DIAGNOSI PRENATALE: CITOGENETICA CLASSICA e QF-PCR

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1 DIAGNOSI PRENATALE: CITOGENETICA CLASSICA e QF-PCR Dr.ssa Anna Maria Innoceta Laboratorio Unico Area Vasta Romagna Pievesestina AUSL CESENA 12 Ottobre 2013

2 LA DIAGNOSI PRENATALE POST-IMPIANTO INVASIVA NON- INVASIVA PRELIEVO VILLI CORIALI (CVS) ECOGRAFIA (Soft markers) BI-TEST AMNIOCENTESI TRI-TEST CORDOCENTESI RICERCA SANGUE FETALE NEL PLASMA MATERNO FETOSCOPIA RICERCA ANEUPLOIDIE DA dna FETALE CIRCOLANTE

3 DIAGNOSI PRENATALE: UN PO DI STORIA anni 50: amniocentesi per indicazione genetica (x-cromatina) 1966 : amniocentesi: analisi citogenetica su afcc (steele e breg) 1968 : prima diagnosi prenatale di trisomia 21 (valenti et al.) 1974 : prime diagnosi citogenetiche fetali a 1980: introduzione della FISH per l identificazione della trisomia 21 su nuclei interfasici di amniociti non coltivati a scopo diagnostico in italia 1982 : villocentesi (old et al) 1983 : diagnosi citogenetica prenatale 1 trimestre (brambati e simoni) 1993 / 1997: QF-PCR per la diagnosi prenatale di aneuploidie 2009: NGS

4 INDICAZIONI ALLA DIAGNOSI PRENATALE INVASIVA madri di età avanzata: superiore a 35 anni coppie con precedenti figli affetti da patologia cromosomica genitori con anomalie cromosomiche bilanciate riscontro ecografico di malformazioni fetali, ritardo dello sviluppo fetale, anomalie del la alterazione di alcuni parametri biochimici genitori portatori di aneuploidie non associate ad infertilità alcune malattie mendeliane gravidanze ottenute con fecondazione artificiale

5 Diagnosi Prenatale Classica Amniocentesi Villocentesi - si esegue dopo la 15 settimana, spesso tra 16/17 - Si esegue tra la settimana - Prelievo di 1ml di liquido amniotico per settimana gestazionale - Cariotipo su preparato diretto (STC)con analisi del citotrofoblasto metafasi spontanee, risposta 24 ore - Cariotipo dopo coltura di 8-14 giorni % rischio di aborto - 0,2% fallimento della coltura rischio di mosaicismo - Possibilità di ripetere amniocentesi o sangue funicolare - Possibilità di eseguire ITG se il risultato è patologico - Prelievo di biopsia dei villi coriali - Cariotipo su coltura (LTC), mesenchima, risposta dopo 8-10 giorni coltura - 1% rischio di aborto - 1% rischio di mosaicismo placentare - Possibilità di ripetere amniocentesi - Possibilità di eseguire IVG se il risultato è patologico

6 EPOCA PRELIEVO D.P.1 TRIMESTRE: D.P.2 TRIMESTRE: CVS AMNIOCENTESI XI-XIII XV-XVIII TECNICHE DI A)Qfpcr + coltura A) coltura cellulare LABORATORIO B)diretta+coltura B)Qf-pcr su amniociti non C)qfpcr+diretta+coltura coltivati +coltura cellulare Tecnica diretta: 3gg 3 settimane Coltura a lungo termine: 3 settim. Qf-pcr: 5 ore/48ore/7gg TEMPI MEDI DI RISPOSTA Qf-pcr: 5 ore/48ore/7gg RISCHIO 0.5%-1% 0.3%-0.5% MCC 1% 0,24% MOSAICI 1,5% 0,2% PERDITA FETALE

7 Diagnosi prenatale di aneuploidie Cariotipo: Gold standard Studia tutto il genoma Rileva le aneploidie e i riarrangiamenti strutturali Accuratezza nel liquido amniotico del 99,4 99,8 % Accuratezza nei campioni da villi corionici del 97,5 99,6% Risultati in giorni

8 COSA VEDE IL CARIOTIPO?

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13 DIAGNOSI PRENATALE II TRIMESTRE: AMNIOCENTESI N PRELIEVI ANNUI IN ITALIA : > EPOCA GESTAZIONALE : XV-XVIII S.G. MATERIALE ANALIZZATO : AMNIOCITI PRESENTI IN SOSPENSIONE NEL LIQUIDO AMNIOTICO RISCHIO D ABORTO : 0.3%-1%

