Raffinamento Cristallografico e Validazione A.A Marco Nardini Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie Università di Milano

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1 Raffinamento Cristallografico e Validazione A.A Marco Nardini Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie Università di Milano

2 Cristalli Raffinamento Data collection ρ (x,y,z) Modello molecolare Fasi approssimate MR, MIRAS, SIRAS, MAD Density modification Validazione e PDB

3 Una volta ottenuto un primo insieme di fasi (α P ) hkl da associare ai moduli dei fattori di struttura (F P ) hkl con il metodo MIR, SIRAS, MIRAS, MAD, o MR, è possibile calcolare una prima mappa di densità elettronica ρ(x,y,z). Il passo successivo è l interpretazione di tale mappa in termini della catena polipeptidica. Se si riesce a tracciare la maggior parte della catena polipeptidica nella mappa di densità elettronica, si può cominciare il raffinamento della struttura. Talvolta, però, la qualità della mappa di densità elettronica è tale da impedire di tracciare in modo non ambiguo la catena polipeptidica, aumentando il rischio di introdurre errori nel modello, che non si riescono ad eliminare facilmente durante il raffinamento. In tal caso il raffinamento dovrebbe essere preceduto da un processo di miglioramento della qualità della mappa (chiamato density modification ), che consente un sensibile miglioramento degli angoli di fase.

4 Cristalli Raffinamento Data collection ρ (x,y,z) Modello molecolare Fasi approssimate MR, MIRAS, SIRAS, MAD Density modification Validazione e PDB

5 Costruzione modello atomico - catena principale (scheletro C α ) - catene laterali - molecole solvente, ligandi, ecc.

6 Risoluzione 1 ρ(x,y,z) = Σ F hkl exp [-2πi(hx+ky+lz-α hkl )] V hkl 2d hkl sinθ = nλ d min hkl = nλ/2 sinθ max d min hkl = risoluzione dei dati di diffrazione alta risoluzione (d min hkl piccolo) alti hkl alte frequenze nella serie di Fourier densità elettronica ben interpretabile

7 Raffinamento cristallografico Il raffinamento è un processo iterativo di aggiustamento delle coordinate degli atomi del modello molecolare in modo tale che ci sia il miglior accordo possibile tra i fattori di struttura calcolati a partire dal modello e quelli osservati sperimentalmente. Nel processo di miglioramento del modello, vengono alternati cicli di calcolo della mappa di densità elettronica e di modifica (anche manuale attraverso programmi di computer grafica) della catena polipeptidica. Le tecniche di raffinamento usate in cristallografia di proteine sono basate sul metodo dei minimi quadrati. In questo caso le osservazioni (intensità dei riflessi) hanno valori fissi ed i parametri sono variati in modo tale che i valori calcolati si avvicinino il più possibile alle osservazioni.

8 Metodo dei minimi quadrati Nel metodo dei minimi quadrati si devono variare le coordinate atomiche (x i, y i, z i ) ed i fattori di temperatura B i in modo tale da minimizzare la funzione: Q = Σ w hkl (F hkl,o F hkl,c ) 2 hkl w hkl = 1/σ 2 hkl σ hkl = deviazione standard della singola misura cioè in modo da massimizzare l accordo fra i dati sperimentali F O e quelli calcolati dal modello F C. Il raffinamento tramite minimi quadrati è un processo iterativo. Quindi, in ciascun ciclo i parametri da raffinare cambiano valore, per tendere al valore finale. Quando i cambiamenti nei parametri diventano piuttosto piccoli, si dice che il raffinamento ha raggiunto la convergenza all insieme di parametri finale.

