Cryptococcus e Criptococcosi

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1 !"#$%&$' $' ()*+, -../ Cryptococcus e Criptococcosi Dr. Gabriella Pini Dipartimento di Sanità Pubblica sez. Microbiologia Università degli Studi di Firenze Cryptococcus e Criptococcosi : Storia 1894:Sanfelice in succo di pescasaccaromyces 1894: Busse (Buschke) da lesione umanas. hominis 1901: Vuillemingenere Cryptococcus 1914: Versepubblicazione primo caso meningoencefalite 1950 e anni successivi accordo sul nome C. Inquadramento Tassonomico Principali caratteristiche del genere Cryptococcus Utilizzo non fermentativo degli idrati di carbonio Assimilazione di Inositolo Produzione di ureasi Forma sessuata in vitro Filobasiella Basidiomicete 39 Specie conosciute Cryptococcus unica specie riconosciuta come patogena Rare segnalazioni per C. albidus, C. curvatus e C. laurentii Basidi con basidiospore Riproduzione sessuata osservata soltanto in vitro fra mating-type diversi (a e ) Caratteristiche Morfologiche Budding yeast Cryptococcus Cellule lievitiformi, ovali o rotonde, spesso gemmanti (ellittiche nella var. gattii) Dimensioni 3-8 micrometri di diametro Capsula polisaccaridica di 5-20 micrometri di spessore 1

2 Caratteristiche della Capsula Aspetto morfologico su Corn Meal Agar o Sabouraud Agar Colonie convesse bianco crema X400 Cellule rotonde spesso gemmanti, assenza di pseudoife, cellule distanziate fra di loro ad indicare la presenza della capsula che non è visibile Stipite isolato da CSF Composizione chimica Glucoronoxilmannano(GXM) 90% Galattoxilmannano (GalXM) Mannanoproteina (MP) Effetti sul sistema immunitario Protezione dalla fagocitosi Interferenza con la risposta di tipo infiammatorio Inibizione diretta della migrazione dei leucociti Riduzione della proliferazione linfocitaria Fattore di virulenza Altre Caratteristiche Proprietà biochimiche varietà varietà gattii varietà grubii Sierotipi (storicamente anticorpi policlonali di coniglio) Varietà di C. Stato Sessuato (osservato soltanto in vitro ) D Filobasidiella var. B e C gattii Filobasidiella var. bacillispora A grubii Filobasidiella var. Sensibilità alla canavanina (CGB medium) Canavanina-Glicina- Blu di bromotimolo Assimilazione della glicina (CGB o GCP medium) Glicina- Cicloeximide-rosso Phenol Assimilazione della timina (CDBT medium) Creatinina-Destrosio-Blu di bromotimolo-timina Assimilazione della D-prolina si no si (cambiamento colore arancio) no no si si (cambiamento colore bluverde) si si no no no Ecologia delle Varietà di Cryptococcus Varietà sul terreno GCP (Salkin e Hurd) A-D Cryptococcus var B-C Cryptococcus var gattii Varietà Habitat Distribuzione geografica Sierotipo D Suolo contaminato con guano di piccioni e di altri uccelli Mondiale (predominante in Europa) gattii Sierotipo B e C Alberi di eucalipto (legno in decomposizione) Area tropicale e sub-tropicale grubii Sierotipo A Suolo contaminato con guano di piccioni e di altri uccelli Mondiale 2

3 Fino agli anni 80 Comparsa HIV+ Criptococcosi Umana malattia ubiquitaria e sporadica malattia opportunistica con prevalenza del 2-10% in Europa e USA, superiore al 15% in Africa e Sud-Est asiatico Criptococcosi Umana Situazione attuale Nei paesi sviluppati diminuzione dell incidenza della criptococcosi fra i pazienti AIDS per la profilassi con fluconazolo e HAART Aumento dell incidenza della malattia nei paesi dove gli individui HIV+ non hanno la possibilità di accedere a profilassi e HAART Letalità 3-20% negli HIV+ 0-12% negli HIV- (12%: Pappas, Perfect; 2001) Fra i soggetti HIV- nessuna variazione significativa dell incidenza della malattia (0,5-5 casi per milione di abitanti) Fattori di Rischio per la Criptococcosi Infezione da HIV Corticosteroidi (prednisone >20mg) Trapianti di organo Linfomi, leucemie croniche, cancro polmonare Malattia polmonare cronica ostruttiva Diabete Sarcoidosi, cirrosi, Lupus erythemat. sistemico Artrite reumatoide, gravidanza Forma cronica Manifestazioni Cliniche Forme polmonari Spesso asintomatica può dare noduli o masse, cavità, linfoadenopatia Infezione acuta Rara, più frequente nei pazienti AIDS Si presenta con febbre, tosse, dispnea Sistema Nervoso Centrale Manifestazioni Cliniche Forme disseminate Meningoencefalite, raramente masse fungine intracerebrali singole o multiple (Alterazioni psichiche) Cute Lesioni poco doloranti tipo papule, placche, ulcere, masse sottocutanee Altro Endoftalmite, corioretinite, congiuntivite, otite, sinusite, miocardite, pericardite, epatite, artrite, endocardite, gastroduodenite, colecistite, peritonite, ascessi renali, osteomielite, linfoadenite, prostatite Radiografia polmonare: infezione criptococcica, lobo superiore destro 3