14 Flusso di lavoro LA ARRIVO DEL CAMPIONE DI LA VALUTAZIONE DELLE MOTIVAZIONI D INVIO VALUTAZIONE DELLA QUALITA DEL CAMPIONE CARIOTIPO Qf-pcr+ CARIOTIPO in presenza di malformazioni con richiesta specifica del genetista In presenza di screening positivo con plica >3,5 in gravidanze oltre la 20esima settimana (19+1)

15 COLTURE DI AMNIOCITI Materiale esaminato Amniociti presenti in sospensione nel L.A. e provenienti da : - epidermide - tubo digerente - apparato respiratorio - apparato urogenitale - sacco amniotico

16 COLTURE DI AMNIOCITI L analisi cromosomica viene effettuata su cellule in mitosi. Solo alcune cellule si dividono spontaneamente ( cellule di midollo osseo, del trofoblasto, neoplastiche) In tutti gli altri casi e necessaria la coltura in vitro. fibroblasti cellule morte con nucleo picnotico cellule epiteliali

17 LA: coltura cellulare

18 PROBLEMI DIAGNOSTICI Contaminazione da cellule di origine materna (MCC) Mosaicismi Cromosomi marker sovrannumerari de novo Riarrangiamenti strutturali de novo

19 CONTAMINAZIONE DA CELLULE DI ORIGINE MATERNA CRESCITA IN COLTURA DI CELLULE DERIVATE DA PICCOLISSIME QUANTITA DI TESSUTO DI ORIGINE MATERNA, PRELEVATO INSIEME AL LIQUIDO AMNIOTICO + 46,XX/46,XY (?????)

20 PRESENZA DI MOSAICI MOSAICO:PRESENZA, IN UNO STESSO INDIVIDUO, DI 2 O PIU LINEE CELLULARI CON DIVERSO CARIOTIPO Mosaico vero: presente nel feto, quindi con possibili effetti sul fenotipo Pseudomosaico: presente nelle cellule in coltura ed assente nel feto

21 DIAGNOSI PRENATALE I TRIMESTRE:CVS N PRELIEVI ANNUI IN ITALIA: > (SIGU) EPOCA GESTAZIONALE: XII-XIII SETTIMANE MATERIALE ANALIZZATO: TROFOBLASTO E/O MESENCHIMA RISCHIO D ABORTO: VARIABILE 1% RISCHIO MALFORMATIVO: ANOMALIE ORO-MANDIBOLARI E MALFORMAZIONI DEGLI ARTI (PRELIEVI ANTERIORI ALLA 10ª SETTIMANA)

22 Flusso di lavoro CVS ARRIVO DEL CAMPIONE DI CVS VALUTAZIONE DELLE MOTIVAZIONI D INVIO VALUTAZIONE DELLA QUALITA DEL CAMPIONE DIRETTA +COLTURA Se presenti alterazioni citogenetiche conosciute familiari : traslocazioni bil su cromosomi non indagati da qf-pcr QF-PCR + COLTURA Qf-pcr+ DIRETTA +COLTURA Se alterazioni in Qfpcr o indicazione del genetista

23 VILLI CORIALI:COLTURA COLTURA A BREVE TERMINE COLTURA A LUNGO TERMINE Sono sfruttate le mitosi spontanee presenti nel citotrofoblasto. I villi, dopo essere stati accuratamente puliti,sono posti in coltura previo trattamento con enzimi proteolitici per disgregare le cellule del cito e del sinciziotrofo blasto. A crescita avvenuta si procede al trattamento con Colcemid, cui seguono shock ipotonico, fissaggio ed analisi delle metafasi. Il preparato viene allestito immediatamente dopo il prelievo o previa incubazione per 24-48h. Viene aggiunta colchicina. Dopo lo shock ipotonico si eseguono il fissaggio,la disgregazione e lo striscio del preparato sui vetrini

24 VILLI CORIALI:COLTURA COLTURA A BREVE TERMINE: COLTURA A LUNGO TERMINE: VANTAGGI: VANTAGGI: -Tempi rapidi -Minor inquinamento da cellule materne -Migliore qualita delle metafasi -Attivita mitotica più alta SVANTAGGI: SVANTAGGI: -Attivita mitotica più bassa -Qualita mediocre delle metafasi -Rischio d inquinamento da cellule materne -Tempi lunghi della coltura cellulare