9 Raffinamento cristallografico Nel processo di miglioramento del modello, vengono alternati cicli di calcolo della mappa di densità elettronica e di modifica (anche manuale attraverso programmi di computer grafica) della catena polipeptidica. L aggiustamento del modello consiste nel cambiare i parametri posizionali (x, y, z) e i fattori di temperatura (B) di tutti gli atomi nella struttura. Siano: m = numero dei fattori di struttura osservati n = numero dei parametri che si vogliono ottimizzare Affinchè il processo di raffinamento abbia successo è necessario che il sistema sia sovradeterminato, cioè che il numero di osservazioni sia significativamente maggiore rispetto al numero delle variabili

10 Raffinamento cristallografico Esempio : Struttura tridimensionale della papaina, determinata a 1.65 Å di risoluzione. m = riflessi misurati n = 8000 parametri da ottimizzare il rapporto m / n vale circa 3 (sistema poco sovradeterminato). Questo è il motivo per cui nel processo di raffinamento vengono incorporate più osservazioni possibile, in modo tale che il rapporto m/n valga almeno 10. Per diminuire il numero di parametri da raffinare o aumentare il numero delle osservabili, si considerano i dati stereochimici caratteristici di una proteina: lunghezza ed angoli di legame, ecc., dedotti dall analisi delle piccole molecole con alta precisione.

11 Raffinamento cristallografico Si possono applicare le informazioni stereochimiche sulle lunghezze ed angoli di legame, ecc., in due modi: (a) raffinamento a vincoli rigidi (constrained refinement), (b) raffinamento a vincoli non rigidi (restrained refinement) (a) raffinamento constrained, in cui i parametri stereochimici sono considerati come rigidi e possono variare solo gli angoli diedri. In questo modo si riduce il numero dei parametri da raffinare (n). Per esempio, nel caso della catena laterale di una Phe, raggruppo e considero come un corpo rigido gli atomi di carbonio della catena aromatica.

12 Raffinamento cristallografico (b) raffinamento restrained, in cui i parametri stereochimici possono variare intorno ad un valore standard, controllato da un termine di energia. In questo modo si aumenta il numero delle osservazioni (n). processo iterativo di correzione del modello tale da minimizzare: C = Q +ku Q = Σ w hkl (F hkl,o F hkl,c ) 2 hkl angoli di legame U = Σ 1/2 k b,j (b j,c b j,o ) 2 + Σ 1/2 k τ,j (τ j,c τ j,o ) 2 + j lunghezza legami j + Σ k φ [1 + cos (nφ j δ)] + Σ [(Br -12 ) ij + (Ar -6 ) ij ] j angoli di torsione van der Waals ij

13 V(d) 1/d 12 V(d) termine repulsivo B A = - d 12 d 6 termine attrattivo 1/d 6 d

14 Sintesi delle doppie differenze 1 ρ(x,y,z) = Σ (p F O,hkl -q F C,hkl ) exp (iα C,hkl ) exp [-2πi(hx+ky+lz)] V hkl p e q numeri interi tali che p > q. Se p = 2 e q =1 (2 F O,hkl - F C,hkl ) si calcola una mappa di densità elettronica che corrisponde alla sovrapposizione di una mappa a coefficienti F O,hkl (che segue la struttura), e di una mappa a coefficienti ( F O,hkl - F C,hkl ) (che segue le differenze fra la struttura reale e quella calcolata dal modello). Questa mappa risulta essere la migliore per costruire il modello ed ovvia al fatto che la ΔF presenta picchi solo in corrispondenza degli errori del modello rispetto ai dati sperimentali.

15 ρ(x,y,z)= Σ (2 F O,hkl - F C,hkl ) exp (iα C,hkl ) exp [-2πi(hx+ky+lz)] 1 V hkl

16 Validazione modello (R factor ) - accordo fra modello e dati sperimentali R factor = Σ F obs - F calc hkl Σ F obs hkl Durante il procedimento di raffinamento, a testimonianza della convergenza del modello approssimato iniziale verso la struttura 3D corretta della macromolecola, il fattore-r decresce, passando da valori iniziali di circa il 50% fino a valori finali dell ordine del 15-20%. Una stima più affidabile della corrispondenza tra modello e dati sperimentali si basa sul cosiddetto fattore-r free, formalmente definito in modo analogo al fattore-r, ma calcolato solo su una parte dei riflessi hkl, detta test-set (contenente dal 5 al 10% delle intensità di diffrazione misurate), che viene omessa in tutto il processo di raffinamento del modello.