4 Risonanza magnetica del cervello: visibili diverse masse bianche corrispondenti a criptococcomi Lesione nodulare cutanea Papule sul volto Lesioni cutanee ulcerate in individui HIV+ A large tumour-like plaque with central ulceration and small satellite papulonodular lesions resembling those of molluscum contagiosum. Cutaneous Cryptococcus laurentii infection in a immunodeficiency virus-negative patient Diagnostica di Laboratorio Esame diretto dei campioni Metodi colturali Indagini sierologiche Preparati a fresco Istopatologia Ricerca di anticorpi Ricerca di antigeni Sonde specifiche Amplificazione genomica mediante PCR o nested-pcr 4

5 Esame Diretto dei Campioni Esame microscopico del liquor con Inchiostro di China Sensibilità: 80% in pazienti HIV+ 50% in pazienti HIV- ( cellule/ml) Vantaggi: Test rapido e semplice Svantaggi: sensibilità limitata soprattutto in HIVfalsi positivi persistenza della positività ( lieviti scarsamente capsulati) Istopatologia Colorazioni aspecifiche: Papanicolau, Ematossilina-Eosina Colorazioni specifiche: Calcofluor white (chitina) impregnazione argentica (Gomori) Colorazioni per la capsula: Mucicarminio acido periodico-schiff.. Utile per lesioni localizzate soprattutto cute e polmone L esame dell aspirato percutaneo di noduli polmonari o del BAL può esser utile per la diagnosi precoce in AIDS Polmone: Criptococchi con grossa capsula Cellule lievito capsulate in tessuto cerebrale Colorazione Mucicarminio 5

6 Tessuto cerebrale: impregnazione argentica secondo Gomori Metodi colturali Optimum di temperatura di sviluppo 37 C o leggermente inferiore (non tollera temperature superiori a 40 C) ph del terreno 5-7 (non tollera ph superiore a 7,6) Histological picture (periodic acid-schiff staining) showing numerous organisms in the cystic formations (gelatinous form); the yeast cells stained positively red. Tempo minimo di incubazione 48 ore (superiore per la var. gattii) Colonie bianco crema convesse tendenti a scurire col tempo, possono avere anche aspetto mucoso se gli stipiti sono dotati di grossa capsula Vecchia coltura su SDA Coltura di 48 ore su SDA Metodi colturali Coltura di CSF Sensibilità: CFU/ml di CSF Normali terreni per micologia come Sabouraud dextrose agar Emocoltura Sensibilità: scarsa in HIV-, 35-68% in HIV+ Con metodi radiometrici (BACTEC) è consigliato subcolturare La lisicentrifugazione aumenta la sensibilità 6

7 Metodi colturali Altri materiali (escreato, urine ecc.) Sensibilità: scarsa ( escreato spesso negativo anche in caso di criptococcosi polmonare) E consigliato l uso del terreno di Staib all estratto di semi di Guzotia abissinica (colonie brune) per differenziare da altri lieviti E utile l aggiunta di antibatterici ma non di cicloeximide che lo inibisce Identificazione presuntiva Aspetto e colore delle colonie Osservazione microscopica di lieviti capsulati (da HIV+ sono stati isolati lieviti privi di capsula o con capsula molto sottile) Crescita a 37 C Produzione di ureasi (sono descritti casi dovuti a ceppi ureasi negativi) Sviluppo di colonie brune su Staib-agar (Produzione di fenolossidasi) Identificazione di specie Determinazione del profilo biochimico di assimilazione delle fonti di azoto e di carbonio Micrometodi commerciali che impiegano test biochimici convenzionali opportunamente modificati. Tempo minimo di incubazione 24 ore ID 32C e API 20C AUX (Bio Mérieux) Minitek System (BBL) Auxacolor (Bio Rad) Fungichrom I e Fungifast I Twin (International Microbio, distrib. DID) Vitek Yeast Biochemical Card, sistema automatizzato (Bio Mérieux) Identificazione di specie Determinazione del profilo biochimico di assimilazione delle fonti di azoto e di carbonio Ricerca di enzimi preformati mediante substrati cromogeni. Tempo di incubazione medio 4 ore Microscan rapid Yeast Identification Fongiscreen 4H (Bio Rad) RapID Yeast Plus system Remel distribuito da DID Sonde genomiche Identificazione di specie Sonda a DNA marcata con estere di acridinio che emette un segnale chemioluminescente, specifica per rrna (AccuProbe Bio Mérieux) 100% di sensibilità e specificità partendo da una sola colonia prelevata dalla coltura (1993) 7