25 CVS: metodo diretto o short term culture

26 CVS: coltura a lungo termine

27 VILLOCENTESI: PROBLEMI DIAGNOSTICI contaminazione deciduale 1% Falsi negativi mosaici 0,03% mosaici confinati alla placenta (MCP) 1%-1,5% pseudomosaici 0,6% Falsi positivi

28 VILLI CORIALI:MOSAICI FREQUENZA DEI MOSAICI RISCONTRATI IN D.P.1 TRIMESTRE n casi mosaici% VEJERSLEV (1989) CESCA (1988) EUCROMIC (1997) CONFERMA NELFETO: PHILLIPS (1996) 11% EUCROMIC (1997) 16% 1.18% 1.20% 1.50%

29 MOSAICISMO CONFINATO ALLA PLACENTA DISCREPANZA FRA IL CARIOTIPO DELLA PLACENTA E QUELLO DEL FETO / EMBRIONE

30 COME SI ORIGINA UN MOSAICO? NON DISGIUNZIONE MEIOTICA E TRISOMIC RESCUE NON DISGIUNZIONE POSTZIGOTICA

31 MOSAICISMO CONFINATO ALLA PLACENTA

32 MOSAICO CONFINATO ALLA PLACENTA VENGONO CONSIDERATI COME LA PRINCIPALE CAUSA DI ERRORE DIAGNOSTICO IN D.P. DEL 1 TRIMESTRE SONO CAUSA DI COMPLICANZE PRENATALI O PERINATALI QUALI PARTO PREMATURO,IUGR, PERDITE FETALI I CROMOSOMI MAGGIORMENTE COINVOLTI SONO: 2,3,7,8,15,16,22 LA MAGGIOR PARTE DEI CPM 16 E 22 HANNO ORIGINE MEIOTICA MENTRE I CPM 2,7,8 SONO PER LO PIU DI ORIGINE MITOTICA UNA TRISOMIA CONFINATA ALLE STRUTTURE EXTRAEMBRIONARIE PUO ESSERE, ANCHE SE RARAMENTE, ASSOCIATA A DISOMIA UNIPARENTALE (UDP)

33 VILLI CORIALI: FALSI NEGATIVI POSSIBILI MECCANISMI D INSORGENZA: Mosaico non rilevato per la presenza della linea anomala soltan to nel feto Contaminazione con cellule materne Gravidanza gemellare, con perdita e riassorbimento del feto normale

34 FALSI NEGATIVI E IMPORTANTE DISTINGUERE FRA COLTURE A BREVE TERMINE E COLTURE A LUNGO TERMINE: Incidenza falsi negativi dopo STC: 0,49% Incidenza falsi negativi dopo STC+LTC : 0,08% Van den Berg 2006

35 FALSI NEGATIVI Van den Berg 2006

36 DIAGNOSI PRENATALE I TRIMESTRE:CVS CVS: metodo diretto o short term culture CVS: coltura a lungo termine M: mesenchima S: sincizio C: citotrofoblasto QF-PCR

37 Diagnosi prenatale di aneuploidie QF-PCR: Risposta in 5 ore Indagine con KIT ce-ivd dei cromosomi 13, 18, 21 and XY (e su indicazione specifica 15, 16, 22) Alta detection rate delle anomalie cromosomiche clinicamente rilevanti Rileva mosaicismi sopra il 20% Superiore al cariotipo nel rilevare e caratterizzare la contaminazione da materiale materno (anche in campioni a cariotipo femminile)

38 COSA VEDE LA QF-PCR?

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40 QF-PCR = Amplificazione con Short Tandem Repeats (STRs) Il metodo si basa sull'amplificazione di brevi sequenze del DNA che contengono blocchi ripetuti di 2-6 basi (marcatori STRs). Queste sequenze sono specifiche per il cromosoma che si intende analizzare. Usando marcatori per i cromosomi 21, 13, 18, X e Y è possibile diagnosticare le aneuploidie più frequenti. Eterozigote o diallelico= due alleli di lunghezza differente Omozigote o monoallelico = due alleli della stessa lunghezza Trisomico = triallelico o diallelico con rapporto 2:1 o 1:2

