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3 Monografia di prodotto Indice I. INTRODUZIONE II. LEISHMANIOSI CANINA E RISPOSTA IMMUNITARIA II.1. Leishmaniosi canina. II.2. Il ruolo chiave del sistema immunitario nella progressione della malattia. II.3. L importanza della risposta immunitaria innata. II.4. La malattia clinica e l importanza della diagnosi precoce. III. LEISGUARD, UN NUOVO STRUMENTO PER COMBATTERE LA LEISHMANIOSI CANINA III.1. Che cos é Leisguard? III.2. Il suo principio attivo, il domperidone. III.3. Una posologia minuziosamente stabilita. III.4. Effetto stimolante di Leisguard sulla risposta immunitaria innata. III.5. Effetto stimolante di Leisguard sulla risposta immunitaria acquisita. III.6. Leisguard per potenziare l attività leishmanicida dei macrofagi. IV. EFFICACIA CLINICA DI LEISGUARD IV.1. Leisguard per il controllo dell evoluzione clinica della Leishmaniosi canina. Studi clinici con Leisguard per il controllo dell evoluzione clinica della leishmaniosi canina. IV.2. Leisguard per la prevenzione della Leishmaniosi canina. Studi clinici con Leisguard per la prevenzione della Leishmaniosi. V. COME UTILIZZARE LEISGUARD NELLA PRATICA CLINICA? V.1. Il prodotto. V.2. Un eccellente profilo di sicurezza. V.3. Il paziente: l importanza della diagnosi precoce. V.4. Come agire di fronte a una diagnosi precoce positiva? V.5. Come agire di fronte a una diagnosi precoce incerta? V.6. Come agire di fronte a una diagnosi precoce negativa? Zona non endemica (Incidenza bassa <5%) Zona endemica (Incidenza media 5-20%) Zona endemica (Incidenza elevata >20%) VI. DOMANDE PIÙ FREQUENTI VII. SCHEDA TECNICA VIII. ALLEGATO 1 Incidenza della Leishmaniosi canina in diversi studi IX. BIBLIOGRAFIA

4 I. Introduzione La Leishmaniosi canina è probabilmente la malattia del cane più rilevante in tutti i paesi mediterranei. Si tratta di una malattia parassitaria ad alta incidenza potenzialmente mortale, complicata da diagnosticare e difficile da trattare con efficacia. Nel corso degli ultimi anni, l uso crescente di tecniche immunologiche, genetiche e molecolari ha ampliato notevolmente le conoscenze sulla Leishmaniosi canina, il che ha determinato una modifica del paradigma concettuale. Di conseguenza attualmente si considera sempre di più la Leishmaniosi come una malattia del sistema immunitario provocata da un parassita invece che una semplice malattia parassitaria. I progressi degli ultimi decenni nella ricerca di questa malattia hanno mostrato ripetutamente che il controllo dell infezione o l evoluzione clinica della malattia non risiede tanto nella patogenicità del parassita quanto piuttosto nelle caratteristiche della risposta immunitaria che si instaura nel cane a seguito dell infezione. Tuttavia fino ad oggi queste conoscenze non erano state usate per creare nuove terapie contro questa malattia. Leisguard offre un nuovo approccio per il trattamento della Leishmaniosi canina, poiché rappresenta la prima specialità farmaceutica mirata a stimolare la reazione immunitaria del cane creando una risposta efficace per mantenere sotto controllo la malattia. In questo modo, attraverso il potenziamento della risposta immunitaria, sia naturale sia innata, Leisguard propone al veterinario clinico una valida alternativa terapeutica per un efficace prevenzione della malattia. 3

5 II. Leishmaniosi canina e risposta immunitaria II.1. Leishmaniosi canina La Leishmaniosi canina è provocata da differenti specie di protozoi del genere Leishmania tra cui Leishmania infantum è la più rappresentata. La Leishmania si trasmette attraverso la puntura/morso di un diptero del genere Phlebotomus, principalmente da Phlebotomus perniciosus, anche se sono state descritte altre vie di trasmissione come la transplacentaria, la venerea o attraverso trasfusioni di sangue (Figura 1). Nella maggior parte dei paesi mediterranei dove la Leishmaniosi canina è endemica, questo vettore è solito presentare il suo periodo di massima attività tra i mesi di maggio e novembre. Nei paesi mediterranei la presenza del vettore è molto elevata, tanto in zone periurbane quanto in aree rurali, cosa che ha fatto aumentare l incidenza della malattia fino alle elevate cifre attuali. Anche se i dati sull incidenza variano molto da una zona all altra, i distinti gruppi di esperti di Leishmaniosi canina sono d accordo nell affermare che negli ultimi anni la malattia si sta diffondendo nel territorio e che la sua incidenza nelle zone endemiche sta aumentando progressivamente (Bourdeau et al., 2011; Paltrinieri et al., 2010, Solano-Gallego et al., 2011). Un aspetto fondamentale per comprendere la Leishmaniosi è di tener presente la differenza tra infezione e malattia. Studi epidemiologici condotti negli ultimi anni dimostrano che la percentuale di cani colpiti nelle zone in cui la malattia è endemica è molto alta, ciononostante va rilevato che solo una parte di questi animali è sieropositiva e una parte ancora più bassa sviluppa la malattia (Baneth et al., 2008). 4

6 II. Leishmaniosi canina e risposta immunitaria Figura 1. Schema del ciclo di vita della Leishmania e del flebotomo in cui si indicano anche le vie di contagio alternative proposte (Solano-Gállego et al., 2011.). 1b 1c 1a 2a 1 2 2b 2c 1. Ciclo di vita classico di Leishmania infantum 2. Altre vie inusuali di trasmissione 1a Promastigote 1b Amastigote 1c Disseminazione dei parassiti negli organi attraverso i macrofagi infetti 2a Verticale 2b Trasfusione di sangue 2c Trasmissione venerea Altre vie (non dimostrate): da cane a cane (morsi, ferite) II.2. Il ruolo chiave del sistema immunitario nella progressione della malattia Attualmente sappiamo che una volta che il parassita è inoculato dal flebotomo attraverso la pelle del cane, la progressione dell infezione può andare in diverse direzioni (Baneth et al., 2008; Paltrinieri et al., 2010; Solano-Gallego et al., 2011). Si ritiene, infatti, che in una piccola percentuale dei cani infetti il meccanismo dell immunità innata possa arginare l infezione contenendola a livello locale, mediante l eliminazione dei parassiti da parte delle cellule fagocitarie che agiscono da barriera di difesa primaria (Figura 2). 5