8 Metodi basati su PCR Identificazione di specie Multiplex-PCR con set di primer per le regioni ITS (Internal Trascribed Spacer) del gene per rrna delle più comuni specie fungine responsabili di micosi profonde, (CN4 e CN5 per C.) 100% sensibilità e specificità (Luo, Mitchell, 2002) Multiplex-PCR con primer per la regione ITS1 fra il gene per rrna 18S e 5,8S per identificare lieviti in emocolture positive, 100% specificità, 97% sensibilità (Chang et al., 2001) Identificazione di specie Metodi basati su PCR Multiplex-PCR con reverse primer universale per funghi (regione 26S rrna) e 8 forward primers per le regioni ITS 1 e 2 (Internal Trascribed Spacer) del gene per rrna specifici per le più comuni specie di Candida e C. (CN) Utilizzata per l identificazione di miceti in emocolrure positive Identificazione in 6 ore Li YL et al, 2003 Sierotipizzazione Non rilevante per la diagnosi Iportante per studi epidemiologici Crypto Check Kit (Iatron Laboratories, Tokio) Impiega anticorpi monoclonali diretti contro gli antigeni capsulari Altri metodi sperimentali es. sierotipizzazione basata sull analisi diretta del supernatante colturale con la tecnica dot enzyme assay (Belay et al., 1996) Sierologia Agglutinazione al latex Ricerca di anticorpi Ricerca di antigeni SIERO CSF Fluidi polmonari Urine Molto usata a scopo diagnostico Possibile ma poco utile a scopo diagnostico Agglutinazione al Latex Metodi immunoenzimatici Ricerca antigene polisaccaridico capsulare solubile mediante ac specifici che ricoprono particelle di lattice Diagnosi rapida di criptococcosi Sensibilità e Specificità % per CSF 83-97% per siero Sensibilità inferiore per altri materiali (rileva in media 10ng di polisaccaride per ml di fluido) (Bloomfield et al.1963) 8

9 Kit diagnostici commerciali Latex-Crypto antigen detection system IMMY, Immuno-Mycologics, Norman, OK, USA Pastorex Cryptoplus Bio-Rad (solo sierotipi A e D) Calas Cryptococcal Ag Latex Agglutin. System Meridian Bioscience Europe CryptoLA Wampole, USA, distribuito da Bouty Serodirect Eiken Cryptococcus Eiken Chemical; Tokyo, Japan Kit diagnostici commerciali Murex Cryptococcus Remel, USA, distribuito da DID Possibili cause di risultati falsi positivi Fattore reumatoide Infezioni da Trichosporon spp ed altri microrganismi cross-reagenti col polisaccaride criptococcico (Stomatococcus mucilaginosus) Contaminazione con frammenti di agar o con talco dei guanti Lavaggio di vetrini con sapone o disinfettanti Uso di idrossietilamido (HES) a basso peso molecolare per ricostituire il volume intravascolare Pretrattamenti per ridurre il numero di risultati falsi positivi Agenti riducenti (2--mercaptoetanolo) Bollitura per 5 minuti con EDTA Enzimi proteolotici (Pronasi) (In genere sono necessari per il siero, raramente per CSF) Possibili cause di risultati falsi negativi Effetto prozona Presenza di immunocomplessi Bassa carica micotica Infezione dovuta a stipiti scarsamente capsulati Test effettuato nelle fasi molto precoci dell infezione Pretrattamenti per ridurre il numero di risultati falsi negativi Diluizione del siero per eliminare l effetto prozona Stessi trattamenti indicati per ridurre i falsi positivi 9