17 Validazione modello (R factor ) - accordo fra modello e dati sperimentali R factor = Σ F obs - F calc hkl Σ F obs hkl Il fattore-r rappresenta quindi una stima della discrepanza relativa fra le ampiezze dei fattori di struttura sperimentali da quelli calcolati dal modello. Strutture raffinate in modo accurato presentano un fattore-r < 20%. Quando il fattore-r è dell ordine del 30%, probabilmente alcune parti del modello potrebbero essere non corrette. Il valore del fattore-r atteso per una struttura ben raffinata dipende dalla risoluzione dei dati a disposizione. Accanto al fattore-r, nel 1993 è stato introdotto un altro parametro di controllo della qualità del raffinamento: il fattore-r free

18 Validazione modello (R free ) R free = Σ F obs - F calc Σ F obs (hkl) T (hkl) T Si dividono i riflessi in un test set (T) (contenente una selezione casuale del 5-10% dei riflessi totali, cioè tipicamente ~ 1000 riflessi) ed in un working set (W). Il raffinamento è condotto solo utilizzando i riflessi appartenenti al working set W, mentre il fattore R-free è calcolato sono con i riflessi del test set T. Se la struttura è realmente migliorata con il processo di raffinamento sia fattore R che R-free diminuiscono. Di solito il fattore R-free è di qualche punto percentuale maggiore del fattore R (~ 7%). Se invece il fattore R diminuisce solo perchè si sta cercando di interpretare del rumore nella mappa di densità elettronica, il fattore R-free invece che diminuire aumenta. Caso tipico è quando si vogliono assegnare come molecole d acqua troppi picchi della densità elettronica.

19 Validazione modello (R free ) Quindi, se la differenza tra il fattore R che R-free è superiore al ~7% allora è possibile che i dati sperimentali siano stati interpretati con un modello irragionevolmente complesso, che include parametri non giustificabili sperimentalmente. Se, viceversa, tale differenza è troppo piccola (< 2%) allora è possibile che i dati contenuti nel test set non siano completamente indipendenti da quelli del working set (per esempio a causa di pseudosimmetrie o di utilizzo erroneo dei dati del test set durante parte del raffinamento)

20 Validazione modello (rmsd) Root Mean Square Deviation Definisce la deviazione quadratica media dei parametri geometrici del modello rispetto a quelli considerati tipici. Di solito si applica alle lunghezze ed agli angoli di legame. t 1 = (x 1,1,.., x 1,n ) t 2 = (x 2,1,.., x 2,n ) RMSD (t 1, t 2 ) = [ Σ (x 1,i -x 2,i ) 2 /n] 1/2 Per una struttura di media/alta risoluzione ben raffinata ci si aspetta una rmsd sulle lunghezze di legame covalente di ~0.02 Å. Se tale valore diventa > 0.03 Å, vuol dire che c è qualcosa di errato nel modello. Se, viceversa, tale valore è troppo basso (per esempio Å) significa che durante il raffinamento i parametri stereochimici sono stati pesati troppo. n i = 1

21 Ramachandran plot L analisi dei valori degli angoli di torsione (ϕ,ψ) è di grande importanza poichè di solito essi non sono restrained durante il raffinamento. Nel caso in cui alcuni residui presentino (ϕ,ψ) al di fuori delle regioni consentite del diagramma di Ramachandran, occorre valutare se tali discrepanze sono dovute ad una cattiva modellizzazione o se esistano motivi biochimici per giustificare tali conformazioni anomale. Il terzo angolo torsionale ω viene utilizzato per monitorare la presenza di eventuali residui in conformazione cis (ω trans = 180, ω cis = 0 )

22 Ramachandran plot Raffinamento Cristallografico e Validazione

23 Ramachandran plot Raffinamento Cristallografico e Validazione

24 File formato PDB CRYST P ATOM 1 CB SER ATOM 2 OG SER ATOM 3 C SER ATOM 4 O SER ATOM 5 N SER ATOM 6 CA SER ATOM 7 N THR ATOM 8 CA THR ATOM 9 CB THR ATOM 10 OG1 THR ATOM 11 CG2 THR ATOM 12 C THR ATOM 13 O THR ATOM 2166 HOH WAT ATOM 2167 HOH WAT ATOM 2168 HOH WAT END x y z occ B