7 Figura 2. Schema riassuntivo della patogenesi della Leishmaniosi canina Eliminazione del parassita Risposta cellulare: Linfociti Th1 EFFICACE Risposta immunitaria INNATA (locale) Risposta immunitaria ACQUISITA RESISTENTE Eliminazione parassita Linfociti T CD4+ Linfociti Th2 INEFFICACE Risposta umorale: IL-10, IL-4 Disseminazione parassita SUSCETTIBILE Nella maggior parte dei casi, al contrario, l infezione si estende localmente e la risposta immunitaria innata provoca una reazione immunitaria acquisita e specifica. In funzione del tipo di risposta immunitaria acquisita che si stabilisce, l infezione evolve verso la malattia clinica oppure è mantenuta sotto controllo. Negli animali che sviluppano una risposta immunitaria prevalentemente cellulomediata (probabilmente la maggioranza) si produce l attivazione dei macrofagi con la conseguente distruzione dei parassiti grazie alla sintesi di radicali liberi di ossigeno, tra i quali l ossido nitrico. Questo tipo di reazione è conosciuta come risposta immunitaria di tipo Th1. 6

8 II. Leishmaniosi canina e risposta immunitaria Negli animali in cui invece la risposta immunitaria è prevalentemente umorale, con una sovrapproduzione di anticorpi (IgG1, IgG2), l infezione non è arginata e pertanto la malattia si sviluppa. Questo secondo tipo di reazione è denominata risposta immunitaria di tipo Th2. Gli ultimi progressi in fatto di patogenesi della Leishmaniosi canina hanno permesso di scoprire che l immunità protettiva (cellulo-mediata) nei confronti di questa malattia è mediata da cellule T helper 1 (linfociti Th1) le quali scatenano a loro volta la produzione di determinate citochine ( ormoni del sistema immunitario) capaci di stimolare e prolungare tale risposta nel tempo. Le suddette citochine, come l IFNγ, il TNFα o l IL-2, tra le altre, sono le responsabili dirette o indirette di una corretta attivazione dei macrofagi. Per quanto poi concerne l immunità non protettiva (umorale), essa è mediata attraverso una risposta di tipo T helper 2 (linfociti Th2) che induce la liberazione di citochine come l IL-10, l IL-4 o il TNFβ, le quali, oltre a inibire la risposta immunitaria cellulo-mediata, stimolano la sovrapproduzione da parte delle cellule plasmatiche di anticorpi anti-leishmania inefficaci. (Figura 3). Figura 3. Risposte Th1 y Th2 e relative interazioni in cani colpiti da Leishmania (Baneth et al., 2008). IFN - γ TNF - α IL-2 Attivazione macrofagi Eliminazione parassiti IL-12 IL-18 IL-27 Th0 Th1 Inibizione Inibizione IL-10 Ossido nitroso sintetasi Ossido nitrico Radicali liberi di ossigeno Th2 B IL-4 Treg IL-10 TNF - β Disseminazione parassitaria 7

9 Al contrario di quel che avviene in altre specie animali in cui la risposta all infezione da Leishmania è molto focalizzata (Th1 o Th2), nel caso del cane si tratta di una risposta mista Th1/Th2, in cui il controllo della malattia dipenderà dall equilibrio che si instaura tra i due tipi di risposta (Figura 4). Figura 4. Evoluzione clinica in funzione dell equilibrio tra i due tipi di risposta immunitaria, cellulo-mediata (Th1) e umorale (Th2), che si instaura a seguito dell infezione. Th1 Th2 Controllo parassita + Malattia sub-clinica Th1 Th2 Disseminazione parassita + Malattia clinica II.3. L importanza della risposta immunitaria innata Anche se il controllo finale della Leishmaniosi canina dipende principalmente dalla risposta immunitaria acquisita -mediata dai linfociti T- che si instaura dopo la prima settimana dall infezione, attualmente si attribuisce la stessa importanza al ruolo delle popolazioni cellulari che partecipano nella risposta innata, poiché sono queste le prime che entrano in contatto con il parassita. Uno studio riporta che tali cellule, oltre ad esercitare un controllo iniziale dell infezione, svolgono un ruolo fondamentale nell innescare la risposta immunitaria acquisita, facendo in modo che si sviluppi resistenza o suscettibilità alla malattia (Bonilla-Escobar 2005). Tra queste popolazioni cellulari si trovano, fra le molte altre, monociti-macrofagi, neutrofili e cellule natural killer (NK). I granulociti neutrofili sono i primi che arrivano alla pelle dopo l inoculazione dei parassiti. Uno o due giorni dopo arrivano le cellule NK e i monociti-macrofagi: questi ultimi si convertono nella popolazione predominante nella fase precoce dell infezione. 8

10 II. Leishmaniosi canina e risposta immunitaria È stato descritto inoltre che alcuni dei fattori che portano alla suscettibilità o alla resistenza alla Leishmaniosi sono dovuti a differenze funzionali nei monocitimacrofagi, che rappresentano una delle popolazioni cellulari con maggior protagonismo nell infezione da Leishmania (Bonilla-Escobar, 2005). I monociti-macrofagi agiscono in qualità di: 1) cellule ospiti del parassita, 2) cellule che presentano gli antigeni ai linfociti T e 3) cellule effettrici che distruggono la Leishmania. Proprio queste ultime agiscono sia come barriera primaria nel momento dell infezione, sia in seguito, dopo essere state attivate dalle citochine rilasciate dai linfociti T che potenziano la reazione Th1 nella risposta immunitaria acquisita. Per questo motivo qualunque alterazione nell attivazione di questa popolazione cellulare ha di solito come conseguenza lo sviluppo clinico della malattia. Numerosi studi suggeriscono poi la funzione rilevante dei neutrofili durante la fase precoce dell infezione da Leishmania e mettono in relazione la sua presenza con lesioni meno gravi e una carica parassitaria inferiore (Zandbergen et al., 2002; Rosseau et al., 2001; Lima et al., 1998; Smelt et al., 2000). Come i monocitimacrofagi, anche i neutrofili devono essere attivati per controllare in maniera efficace l infezione. Si è visto, infatti, che la Leishmania modifica i meccanismi di difesa e interferisce con l attivazione di entrambi i tipi cellulari sopracitati, impedendo così l instaurarsi di un adeguata risposta di protezione (Figura 5). In questo senso, se si vuole intervenire precocemente nel prevenire e combattere l infezione, sembra fondamentale impegnarsi nello sviluppo di nuovi strumenti e di forme alternative di immunoprevenzione e di immunoterapia, al fine di aumentare la capacità delle menzionate popolazioni cellulari di contrastare efficacemente il parassita. 9

