), una conservazione mediante abbassamento della temperatura a 4 C (e conseguente cristallizzazione) per ulteriori quindici giorni. Per valutare l andamento dell ossidazione dell olio nel tempo, il prodotto è stato conservato anche per un periodo di tre mesi in diverse condizioni termiche: a temperatura ambiente e a temperatura di -18 C. Gli andamenti delle temperature di conservazione sono riportati in fig. 1. Valutazione della stabilità ossidativa dei campioni di olio, mediante ossidazione forzata (Oxidative Stability Instrument) Per effettuare un confronto relativo alla loro stabilità ossidativa, i diversi campioni di olio sono stati sottoposti ad ossidazione forzata, impiegando il calore ed un flusso di aria in condizioni standardizzate e controllate. È stato scelto, basandosi su dati riportati in letteratura, di effettuare l ossidazione forzata a 110 C, con un flusso di aria di 120 ml/min. La resistenza all ossidazione viene determinata da un elettrodo che misura le variazioni di conducibilità dell acqua deionizzata nella quale giunge il flusso di aria che trasporta i prodotti volatili dell ossidazione. Attraverso questa misura, che viene effettuata in continuo, lo strumento estrapola, dalla fase iniziale dell ossidazione, a quella in cui essa assume un andamento esponenziale, il dato relativo alla fine del periodo di induzione, noto per l appunto come OSI time (Jebe et al., 1993). Per effettuare queste analisi è stato utilizzato un Oxidative Stability Instrument (OSI) ad 8 canali (Omnion, Decatur, IL, USA). MATERIALI E METODI Solventi e reagenti Tutti i solventi e reattivi utilizzati erano di grado analitico e forniti dalla Merck & Co. Inc. (Darmstadt, Germania). Gli standard erano invece stati acquistati della Fluka (Buchs, Svizzera). Campioni Questo studio è stato svolto impiegando olive della cultivar Colombaia prodotte da oliveti situati nell area di Varigotti, comune di Finale Ligure (SV). I campioni rappresentativi ed omogenei di olive sono stati raccolti, in maniera randomizzata Fig. 1 - Andamento della temperatura durante la conservazione. In blu e in fucsia il profilo termico dei campioni (prima e seconda raccolta) conservati a temperatura ambiente e a -18 C, in giallo e azzurro l andamento delle temperature dei campioni conservati a 4 C della prima (giallo) e seconda (azzurro) raccolta Industrie Alimentari - XLIV (2005) novembre
4 Determinazione dell acidità e del numero di perossido La percentuale di acidità libera ed il numero di perossido dei campioni di olio sono stati determinati in accordo con gli allegati II e III del Regolamento CEE n. 2568/91. Estrazione della frazione fenolica dall olio di oliva Il procedimento di estrazione dei componenti fenolici dall olio di oliva è stato eseguito seguendo le modalità descritte da Pirisi et al., Determinazione spettrofotometrica dei fenoli totali La determinazione dei fenoli totali nei campioni è stata effettuata mediante analisi spettrofotometrica con il reattivo di Folin-Ciacolteu, seguendo la metodica di Singleton et al., 1965 e applicando alcune modifiche (Cerretani et al., 2003). Lo spettrofotometro impiegato era un UV-Vis 1204 (Shimadzu Co., Kyoto, Giappone). Determinazione spettrofotometrica degli o-difenoli La determinazione degli o-difenoli è stata effettuata seguendo il metodo di Mateos et al., 2001, eseguendo le letture delle quattro ripetizioni di ogni campione a 370 nm. Analisi delle sostanze fenoliche mediante cromatografia liquida ad elevate prestazioni (HPLC), con rivelatore UV (DAD) e rivelatore spettrometrico di massa (ES/APCI-MSD) 10 L. Tale strumento era provvisto di: una pompa binaria ad alta pressione, un autocampionatore indicato come ASL (Automatic Liquid Sampler modello G1313A), un degasatore a membrana per la deareazione dei solventi, e, quali sistemi di rivelazione, un detector UV-VIS HP a serie di fotodiodi (DAD), ed uno spettrometro di massa HP (MSD). La colonna utilizzata era una C 18 Luna (Phenomenex Co., Aschaffenburg, Germania) della lunghezza di 250 mm, diametro interno di 3 mm e particelle di 5 m. I solventi impiegati come fase mobile sono stati filtrati su filtri in nylon, aventi una porosità di 0,45 m (Lida Manufacturing