41 MATERNO PATERNO

42 Linee guida QF-PCR Le linee guida di riferimento sono state sviluppate ed approvate nel 2012 in collaborazione tra l'association of Clinical Cytogenetics (ACC) e la Clinical Molecular Genetics Society (CMGS) Sono disponibile kit commerciali CE-IVD prodotti da differenti compagnie

43 DISTRIBUZIONE STRs QF-PCR

44 Elettroforesi Capillare Prodotto della PCR ABI 310/3500dx Elettroferogramma (tracciato elettroforetico)

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46 Precorso analitico qf-pcr Estrazione DNA Elettroforesi capillare Interpretazione risultati pcr

47 QF-PCR flusso di lavoro Esecuzione di 8 campioni Tempo manuale Tempo totale Preparazione PCR 10 min 10 min Preparazione campioni min min Amplificazione 2 min 2 ore 45 min Rilevamento 15 min 1 ora Analisi dei risultati 30 min 30 min Totale 1, 5 ore 5 ore

48 Qf-pcr: interpretazione dei risultati

49 Qf-pcr: interpretazione dei risultati Maschio normale

50 Qf-pcr: interpretazione dei risultati Femmina normale

51 Qf-pcr: interpretazione dei risultati Maschio con trisomia 13 - sindrome di Patau 47,XY+13 triallellica

52 Qf-pcr: interpretazione dei risultati Maschio con trisomia 18 - sindrome di Edwards 47,XY+18 triallellica

53 Qf-pcr: interpretazione dei risultati Maschio con trisomia 21 - sindrome di Down 47,XY+21 triallellica

54 Qf-pcr: interpretazione dei risultati Maschio con trisomia 21 a mosaico - sindrome di Down mos47,xy+21 triallellica

55 Qf-pcr: interpretazione dei risultati qf-pcr:trisomia 21 e contaminazione materna citogenetica: mos 47,XX+21/46,XX???

56 Storia della QF-PCR Author Year No. Of samples Chromosomes Lubin et al X Hulthén et al , 18, 21, XY Nicolini et al , 18, 21, XY Ogilvie et al , 18, 21 Cirigliano et al , 18, 21, XY Hills et al , 18, 21, XY Badenas et al , 18, 21, XY Risultati da oltre analisi QF-PCR publicate

57 QF-PCR VANTAGGI metodica rapida e con ottimo rapporto qualità / prezzo possibilità di automatizzare parte del processo fornisce, entro 48h, i dati relativi alle aneuploidie x-y bassa percentuale di fallimenti - si esegue su cellule non coltivate possibilità di condurre l analisi anche a partire da un prelievo molto scarso e di qualità non ottimale valido approccio nei casi di gravidanze gemellari La QF è utile per definire la zigosità e le eventuali contaminazioni

58 QF-PCR LIMITI Legati alla metodica ed al tessuto analizzato: Presenza di Mosaicismi Presenza di tetraploidie Presenza di riarrangiamenti strutturali Analisi mirata solo ai cromosomi indagati (13, 18, 21, XY) Legati alla qualità del prelievo: Viene allestito anche il preparato per la lettura del cariotipo da metafasi spontanee e richiesto il sangue materno se in CVS con presente decidua e in LA ematico.

59 Discrepanze diagnostica su villo coriale QF-PCR vs cariotipo: sono riportati casi di discrepanza completa tra qf-pcr e cariotipo dovuti a mosaicismi placentari e fetali (Allen et al,2006;waters et al.,2006and 2007; Holgado et al,2011) Incidenza di discrepanza completa: è altamente variabile da 1/815 (Holgado et al,2011) a <1/10000 (Mann et Ogilvie 2012) Cause: 1) la qualità e la quantità della biopsia di CV 2) le strategie di processazione (selezione del materiale e pulizia da decidua) 3) settatura dell'analisi

60 Casistica AVR diagnosi prenatale prelievi LA area vasta /anno (ausl RA-CE-FO-RN) tot 770/anno QF su liquido amniotico (attualmente ausl RA-CE-FO-RN) in presenza di malformazioni con richiesta specifica del genetista In presenza di screening positivo con plica >3,5 in gravidanze oltre la 20esima settimana (19+1) prelievi CVS area vasta /anno (ausl RA-CE-FO-RN) tot 1130/anno QF su villo coriale (attualmento solo ausl Ravenna) su tutti i CVS, tranne quelli con indicazione di presenza di traslocazioni familiari (dove viene eseguita diretta+coltura) alla QF-PCR viene affiancata la coltura cellulare per la determinazione del cariotipo.