11 Figura 5. Caratteristiche generali dell interazione tra macrofagi e parassiti di Leishmania. La Leishmania innesca l arrivo dei monociti sul luogo dell infezione. Questi, quando incontrano la Leishmania, interagiscono e la fagocitano. L entrata del parassita all interno della cellula può portare alla presentazione di antigeni, alla produzione di citochine, a una maggiore vitalità cellulare e alla sopravvivenza o alla distruzione del parassita, secondo come intervengono i diversi fattori nell intero processo (Bonilla-Escobar, 2005). Fagocitosi Sopravvivenza e replicazione del parassita Monociti che convergono sul luogo dell infiammazione MCO-1 IFN-γ MIP-1 IgE TNF-α Attivazione ON H2O2 enzimi IFN-γ TNF-α Distruzione del parassita Th1 IL-1 Molecole del parassita: LPG MIP-α e β MCP-1 Produzione e induzione di fattori chemiotattici Interazione attraverso i recettori TNF-α GM - CSF Presentazione degli antigeni a LT MCAF IL-1 IL-2 TNF-α TNF-β Produzione di citochine Secrezione di citochine Th2 IL-4 IL-5 IL-10 Minore apoptosi Via alterata dal parassita come meccanismo di difesa 10

12 II. Leishmaniosi canina e risposta immunitaria II.4. La malattia clinica e l importanza della sua diagnosi precoce Nonostante che ancora non si conoscano completamente i fattori intrinseci che influiscono sul fatto che un determinato animale sviluppi delle difese immunitarie contro la malattia o che invece la manifesti, la genetica rappresenta, probabilmente, l aspetto più importante. Ci sono razze in cui la malattia clinica è rarissima (podenco ibicenco) e altre in cui è invece molto diffusa (Rottweiler, Boxer, Cocker, Pastore tedesco). Tuttavia, un aspetto importante da tenere presente è che la condizione di resistente o suscettibile alla malattia non è definitiva. Una malattia immunosoppressiva, un trattamento farmacologico o altri fattori possono fare in modo che un animale che per anni ha mantenuto l infezione sotto controllo manifesti a un certo punto i segni clinici della malattia. Negli animali in cui l infezione progredisce, invece, il periodo d incubazione della malattia fino all apparizione dei sintomi è molto variabile, oscillando dai tre mesi fino ai sette anni: in questo intervallo si possono manifestare diversi meccanismi patogenetici. L infezione si estende a numerosi organi e sistemi (milza, noduli linfatici, pelle e mucose, fegato, pancreas, testicoli, intestino ), nei quali si producono delle reazioni infiammatorie granulomatose. Si generano inoltre immunocomplessi circolanti che si depositano nei glomeruli renali, uvea, vasi sanguigni e articolazioni. Il deposito di immunocomplessi è una delle principali cause della sintomatologia clinica della Leishmaniosi. Oltretutto nel corso della malattia occorrono altri processi patogenetici, come la formazione di auto-anticorpi o l anemia cronica. Tutti questi meccanismi patogenetici sono responsabili del quadro pleomorfo della malattia (Figura 6). Figura 6. Tabella indicante i principali segni clinici e presentazioni cliniche della leishmaniosi canina: 1. Lesioni cutanee: dermatite esfoliativa, ulcere cutanee e in giunzioni muco-cutanee, noduli cutanei. 2. Linfoadenopatia (iperplasia linfatica reattiva). 3. Astenia, anoressia, perdita di peso, atrofia delle masse muscolari, lieve ipertermia. 4. Insufficienza renale (proteinuria, azotemia). 5. Lesioni oculari (cheratiti, uveiti, panoftalmiti, glaucoma). 6. Zoppia (artrite, miosite). 7. Epistassi. 8. Diarrea cronica dell intestino crasso (colite). 11

13 Alcune volte l insufficienza renale è l unico sintomo apparente della malattia (Baneth et al. 2008), per cui quando questa si manifesta clinicamente è possibile che esista già un danno irreversibile. È per questa ragione che, per un efficace controllo della Leishmaniosi, è fondamentale individuare gli animali contagiati nello stadio iniziale della malattia, momento in cui le probabilità di successo della terapia sono molto maggiori. Come si è detto in precedenza, non tutti i cani infetti sviluppano la forma clinica della Leishmaniosi. In molti casi, gli animali senza sintomatologia si mantengono in questo stadio per anni e contraggono la malattia solo se si presentano altre circostanze concomitanti che compromettono in qualche modo la risposta immunitaria cellulare. Anche se possiamo considerare che un cane contagiato- e che presenta sintomatologia clinica- abbia sviluppato una risposta immunitaria deficiente (prevalentemente Th2) e un altro infetto- ma senza sintomatologia clinica- abbia invece sviluppato una reazione immunitaria efficace (prevalentemente Th1), non è possibile prevedere quale potrà essere la risposta di un determinato animale prima di essere contagiato. Salvo eccezioni, come nel caso del podenco ibicenco, non esiste una dimostrazione scientifica che la razza, il sesso o l età possano influire sulla modulazione della risposta immunitaria in un senso o in un altro. Oltretutto non disponiamo di nessuna prova diagnostica, sierologica o di altro tipo, capace di differenziare gli animali sensibili alla malattia da quelli che si difenderanno in modo soddisfacente in caso di contatto con il parassita. Di conseguenza, poiché non possiamo prevedere in anticipo quale sarà il comportamento di ogni animale, il veterinario clinico dovrebbe concentrare i suoi sforzi nell identificare la malattia nella fase più precoce possibile. Così, come in tutte le malattie gravi, la diagnosi precoce è la chiave del successo di qualsiasi terapia scelta e in questo senso la Leishmaniosi non rappresenta un eccezione. Malgrado tutte queste osservazioni, normalmente si è sempre considerato che, di fronte a una diagnosi sierologica dubbia o priva di una conferma clinica, si debba attendere l evoluzione dell animale e l esito di ulteriori accertamenti, prima di iniziare qualunque terapia con la somministrazione dei farmaci registrati per la malattia. Questi d altra parte non sono privi di effetti secondari: possono creare resistenze e non dovrebbero essere utilizzati senza la certezza che esista una proliferazione attiva dei parassiti. Tuttavia tale pratica comporta un certo rischio che la malattia si manifesti e che, quando si voglia iniziare la terapia, l animale si trovi già in uno stadio avanzato della malattia, compromettendo in questo modo il buon esito del trattamento. Come si vedrà nei seguenti paragrafi, Leisguard offre al veterinario uno strumento idoneo per l approccio terapeutico alle fasi più precoci della malattia. 12