Corp., Kenosha, WI, USA). L eluizione a gradiente è stata effettuata impiegando le seguenti fasi mobili: fase mobile A, costituita da acqua/acido formico, 99,5:0,5 (v/v), mentre la fase mobile B era CH 3 CN al 100%. Il flusso era di 0,5 ml/min. Il gradiente di eluizione è riportato in Cerretani et al. (2005). Il segnale acquisito mediante il DAD è stato registrato a 280 nm, lunghezza d onda alla quale è stata eseguita la quantificazione degli analiti (rispetto all acido 3,4-diidrossifenilacetico). La rivelazione effettuata mediante lo spettrometro di massa, invece, è stata impiegata unicamente a fini identificativi e prevedeva l utilizzo della sorgente ElectroSpray (API-ES), in modalità positiva e quella a ionizzazione chimica (APCI), in modalità negativa. Determinazione dell attività antiradicalica degli estratti fenolici mediante test del DPPH e test del ABTS - Il procedimento seguito per questi due test era di Kim D.O. et al., 2002, mentre lo spettrofotometro utilizzato era sempre l UV-VIS 1204 (Shimadzu Co., Kyoto, Giappone). RISULTATI E DISCUSSIONE In tab. 1 vengono riportati i valori delle diverse analisi effettuate sui campioni di olio ligure. Ogni valore è la media di quattro ripetizioni. È possibile notare graficamente (fig. 2) come l acidità L estratto fenolico relativo ai campioni (Pirisi et al., 2000) è stato iniettato in HPLC (HP Serie 1100, Agilent Techologies, Palo Alto, CA, USA), nel volume di Fig. 2 - Valori di acidità libera (% acido oleico) negli oli campionati; confronto fra oli freschi (in verde), oli conservati per tre mesi a -18 C (in verde acqua) e a temperatura ambiente (in arancio). ABI e ACI, campioni di olio da olive raccolte il 21 ottobre 2003; ABII e ACII, campioni di olio da olive raccolte il 5 novembre Industrie Alimentari - XLIV (2005) novembre 1137
5 tenda ad aumentare durante la conservazione, sia a temperatura ambiente che a -18 C, tanto che per un campione dei quattro (ACII) tale valore supera il limite consentito dal regolamento CEE 2568/91 (e successive modifiche) per la categoria merceologica di olio extravergine di oliva. Quest ultimo andamento è probabilmente il frutto della presenza di piccole quantità di acqua di vegetazione residue nell olio a causa di una separazione non completamente efficiente; gli enzimi presenti nella fase acquosa possono infatti determinare fenomeni idrolitici a carico dei trigliceridi. La determinazione del numero di perossido (fig. 3), in linea con la precedente, mostra un aumento di tale parametro passando da olio fresco, a quello conservato a -18 C per tre mesi, a quello conservato per lo stesso periodo ma a temperatura Tabella 1 - Valori delle diverse analisi effettuate sui quattro campioni di olio ligure. ABI e ACI, campioni di olio da olive a-d raccolte il 21 ottobre 2003; ABII e ACII, campioni di olio da olive raccolte il 5 novembre 2003; NV, non valutato. Lettere differenti per lo stesso tipo di campione indicano una differenza significativa (test HSD di Tukey con p<0,05). OSI Time Fenoli Totali o-difenoli Fenoli Totali in HPLC ABI fresco 13,60 a 296,50 a 97,61 a 6.175,99±605,20 ABI 15 giorni a 4 C 11,39 b 162,35 c 30,71 b 5.181,38±460,65 ABI 3 mesi a -18 C 10,42 c 171,01 c 44,27 b 5.215,29±425,98 ABI 3 mesi a Tamb 6,95 d 213,94 b 33,00 b NV ACI fresco 13,95 a 368,00 a 95,64 a 6.842,95±871,28 ACI 15 giorni a 4 C 10,74 b 210,86 b 90,74 a 6.630,84±425,75 ACI 3 mesi a -18 C 9,62 c 235,62 b 115,47 a 5.194,01±386,03 ACI 3 mesi a Tamb 6,04 d 226,47 b 31,02 b NV ABII fresco 21,85 a 383,61 a 152,80 a 6.673,47±694,57 ABII 15 giorni a 4 C 15,85 b 220,61 c 46,93 c 6.257,39±746,70 ABII 3 mesi a -18 C 15,75 b 318,48 b 112,65 b 7.212,48±975,50 ABII 3 mesi a Tamb 8,74 c 234,06 c 26,54 c NV ACII fresco 22,48 a 510,79 a 191,04 a 8.998,18±1.204,48 ACII 15 giorni a 4 C 16,56 b 272,02 b 110,89 b 8.106,07±1.625,22 ACII 3 mesi a -18 C 15,09 c 337,71 b 108,30 b 8.869,01±600,90 ACII 3 mesi a Tamb 8,80 d 272,15 b 45,21 c NV Acidità libera N. Perossido (meq Test DPPH mmoli Test ABTS - mmoli (ac. oleico %) O 2 /kg olio) Teac/kg olio Teac/kg olio ABI fresco 0,21 b 7,30 b 0,44 a 1,69 a ABI 15 giorni a 4 C NV NV 0,26 b 1,93 a ABI 3 mesi a -18 C 0,28 a 7,82 b 0,16 c 0,60 