10 Test Immunoenzimatici Premier Cryptococcal Antigen Meridian Bioscience Europe Ricerca l antigene glucuronoxilmannano in siero e CSF madiante ac monoclonali Test Immunoenzimatici Non presenta effetto prozona Non dà falsi positivi con fattore reumatoide Non necessita di trattamento con pronasi Ha sensibilità maggiore rispetto ad agglutinazione al Latex Ha la stessa specificità di agglutinazione al Latex Sonde genomiche Sonda a DNA per rrna (AccuProbe Bio Mérieux) 100% di specificità; usata raramente per ricerca del fungo nei tessuti Sonde a DNA specifiche per la sequenza di rrna 18S e 28S di 5 microrganismi lievitiformi in sezioni di tessuti inclusi in paraffina; specificità 100% sensibilità 83% < di GMS (96%) (Hayden et al. 2001) Altre sonde con specificità per la specie, la varietà o il sierotipo sono riportate in letteratura ma non sono descritte le loro applicazioni in diagnostica Metodi basati su PCR con primer panfungini Primer omologhi a una sequenza del gene 28S dell rrna, identificazione degli ampliconi mediante sonde specie-specifiche per la regione variabile di questo gene, utilizzato per campioni di sangue venoso. Sensibilità 2-10 cellule/ml di sangue (Evertsson et al. 2000) Primer panfungini per regione ITS, cattura dell amplificato con sonde specifiche e identificazione con sequenziatore automatico, tecnica utilizzata per campioni di tessuto. (Hendolin et al. 2000) Metodi basati su PCR con primer panfungini primer per il frammento ERG11 del gene della lanosterolo 14-dimetilasi (citocromo P-450); identificazione dell amplificato con sonde specie-specifiche, tecnica utilizzata per siero e CSF. Sensibilità 20fg, equivalente a due cellule. Posteraro et al Metodi basati su PCR con Primer specie-specifici PCR semplice Primer CPL1 e CPR4 specifici per il gene di 18S rrna sensibilità di 1pg corrispondente a 5 cellule/ml di CSF specificità 100% (Prariychatigul et al. 1996) Nested PCR Primer ITS1 e CN-4 primo step primer CN-5 e CN-6 secondo step sensibilità 10 cellule/ml di CSF specificità 100% (Rappelli et al. 1998) 10

11 Metodi basati su PCR con Primer specie-specifici PCR semplice Primer CN4 ecn5 specifici per i 4 sierotipi Specificità 100% Sensibilità 1 cellula/ml di CSF Abbinata ad un metodo di estrazione rapido ed efficace come quello con guanidina tiocianato può aumentare l efficienza diagnostica quando le tecniche convenzionali risultano inadeguate (Paschoal 2004) Vantaggi Svantaggi Elevata sensibilità Stadio sperimentale scopi epidemiologici Variabilità genomica intraspecifica sorgente di infezione catena infettiva riattivazione reinfezione Elevata specificità Rappresenta molto probabilmente il futuro della diagnostica Costi elevati Mancanza di metodi standard riconosciuti a livello internazionale Metodiche: RAPD PCR-fingerprintig cariotipaggio sequenziamento.. Dimostrata in: P. carinii C. albicans C. A. fumigatus... scopi epidemiologici PCR fingerprinting Sequenze semplici ripetute (GACA) 4 o parte minisatellite fago M13 Dimensioni: > 10 nucleotidi Originariamente usate come sonde per rilevare sequenze ipervariabili e ripetute (minisatellite e microsatellite) in vari campioni di DNA Utilizzabili come singoli primers in reazioni PCR per generare differenti profili elettroforetici Temperatura di annealing 50 C Caratterizzazione intraspecifica C. Pini G. e coll - J. Micol. Méd Amplificazione di tutti gli stipiti: bande comprese fra 1976 e 435 pb Presenza della banda A: distingue il sierotipo A dal D Bande A, D, F, N, O, P identificano10 profili: 7 per il sierotipo A e 3 per il sierotipo B Contributo epidemiologico 11

12 Caratterizzazione intraspecifica C. CONTRIBUTO EPIDEMIOLOGICO Pini G. e coll - J. Micol. Méd Medical Mycology 2001 Profili identici di stipiti isolati contemporaneamente dallo stesso paziente Profili identici di stipiti isolati dallo stesso paziente in tempi diversi: riattivazioine dell infezione? Profili diversi di stipiti isolati dallo stesso paziente in tempi diversi: reinfezione ambientale? Profili identici di stipiti isolati dal paziente e dall ambiente: catena epidemiologica! Pini G. e coll - Medical Mycology