14 III. Leisguard, un nuovo strumento per combattere la leishmaniosi canina III.1. Che cos è Leisguard? Leisguard è una sospensione orale a base di domperidone indicata per diminuire il rischio di contrarre la Leishmaniosi canina in caso di contatto con l agente causale, così come per mantenere sotto controllo la progressione clinica della malattia in casi lievi o agli stadi iniziali. Leisguard agisce sul sistema immunitario del cane, stimolando sia la risposta innata sia quella acquisita. In concreto aumenta il potenziale leishmanicida delle popolazioni di cellule fagocitiche quali i monociti-macrofagi e neutrofili, cioè la prima linea di difesa contro la Leishmania ed elemento chiave nell organizzazione della risposta immunitaria acquisita. Attraverso il suo effetto sulla maggioranza delle cellule del sistema immunitario, Leisguard contribuisce a stimolare una risposta prevalentemente cellulo-mediata, associata con la resistenza alla progressione della malattia clinica (Figura 7). Figura 7. Siti d azione di Leisguard Eliminazione parassita Risposta cellulare: Linfociti Th1 EFFICACE Risposta immunitaria INNATA (locale) Eliminazione parassita Linfociti T CD4+ Risposta immunitaria ACQUISITA Linfociti Th2 INEFFICACE Resistente Risposta umorale: IL-10, IL-4, Disseminazione parassita SUSCETTIBILE 13

15 III.2. Il suo principio attivo, il domperidone Il principio attivo di Leisguard è il domperidone (Figura 8), un derivato benzimidazolico che agisce attraverso il blocco specifico dei recettori dopaminergici D 2 a livello periferico. Figura 8. Struttura chimica del domperidone (5-cloro-1-(1-[3-(2-oxo-2,3-dihidro-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)propil] piperidin- 4-il)-1H-benzo[d]imidazol-2(3H)-ona). A differenza di altre molecole che agiscono nella stessa maniera, il domperidone in pratica non attraversa la barriera ematoencefalica, motivo per il quale non gli si attribuiscono effetti secondari di tipo extrapiramidale (Reyntjens et al.,1978; Rooyen et al.,1981; Kohli et al.,1983). Questa caratteristica, insieme con altre emerse dagli studi tossicologici condotti su Leisguard, dimostra il suo ampio margine di sicurezza. Il domperidone è stato utilizzato ampiamente sia nell uomo sia nel cane come agente antiemetico e gastrocinetico: entrambe queste attività sono dovute al blocco dei recettori dopaminergici D 2 al livello del centro del vomito integrato nel bulbo rachideo e a livello del tratto digestivo superiore, rispettivamente (Brodgen et al.,1982; Reyntjens et al.,1982; Prakash et al.,1998; Takahashi et al.,1991; Johnson,1992; Barone,1999; Hall et al., 2000). Meno conosciuta è la sua attività endocrina iperprolattinemica derivata dal blocco dei recettori dopaminergici D 2 a livello della ghiandola pituitaria o ipofisi. Tale blocco comporta la liberazione acuta della prolattina accumulata nell ipofisi, da cui deriva un picco ematico transitorio di questo ormone che dura poche ore (Kato et al.,1980; Fujino et al.,1980). 14

16 III. Leisguard, un nuovo strumento per combattere la leishmaniosi canina Numerosi studi dimostrano che la prolattina, oltre a partecipare nella regolazione ormonale della funzione riproduttiva, svolge anche un ruolo fondamentale nello sviluppo e nella funzione del sistema immunitario, agendo come una citochina. Si è visto che la prolattina ha una grande influenza sulla proliferazione e differenziazione di molte delle cellule del sistema immunitario che partecipano sia nella risposta cellulo-mediata sia in quella umorale. La maggior parte di esse possiedono infatti i recettori per la prolattina e peraltro hanno anche la capacità di sintetizzarla. (Swarko- Sonta, 1992; Reber,1993; Vera-Lastra et al., 2002; Chavez Rueda et al., 2005). Di fatto è stato dimostrato che, attraverso la modulazione di altre citochine, la prolattina stimola la risposta immunitaria cellulo-mediata inducendo le cellule NK e i linfociti T a produrre una maggior quantità di IFN-γ che, a sua volta, stimola l attività fagocitaria e il potenziale parassiticida delle cellule NK, i neutrofili e i monociti-macrofagi incaricati di eliminare la Leishmania (Matera et al.,1997 y 2000; Plocinski et al., 2007). Allo stesso modo, è stato descritto come la prolattina favorisca la presentazione corretta dell antigene da parte dei macrofagi e delle cellule dendritiche (Matera et al., 2001), un passo fondamentale per la creazione di un adeguata risposta immunitaria di tipo adattativo prevalentemente cellulo-mediata a protezione dalla Leishmaniosi. III.3. Una posologia minuziosamente stabilita Sia la dose che la forma di somministrazione terapeutica di Leisguard nella specie canina sono state stabilite minuziosamente con lo scopo di garantire la massima efficacia immunostimolante della risposta cellulare. In conformità con quanto risulta dalle fonti bibliografiche, va rilevato che tale effetto non si ottiene a partire di un incremento mantenuto nel tempo dei livelli sanguigni di prolattina. Ciò che realmente stimola la risposta immunitaria è invece la ripetizione periodica di picchi puntuali di quest ormone indotti dal principio attivo di Leisguard (Rovensky et al.,1995, 1996 y 1999). I risultati di diversi studi sul cane hanno indotto a ritenere che la dose di Leisguard più adeguata per ottenere un incremento significativo di prolattina nel sangue corrisponda a 1 ml/10 kg, equivalente a 0,5 mg/kg di domperidone. Così, dopo la somministrazione orale di detta dose di Leisguard si verifica un picco di prolattina nel sangue, con un livello massimo che è raggiunto all incirca due ore dopo la somministrazione del prodotto, livello che poi diminuisce progressivamente fino a tornare ai valori basali una volta trascorse da 24 a 36 ore dalla somministrazione del prodotto (Figura 9). 15

17 Si è peraltro accertato che il prodotto produce lo stesso effetto tanto nei maschi come nelle femmine: in entrambi i sessi si osservano dei picchi di prolattina molto simili, nonostante che le femmine partano da dei valori di base leggermente più elevati (Sabaté et al., 2005 y 2006a). Figura 9. Profilo farmacocinetico dei livelli di prolattina sierica nel cane (Media ± ES) dopo la somministrazione di una dose di 1 ml/10 kg di Leisguard. Placebo Prolattina (ng/ml) ore Il dosaggio sopra indicato appare ottimale, poiché permette di ripetere la somministrazione di Leisguard ogni 24 h senza che si produca un accumulo di prolattina nel sangue. Grazie a questa particolarità si mantiene l ampiezza dei picchi giornalieri di quest ormone durante il trattamento, garantendo così la massima efficacia immunostimolante della risposta cellulo-mediata. Tutto ciò è stato confermato in altri studi i cui risultati dimostrano che dopo la somministrazione ripetuta di Leisguard a 1 ml/10 kg/24 h per 30 giorni consecutivi: 1) i livelli basali di prolattina si mantengono stabili durante tutto il trattamento, restando all interno di valori fisiologici, fatto che conferma l assenza di un fenomeno di accumulo e 2) l ampiezza dei picchi giornalieri di prolattina rimane costante dal primo all ultimo giorno di trattamento: donde la prova che non si verifica assuefazione alla somministrazione ripetuta del farmaco (Larraga et al., 2007; Sabaté et al., 2006 b) (Figura 10). 16