b ABI 3 mesi a Tamb 0,28 a 14,10 a 0,16 c 0,68 b ACI fresco 0,36 c 7,43 b 0,88 a 2,34 a ACI 15 giorni a 4 C NV NV 0,53 b 2,31 a ACI 3 mesi a -18 C 0,41 b 6,01 c 0,41 b 0,89 b ACI 3 mesi a Tamb 0,48 a 15,28 a 0,15 c 0,36 c ABII fresco 0,30 c 7,50 c 1,02 a 2,49 a ABII 15 giorni a 4 C NV NV 0,75 b 2,69 a ABII 3 mesi a -18 C 0,67 a 12,15 b 0,88 a,b 1,73 b ABII 3 mesi a Tamb 0,58 b 20,93 a 0,45 c 0,67 c ACII fresco 0,50 c 8,80 c 1,53 a 2,96 b ACII 15 giorni a 4 C NV NV 1,25 a 3,32 a ACII 3 mesi a -18 C 0,99 b 16,07 b 1,31 a 2,18 c ACII 3 mesi a Tamb 1,05 a,b 21,73 a 0,39 b 0,77 d 1138 Industrie Alimentari - XLIV (2005) novembre
6 Fig. 3 - Valori del numero di perossido, espressi in meq O 2 /kg di olio, negli oli vergini di oliva, in funzione delle modalità di conservazione. ABI e ACI, campioni di olio da olive raccolte il 21 ottobre 2003; ABII e ACII, campioni di olio da olive raccolte il 5 novembre ambiente. Anche per questo parametro il campione ACII superava i limiti consentiti dalla legge per la denominazione di olio extravergine di oliva. Mediante l utilizzo di uno strumento in grado di accelerare l ossidazione della sostanza grassa (Oxidative Stability Instrument), è stata valutata l influenza delle diverse modalità di conservazione, oggetto di questo studio, sulla stabilità dell olio. Dai dati riportati in tab. 1 e fig. 4 appare evidente come la cristallizzazione a 4 C sia associata ad un decremento statisticamente significativo della stabilità ossidativa, rispetto a quella dell olio appena prodotto (fresco). Per gli stessi oli è stata valutata l influenza della conservazione a -18 C per tre mesi, confrontandoli con gli stessi campioni stoccati a temperatura ambiente per un ugual periodo di tempo. Anche in questo caso la diminuzione di stabilità ossidativa appare significativa. I fenoli totali, misurati spettrofotometricamente, mostravano un calo significativo solo se si confronta l olio fresco con quello conservato (nelle diverse modalità). Per quanto riguarda i diversi tipi di conservazione, non si è riscontrato per i fenoli totali un anda- mento univoco per i quattro campioni considerati (tab. 1). Gli o-difenoli possono essere considerati tra i composti a struttura fenolica in grado di esplicare la maggiore attività antiossidante negli oli extravergini di oliva (Gallina Toschi et al., 2005). Il loro andamento nei campioni analizzati segue tendenzialmente quello dei fenoli totali; per tre campioni su quattro (ABI, ABII, ACII) si è assistito ad una significativa diminuzione del contenuto in o-difenoli comparando l olio fresco con quello conservato nelle diverse modalità. Per quanto riguarda il campione ACI, la sostanziale stabilità del dato è attribuibile all elevata variabilità analitica. Per valutare la resistenza nei confronti dei processi ossidativi, nei campioni di olio oggetto di questo studio, sono stati applicati tre differenti metodi analitici, l Oxidative Stability Instrument ed i test antiradicalici dell ABTS - e del DPPH. I dati relativi all Oxidative Stability Instrument evidenziano la resistenza all ossidazione dell olio connessa sia alla presenza dei componenti antiossidanti che alla stabilità intrinseca determinata dal grado di insaturazione della matrice lipidica; i test antiradicalici valutano, invece, l attività radical scavenger propria della frazione fenolica estratta dall olio. Dalla tab. 1 si nota come il test dell ABTS - non mostri una significativa variazione fra l olio fresco e quello conservato 15 giorni a 4 C, tuttavia confrontando il Fig. 4 - Confronto tra i valori di stabilità ossidativa (OSI time), espressi in ore, negli oli vergini di oliva, in funzione delle modalità di conservazione. ABI e ACI, campioni di olio da olive raccolte il 21 ottobre 2003; ABII e ACII, campioni di olio da olive raccolte il 5 novembre Industrie Alimentari - XLIV (2005) novembre 1139