61 Casistica qf-pcr 05/ /2013 Analisi LIQUIDI AMNIOTICI: 37 analisi qf-pcr+ cariotipo Risposta qf-pcr Fallimenti colture Contaminazioni materne Corrispondenza qf-pcr/cariotipo relativamente ai cromosomi analizzati 4 patologici 100% 0% 1% 100%

62 Casistica qf-pcr 05/ /2013 Analisi CVS: 198 analisi qf-pcr+coltura mesenchimale Risposta qf-pcr 100% Fallimento coltura 0,5% Contaminazioni materne 2% Corrispondenza qf-pcr/cariotipo 100% relativamente ai cromosomi analizzati 13 patologici

63 caso motivazione invio diretta villo 1 >35anni 45,X0 2 >35anni 3 >35anni 4 coltura villo qf villo mos45,x0[19]/46,xx [31] mos45x0/46xx triploide13,18,21 mos68,xx/69,xxx disomicoxx amniocentesi Qf-amnio 46,XX 46,XX ,XY+18 47,XY+18 >35anni 68,XX mos47,xy+18[13]/46,xy[2] 47,XY+18 47,XY+18 mos47,xy+12[14]/46 no,xy[2] 46,XY 46,XY no 5 >35anni 47,XXX >35anni ,XXX no 47,XXX 46,XX,t(9;14) de novo igroma cistico no 45,X0 45,X ,XXY 47,XXY 47,XXY >35anni >35anni anomalie eco plica 5,5 47,XY+18 - >35anni plica 5,2 47,XY+21 47,XY+18 Dir 47,XY+21 mes 46,XX confronto allelico materno ,XY+18 46,XX) contaminazione materna ,XY+21 47,XY igroma controllo mos su villo ,XX+21 47,XX >35anni 47,XYY 47,XYY 47,XYY >35anni idrope fet 47,XX+18 mos 46,XX,der(18) (qter--> p?::?) [6]/46,XX,psu dic(18) (p11.3) [5]/46,XX,der(18) Bi-test pos [2]/46,XX[28] controllo mos su villo - 47,XX+18 mos 46,XX,der(18) (qter--> p?::?) [6]/46,XX,psu dic(18) (p11.3) [5]/46,XX,der(18) [2]/46,XX[28] 47,XX ,XX no risposta crom18 per sosp. Mosaico aneuploidia 46,XX 46,XX mos45,x0[13]/46,xx [11] mos45,x

64 Considerazioni qf-pcr+ltc vs STC+LTC QF-PCR+LTC vs Diretta+coltura : rischio di risultato falso negativo principalmente dovuto a TFM di tipo IV,UPD associato a sindromi da imprinting (per cr.15) o errore dovuto a MCC I risultati patologici in qf-pcr anche se in associazione a risultati patologici non a mosaico in LTC richiedono la conferma su LA per distinguere i CMP ad alto livello (>50%) da TFM (1:2600 Grati F.2012) QF-PCR ce-ivd e STC hanno costi simili a campione ma...forniscono anche informazioni complementari ecco perchè se in QF-PCR si ottiene un risultato patologioco allestiamo STC e viceversa...e......la formazione del personale per eseguire e validare la QFPCR richiede meno tempo che la formazione del personale alla lettura in citogenetica in presenza di una piattaforma molecolare consolidata

65 QF-PCR come analisi complementare o come test unico Stockholm, Sweden e Nijmegen, Netherlands Gravidanze a basso rischio (il rischio significativo clinico di aberrazioni cromosomiche è circa 1 : 1000) Età materna avanzate(35 anni o più), Ansietà dei genitori 70% delle donne scieglie QF-PCR rispetto al cariotipo, dopo l informatione e consenso della paziente

66 QF-PCR come test unico London, UK Il cariotipo è eseguito solo quando: Gli ultrasuoni trovano anormalità strutturali Presenza di due o più soft markers per la trisomia 21 Analisi Nuchal: >3 mm a meno di 14 settimane di gestazione Analisi Nuchal: >6 mm 14 settimane di gestazione Tutti gli atri campioni sono eseguiti con la QF-PCR 99,7% dei campioni testati solo con la QF-PCR hanno una diagnosi corretta

67 grazie