18 III. Leisguard, un nuovo strumento per combattere la leishmaniosi canina Figura 10. Simulazione del profilo farmacocinetico della prolattina sierica nel cane dopo la somministrazione di un trattamento di 30 giorni con Leisguard Prolattina (ng/ml) giorni D altra parte, l effetto della somministrazione ripetuta di Leisguard sul sistema immunitario e in particolare il potenziamento della risposta immunitaria cellulomediata è stato avvalorato dai risultati di un altro studio (Larraga et al., 2007), nel quale fu valutato l effetto del trattamento sulla risposta immunitaria acquisita attraverso l evoluzione del rapporto tra le citochine che potenziano la risposta cellulomediata (Th1) e quelle che fomentano la risposta di tipo umorale (Th2) sintetizzate dai monociti-macrofagi di cani sani stimolati in precedenza con un antigene aspecifico di Leishmania infantum e trattati con Leisguard per un mese (Figura 11). Figura 11. Evoluzione del rapporto citochine Th1:Th2 (IFNγ : IL-10) nel supernatante di un mezzo di coltura di monociti-macrofagi provenienti da cani sani di razza Beagle immunizzati con antigeni aspecifici di Leishmania infantum e trattati con Leisguard (1ml/10kg/24h) per 4 settimane consecutive (n=8) versus cani non trattati di un gruppo Controllo (n=8). Lo studio fu realizzato nel Centro di Ricerche Biologiche del consiglio Superiore delle Ricerche Scientifiche (Spagna). Controllo Rapporto IFN- γ: IL- 10 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Th1 : Th Giorni 17

19 Da come si evince dalla Figura 11, la somministrazione ripetuta di Leisguard nella posologia raccomandata (1ml/10kg/24h) comporta uno spostamento progressivo del rapporto delle citochine Th1:Th2 verso una maggiore prevalenza di Th1, che aumenta significativamente dopo un mese di trattamento. La dose e la forma di somministrazione di Leisguard con cui si ottiene una concentrazione sanguigna di prolattina capace di stimolare nel cane una risposta immunitaria cellulo-mediata (Th1) corrisponde a 1 ml/10 Kg/ 24 h per 30 giorni consecutivi. III.4. Effetto stimolante di Leisguard sulla risposta immunitaria innata Si è osservato che l instaurarsi di una risposta immunitaria acquisita di tipo prevalentemente cellulo-mediata (Th1), legata alla resistenza alla malattia, è influenzata in gran parte dalla risposta immunitaria naturale o innata (Bonilla-Escobar, 2005). Tale risposta è mediata da cellule fagocitiche come i monociti-macrofagi e i neutrofili, che fungono da barriera di protezione di fronte all infezione: alcune di queste cellule partecipano inoltre alla presentazione di antigeni alle popolazioni linfocitarie T. Per svolgere le suddette funzioni queste cellule devono essere debitamente attivate. L effetto di Leisguard su queste popolazioni cellulari fu dimostrato in due diversi studi (Gómez-Ochoa et al., 2004 y 2008) utilizzando, a questo fine, una tecnica precedentemente convalidata: il test di riduzione del Nitroblu di Tetrazolio o NBT, che permette di discernere tra le cellule fagocitiche attivate e non attivate per mezzo di una reazione colorimetrica (Gómez-Ochoa et al., 2010ª, 2012; Scarpona et al., 2010). I risultati della prima ricerca (Gómez-Ochoa et al., 2004) resero evidente l aumento significativo (p<0.05) della percentuale di monociti-macrofagi e neutrofili attivati dal 5º giorno di trattamento fino al termine dello stesso (Figura 12). 18

20 III. Leisguard, un nuovo strumento per combattere la leishmaniosi canina Figura 12. Evoluzione della percentuale (Media±ES) di cellule fagocitiche (monociti-macrofagi e neutrofili) attivate prima e durante un trattamento di 30 giorni con domperidone in cani sani di razza Beagle (n=20). Lo studio fu realizzato nel Dipartimento di Patologia Animale dell Università di Saragozza (Spagna). % D0 D5 D15 D30 p < 0.05 vs D0 I risultati del secondo studio (Gómez-Ochoa et al., 2008), in questo caso comparativo, confermarono quelli dello studio precedente e dimostrarono che l attivazione significativa dei monociti-macrofagi e dei neutrofili indotta da un trattamento di 1 ml/10 Kg/24 h durante 30 giorni consecutivi con Leisguard si protrae oltre il periodo di trattamento per poi diminuire progressivamente quando questo è sospeso (Figura 13). Figura 13. Evoluzione della percentuale (Media ± ES) di cellule fagocitiche attivate prima, durante e dopo un trattamento di 30 giorni con Leisguard (1ml/10kg/24h) in cani sani sieronegativi per Leishmania (n=20). Lo studio fu realizzato nel Dipartimento di Patologia Animale dell Università di Saragozza (Spagna). % Monociti-macrofagi attivati % Neutrofili attivati Controllo D0 D15 D30 D60 D90 0 D0 D15 D30 D60 D90 p <

21 Come risulta dal Figura 13, le percentuali di attivazione in entrambe le popolazioni cellulari diminuiscono progressivamente fino a recuperare i loro valori basali, due mesi dopo la conclusione del trattamento. La spiegazione di questo fatto è che lo studio fu condotto su animali sani: di conseguenza le popolazioni fagocitarie attivate non avevano parassiti da fagocitare né antigeni da processare/presentare alle popolazioni di linfociti T coinvolti nell induzione della risposta immunitaria acquisita. Per questo motivo non si attivarono i meccanismi di retro alimentazione della risposta immunitaria cellulo-mediata (Th1) la quale invece, in un animale infetto, sarebbe stata indotta e mantenuta più a lungo nel tempo, così come dimostrano i risultati dello studio descritto nel seguente paragrafo. La somministrazione di Leisguard nella posologia raccomandata comporta la stimolazione della risposta immunitaria innata dell animale e la conseguente attivazione delle popolazioni cellulari fagocitarie che agiscono come barriera di protezione contro l infezione e partecipano alla presentazione degli antigeni alle popolazioni cellulari responsabili della risposta immune acquisita. III.5. Effetto stimolante di Leisguard sulla risposta immunitaria acquisita Come si è già detto prima, l uso di Leisguard nella posologia raccomandata conduce a una stimolazione della risposta immunitaria acquisita, spostando il rapporto delle citochine Th1:Th2 a favore di una maggiore concentrazione di Th1 (Larraga et al., 2007). Tale effetto si traduce, di fatto, in un attivazione delle cellule fagocitarie incaricate di eliminare il parassita, come i macrofagi e i neutrofili. Ciò è stato confermato da uno studio condotto su cani con una lieve forma di Leishmaniosi (Gómez-Ochoa et al., 2009a), i cui risultati dimostrarono che la somministrazione di Leisguard in animali malati induce un aumento significativo della percentuale di monociti-macrofagi e neutrofili attivati che, a differenza di ciò che succede negli animali sani, si prolunga oltre la durata del trattamento (Figura 14). Ciò è dovuto al fatto che la variazione del rapporto tra le popolazioni di citochine menzionato anteriormente-derivato dalla stimolazione della risposta immunitaria cellulo-mediata (Th1)-scatena, a sua volta, dei meccanismi di retroalimentazione che promuovono l instaurazione e il mantenimento di tale reazione a lungo termine. 20