7 fresco con il conservato a tre mesi alle diverse temperature, si evince come le differenze siano sostanziali e significative; e quindi come l abbattimento della temperatura (4 C) abbia determinato un abbassamento del potere antiossidante della frazione fenolica, così come anche la conservazione protratta nel tempo ed in maggior misura per quella effettuata a temperatura ambiente (invece che a -18 C). Il test del DPPH (tab. 1) evidenzia maggiormente le differenze del confronto fra olio fresco e olio conservato 15 giorni a 4 C e fra olio conservato a -18 C rispetto a quello mantenuto a temperatura ambiente per lo stesso periodo (3 mesi). Il profilo fenolico quali-quantitativo relativo ai campioni di olio permette di individuare le influenze esercitate dalle diverse modalità di conservazione su tale frazione. Nella tab. 1 è riportato il contenuto in fenoli totali quantificato mediante HPLC. Come mostrato dai dati in tabella e dalla fig. 5, appare evidente la tendenza alla diminuzione delle sostanze fenoliche in seguito alla conservazione a 4 C, rispetto ai campioni appena prodotti (Freschi). D altra parte, la conservazione a -18 C seppur protratta per un tempo superiore (tre mesi), non sembra inficiare tali contenuti. CONCLUSIONI I valori di acidità libera ed il numero di perossido degli oli appena prodotti rientravano largamente all interno dei limiti stabiliti dal Reg. CEE 2568/91 e successive modifiche. Entrambi i parametri valutati subivano un aumento significativo in seguito a conservazione a -18 C, per tre mesi, anche se meno marcato rispetto a quello relativo alla conservazione a temperatura ambiente. Per quanto riguarda invece la conservazione dei campioni di olio a 4 C è apparso evidente un significativo decremento della stabilità ossidativa (misurata tramite Oxidative Stability Instrument) rispetto ai campioni appena prodotti. Il decremento dell OSI time Fig. 5 - Quantificazione (mg/kg di olio espressa in acido 3,4-diidrossifenilacetico) mediante analisi HPLC con rivelazione con serie di fotodiodi (DAD) alla lunghezza d onda di 280 nm, dei fenoli totali, nei quattro campioni considerati, in funzione delle diverse modalità di conservazione. Poli, curva polinomiale. ABI e ACI, campioni di olio da olive raccolte il 21 ottobre 2003; ABII e ACII, campioni di olio da olive raccolte il 5 novembre arrivava a superare addirittura il 50%, quando si paragonavano i valori relativi all olio fresco e a quello conservato per tre mesi, a temperatura ambiente. Anche il confronto tra la conservazione per tre mesi a -18 C e a temperatura ambiente faceva registrare una significativa flessione della stabilità ossidativa a scapito di quest ultima seppur in modo meno consistente (35%). La conservazione dell olio a bassa temperatura può quindi influire positivamente rallentando le cinetiche delle reazioni ossidative. Il contenuto in fenoli totali, valutati per via spettrofotometrica, rispecchiava l andamento osservato per le prove di stabilità ossidativa (correlazione di Pearson r=0,77 con p<0,001); la stessa tendenza si aveva per gli o-difenoli, valutati con la stessa tecnica. Per quanto concerne le determinazioni dell attività antiradicalica, eseguite sulla frazione fenolica, degli oli oggetto di studio, il test del DPPH, rispetto all ABTS - forniva un andamento complessivamente in linea con quello mostrato dall OSI (correlazione di Pearson r=0,81 con p=0,001). Il profilo fenolico quali-quantitativo valutato mediante HPLC-DAD-MSD, ha messo in luce un calo sostanziale, soprattutto dei fenoli semplici, in seguito alla conservazione a bassa temperatura. In generale, è stato evidenziato come la conservazione a bassa temperatura, a causa di cambiamenti dello stato fisico, determini un abbattimento significativo della componente fenolica e quindi della resistenza all ossidazione dell olio (confrontando l olio appena prodotto con quello posto a 4 C). Se, tuttavia, gli effetti dovuti all abbattimento della temperatura che possono essere ipotizzati sono due, che agiscono in modo contrario, dai risultati ottenuti appare chiaro come, prolungando la conservazione, quello di rallentamento dell ossidazione delle sostanze antiossidanti prevalga sulla perdita generata, a loro carico, all inizio dal cambiamento dello stato fisico. BIBLIOGRAFIA 1) Regolamento (CEE) n. 2568/91 della Commissione, 11 luglio 1991, relativo alle caratteristiche degli oli d oliva e degli oli 1140 Industrie Alimentari - XLIV (2005) novembre
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