22 III. Leisguard, un nuovo strumento per combattere la leishmaniosi canina Figura 14 Evoluzione della percentuale (Media±ES) di cellule fagocitiche prima, durante e dopo un trattamento di 30 giorni con Leisguard nella posologia terapeutica in cani malati infettati in maniera naturale (n=20), con un titolo positivo di anticorpi anti-leishmania (DAT- Direct Agglutination Test = 1/400 a 1/1600, equivalente a IFI - Immunofluorescenza Indiretta = 1/80 a 1/320) e segni clinici lievi tali come la linfadenomegalia. Lo studio fu realizzato nel Dipartimento di Patologia Animale dell Università di Saragozza (Spagna). % Monociti-macrofagi attivati % Neutrofili attivati D0 D15 D30 D60 D90 0 D0 D15 D30 D60 D90 p < 0.05 vs D0 Durante lo studio i cani presentarono un miglioramento clinico progressivo statisticamente significativo (p<0.05) rispetto alla loro condizione iniziale. Tale miglioramento fu messo in relazione con l effetto osservato sull attività delle cellule fagocitarie incaricate di eliminare il parassita, confermando così l efficacia del trattamento. (Figura 15). Figura 15. Evoluzione clinica degli animali nel corso dello studio, espressa mediante un Indice Clinico (Media ± ES) anteriormente descritto nella bibliografia (Pennisi et al. 2005) D0 D15 D30 D60 D90 p < 0.05 vs D0 21

23 La somministrazione di Leisguard nella posologia raccomandata porta alla stimolazione della risposta immunitaria acquisita dell animale e alla conseguente attivazione - che si protrae nel tempo - delle popolazioni cellulari fagocitarie incaricate dell eliminazione del parassita. III.6. Leisguard per potenziare l attività leishmanicida dei macrofagi I risultati degli studi descritti nel paragrafo anteriore dimostrano chiaramente che Leisguard influisce sul sistema immunitario del cane contribuendo all instaurazione e al mantenimento (negli animali colpiti) di una risposta immunitaria di tipo prevalentemente cellulo-mediata, mediante l attivazione di popolazioni di cellule fagocitiche come i monociti-macrofagi ed i neutrofili. Numerosi studi hanno dimostrato che l attivazione cellulare migliora il funzionamento della difesa immunitaria. Nella Leishmaniosi, le cellule fagocitiche responsabili dell eliminazione del parassita come i monociti-macrofagi o le cellule NK, devono essere attivate per contrastare più efficacemente l infezione. Nel caso specifico dei monociti-macrofagi, la loro attivazione garantisce un effettivo burst respiratorio o burst ossidativo (uno dei meccanismi citotossici utilizzati da queste cellule per eliminare il parassita) ed una corretta espressione delle molecole per la presentazione degli antigeni, che si traduce in una risposta efficace contro il parassita (Bonilla-Escobar, 2005). L effetto benefico di Leisguard sulla capacità leishmanicida dei macrofagi venne confermato dai risultati di uno studio condotto nel Dipartimento di Patologia Animale dell Università di Saragozza con 10 cani sieronegativi per la Leishmania, tra i 2 e gli 8 anni d età, di diverse razze e sesso, a cui venne somministrata la specialità nella posologia raccomandata per 30 giorni consecutivi (Gómez-Ochoa et al., 2009b). Prima dell inizio del trattamento, a metà dello stesso e una volta terminato (giorno D0, D15 y D30) si realizzò un prelievo di sangue a ciascun animale, si separarono le cellule mononucleari periferiche (monociti) che furono poi seminate in un mezzo liquido per essere coltivate. Dieci giorni dopo si aggiunsero al mezzo di coltura i promastigoti di Leishmania infantum e trascorse altre 48 ore fu calcolata la percentuale di macrofagi parassitati, così come quella dei macrofagi attivati (positivi al test del NBT). 22

24 I risultati ottenuti da questo lavoro hanno evidenzato che la somministrazione di Leisguard provocò una diminuzione statisticamente significativa della percentuale di macrofagi parassitati nelle colture dei campioni ottenuti nei giorni D15 e D30 di trattamento rispetto ai valori basali (Figure 16 e 17). Questi risultati furono correlati inoltre con un aumento significativo della percentuale di macrofagi attivati. Figura 16. Immagini di macrofagi infetti che provengono da campioni ottenuti prima dell inizio del trattamento con Leisguard (A) e al termine dello stesso (B). Nella fotografia A si osserva il DNA degli amastigoti intatti nel citoplasma di un macrofago, mentre nella B si osservano tre macrofagi, due dei quali presentano il DNA frammentato degli amastigoti eliminati (immagine diffuminata nel citoplasma), l altro presenta invece gli amastigoti intatti. A B Figura 17. Evoluzione della percentuale di macrofagi infetti (Media±ES) in una co-coltura di Leishmania infantum con monociti-macrofagi che provengono da campioni di sangue prelevati dopo un trattamento di 30 giorni con Leisguard alla dose e modalità di somministrazione terapeutiche, in animali sani. % D0 D15 D30 p<0.05 vs D0 23

25 IV. Efficacia clinica di Leisguard IV.1. Leisguard per il controllo dell evoluzione clinica della Leishmaniosi canina Come si è detto in precedenza, l evoluzione clinica della Leishmaniosi canina è direttamente correlata con una risposta immunitaria acquisita di tipo prevalentemente umorale (Th2) da parte dell animale infetto. I linfociti T producono e liberano le citochine di tipo Th2, le quali inducono la sovrapproduzione di anticorpi inefficaci contro il parassita ed allo stesso tempo inibiscono l attivazione dei macrofagi e delle cellule NK, responsabili finali della distruzione della Leishmania (Solano-Gallego et al., 2009). Grazie a ciò i parassiti possono continuare a riprodursi e l animale entra in un circolo di retroalimentazione negativa che può portarlo al decesso, a meno che non si intraprenda una terapia efficace contro la malattia. I farmaci che di solito vengono utilizzati per trattare o mantenere sotto controllo la Leishmaniosi canina agiscono direttamente sui parassiti attraverso meccanismi di azione leishmanicidi o leishmaniostatici, nell intento di ridurre la carica parassitaria in attesa che l animale possa revertire la situazione e mantenere la malattia in uno stato subclinico. Tuttavia al giorno d oggi si sa che il raggiungimento di questo obiettivo dipende in primo luogo dalla capacità del cane di convertire la risposta inefficace (Th2) in una risposta effettiva prevalentemente cellulo-mediata (Th1), capace di opporsi alla progressione della malattia. La correlazione che esiste tra l effetto stimolante del domperidone sulla risposta immunitaria cellulo-mediata e la miglioramento clinico di animali malati trattati con questa molecola venne dimostrata per la prima volta in condizioni naturali in una ricerca sul campo realizzato nell Ospedale Veterinario dell Università di Saragozza (Spagna) (Gómez-Ochoa et al., 2009c). Lo studio fu fatto su 98 cani infettati a seguito di numerose esposizioni naturali al parassita, i quali vennero poi monitorizzati per 12 mesi dopo aver ricevuto una terapia di 30 giorni con il preparato. I risultati di questo lavoro hanno messo in evidenza un chiaro miglioramento dei cani, così come anche una diminuzione statisticamente significativa del titolo di anticorpi anti-leishmania, soprattutto nei casi lievi. Gli studi clinici di efficacia realizzati su Leisguard che ne avallano l uso terapeutico vengono descritti qui di seguito. 24

26 IV. Efficacia clinica di Leisguard Studi clinici con Leisguard per il controllo dell evoluzione clinica della Leishmaniosi canina L efficacia terapeutica di Leisguard in animali con infezione naturale è stata confermata in vari studi realizzati con la collaborazione di vari veterinari clinici. Uno de questi, portato a termine con 20 cani, è già stato illustrato in un anteriore paragrafo (Gómez-Ochoa et al., 2011) ed ha evidenziato che il miglioramento clinico dei cani con un infezione naturale durante e dopo il trattamento è collegata con un aumento della percentuale di monociti/macrofagi attivati. I risultati di questa ricerca coincidono con quelli di un altro lavoro realizzato dallo stesso autore su 98 cani malati (Gómez-Ochoa et al., 2009c). Esiste inoltre un altro studio di campo con gruppo cieco di controllo con 41 cani sieropositivi per Leishmania con sintomatologia clinica lieve, realizzato in due cliniche veterinarie, a Valencia e a Saragozza (Spagna) (Gómez-Ochoa et al., 2010b). Lo studio seguì le linee guida della Buona Pratica Clinica (VICH-GL9), con l autorizzazione dell Agenzia Spagnola dei Medicinali e dei Prodotti Sanitari. Cani di entrambi i sessi e distinte razze, età e peso furono assegnati aleatoriamente a due gruppi omogenei: trattamento e placebo (Figura 18). Tutti gli animali presentavano un titolo positivo di anticorpi anti-leishmania da lieve a moderato (DAT=1/400 a 1/1600, equivalente a IFI=1/80 a 1/320) e segni clinici lievi compatibili con la malattia (linfoadenomegalia, lesioni cutanee, ecc ). Nessuno degli animali mostrava alterazioni clinicopatologiche o renali. Figura 18. Caratteristiche dei cani appartenenti a ciascun gruppo e test di omogeneità tra gruppi. (n=22) Placebo (n=19) p Valore Sesso (nº e %) Maschi Femmine 9 (40.9%) 13 (59.1%) 5 (26.3%) 14 (73.7%) Età (anni) Media ± DS Range 6 (2.7) (2.1) Peso (kg) Media ± DS Range Meticcio Pastore Tedesco Levriero Husky Cocker 18.2 (9.52) (77.3%) 1 (4.5%) 3 (13.6%) 1 (4.5%) 0 (0%) 20.3 (8.96) (68.4%) 1 (5.3%) 4 (21.1%) 0 (0%) 1 (5.3%) Razza (nº e %)

27 Gli animali del gruppo trattamento ricevettero una dose di Leisguard di 1 ml/ 10 Kg/24 h per 30 giorni consecutivi. Agli animali del gruppo placebo fu invece somministrato l eccipiente della specialità per lo stesso periodo di tempo. Allo scopo di garantire la cecità dello studio l aspetto dei prodotti fu mascherato per nasconderne la natura. Nel periodo di controllo dai 6 ai 10 mesi successivi (con una media di 7 mesi) gli animali furono sottoposti ad accertamenti clinici: prima del trattamento (analisi di base o iniziale), dopo 3 mesi controllo (Intermedio) e dopo 7 mesi (Finale) dall inizio del trattamento. Per poter valutare l efficacia del trattamento con domperidone, in ciascuno degli esami clinici si procedette alla valutazione assegnando un punteggio a 11 parametri clinici e biochimici specifici con cui alla fine si calcolava un Indice Clinico di cui sono giá stati dati i riferimenti bibliografici in questo testo (Pennisi et al. 2005). Nel corso dello studio, negli animali del gruppo placebo si osservò un peggioramento statisticamente significativo (p<0,05) delle condizioni cliniche, indicativo della progressione della malattia rispetto allo stadio iniziale o di base. Al contrario, gli animali del gruppo trattamento sperimentarono una miglioria clinica statisticamente significativa (p<0,05) evidente a partire dai 3 mesi dall inizio del trattamento. In particolare, mentre l.84% dei cani del gruppo placebo peggiorarono o non presentarono nessuna variazione in quanto a situazione clinica, l.82% dei cani appartenenti al gruppo trattamento mostrarono un miglioramento clinico statisticamente significativo (Figura 19). Figura 19. Condizioni cliniche degli animali alla fine del periodo di controllo rispetto alla situazione iniziale. Placebo % Miglioramento Stabilizzazione/Peggioramento p<

28 IV. Efficacia clinica di Leisguard Tra i parametri che subirono maggiori variazioni si trovavano il titolo degli anticorpi anti-leishmania ed il grado di linfoadenomegalia. Nel periodo di controllo posteriore al trattamento si osservò che gli animali trattati con Leisguard avevano presentato un miglioramento significativa in entrambi i parametri, mentre invece negli animali del gruppo di controllo questi erano peggiorati (Figura 20). Figura 20. Variazioni nel titolo degli anticorpi anti-leishmania e grado di linfoadenomegalia in entrambi i gruppi nel corso dello studio. A) Variazioni nel titolo di Ac-antileishmania (in % di animali) % Esame iniziale <1/400 1/400 1/800 1/1600 1/3200 Placebo Diff. non significative % Esame finale MIGLIORAMENTO PEGGIORAMENTO Placebo p<0.001 <1/400 1/400 1/800 1/1600 1/

29 B) Variazioni nel grado di linfadenopatia (in % di animali) %100 Esame iniziale Placebo Dif. non significative Assente Da 1 a 2 gangli Da 3 a 4 gangli Da 5 a 6 gangli > 6 gangli %100 Esame finale MIGLIORAMENTO 45.5 PEGGIORAMENTO p<0.05 Placebo Assente Da 1 a 2 gangli Da 3 a 4 gangli Da 5 a 6 gangli > 6 gangli 28

30 IV. Efficacia clinica di Leisguard In conclusione, l analisi statistica delle differenze osservate nell Indice Clinico in entrambi i gruppi di trattamento in tutti gli esami mise in evidenza, in primo luogo, l assenza di differenze statisticamente significative tra i valori basali (confermando così l omogeneità fra i due gruppi) e, in secondo luogo, l esistenza di differenze statisticamente significative tra gruppi alla fine del periodo di osservazione (7 mesi), a favore del gruppo trattato con Leisguard (p<0.05) (Figura 21). Figura 21. Evoluzione dell Indice Clinico (Media±ES) in entrambi i gruppi durante lo studio. 9.0 Placebo ,0 Iniziale Mese 3 Mese 7 p<0.05 Nessuno degli animali dello studio presentò segni clinici indicativi di intolleranza al trattamento con Leisguard. Leisguard è un trattamento sicuro ed efficace per il controllo dell evoluzione clinica della Leishmaniosi canina nei casi lievi o agli stadi iniziali della malattia. 29

31 IV.2. Leisguard per la prevenzione della Leishmaniosi canina Come si è detto in precedenza, dopo l inoculazione dei parassiti di Leishmania nella cute da parte del flebotomo, ha inizio un proceso infiammatorio locale, con accumulo di cellule residenti e cellule del sangue periferico che migrano al tessuto attraverso l endotelio vascolare, richiamate dalla presenza del parassita. Queste popolazioni cellulari costituiscono la difesa non specifica dell animale verso la Leishmania, conosciuta come risposta immunitaria innata, la quale, oltre ad esercitare un controllo iniziale dell infezione, influisce stimolando la reazione immunitaria specifica in base alla quale si sviluppa la resistenza o la suscettibilià alla malattia (Bonilla-Escobar, 2005). In linea con gli studi descritti nei paragrafi anteriori, la somministrazione di Leisguard ain animali sani comporta l attivazione delle suddette popolazioni cellulari e, in special modo, del loro potenziale leishmanicida, meccanismo chiave attraverso il quale si giustifica la sua efficacia nella prevenzione della Leishmaniosi canina. A seguire vengono descritti gli studi clinici di efficacia di Leisguard che avallano il suo uso in prevenzione. Studi clinici con Leisguard per la prevenzione della Leishmaniosi L efficacia di Leisguard nel ridurre il rischio di infezione dalla Leishmania ed il conseguente sviluppo della malattia clinica è stata dimostrata in due studi di campo, realizzati su più di 400 cani di diverse razze, età e peso, provenienti da varie zone del bacino mediterraneo, sia ad alta che a bassa incidenza di malattia. La particolarità di entrambi gli studi riguarda il fatto che invece di utilizzare un trattamento di una sola dose di Leisguard si ritenne di optare per un programma di prevenzione strategico in funzione del rischio specifico d infezione, con la somministrazione di due o tre trattamenti distribuiti nel corso dell anno, in modo da prolungare la profilassianche durante il periodo di attività del vettore. Le basi teoriche della scelta di questo programma derivano dal fatto che Leisguard agisce, come già detto, sull attivazione della risposta innata dei cani non infettati. Ricordiamo nuovamente che Leisguard istimola l attivazione delle popolazioni fagocitarie che costituiscono la prima linea di difesa dell animale e ne aumentano il potenziale leishmanicida. Nel caso in cui l animale non entri in contatto con il parassita, la percentuale di macrofagi attivati diminuisce progressivamente dopo il trattamento. 30

32 IV. Efficacia clinica di Leisguard Ciononostante, se il cane si infetta in questo periodo, i macrofagi sono capaci di eliminare più agevolmente il parassita e presentare l antigene in maniera efficace alle popolazioni linfocitarie, potenziando prevalentemente la risposta immunitaria acquisita cellulo-mediata (Th1), capace di arrestare la malattia. Tale risposta, a sua volta, assicura un azione continua delle popolazioni fagocitiche incaricate di eliminare il parassita (Figura 22). Figura 22. Simulazione dello stato di attivazione delle popolazioni cellulari fagocitiche (macrofagi e neutrofili) nel corso di un programma di trattamento la cui durata fu stabilita strategicamente includendovi il periodo di attività del vettore della malattia. Maggio/Giugno Settembre/Ottobre Mag/Giu Set/Ott Attivazione macrofagi/ neutrofili Mag/Giu Set/Ott Th1:Th2 Attivazione macrofagi/ neutrofili Mag/Giu Set/Ott Attivazione macrofagi/ neutrofili Th1:Th2 31

33 Da queste premesse si può desumere che la somministrazione di Leisguard ripetuta più volte all anno in trattamenti di trenta giorni applicati in maniera strategica in funzione del rischio d infezione-facendo coincidere le somministrazioni con l inizio e la fine del periodo di attività del vettore- garantisce un adeguata stimolazione del sistema immunitario per combattere l infezione nei periodi in cui gli animali sono più esposti a rischio di contagio. In zone a bassa incidenza L efficacia preventiva di Leisguard nelle zone a bassa incidenza di malattia è stata dimostrata da uno studio fatto a Valladolid (Spagna) su 240 cani clinicamente sani e sieronegativi per Leishmania infantum (DAT < 1/400), di varie razze, sesso, peso ed età (Gómez-Ochoa et al., 2009d). Lo studio è stato fatto seguendo le linee guida delle Buone Pratiche Cliniche (VICH-GL9), con l autorizzazione dell Agenzia Spagnola dei Medicinali e dei Prodotti Sanitari. Lo studio cominciò nel mese di giugno, in concomitanza con l inizio del periodo di attività del vettore e durò 9 mesi. La metà degli animali (n.120) ricevette due trattamenti con Leisguard, uno all inizio ed un altro alla fine del periodo di attività del vettore nella zona (giugno e settembre), ad una dose di 1ml/10kg/24h, per 30 giorni consecutivi. Gli altri cani non ricevettero il trattamento. Non vennero applicati sugli animali in studio ulteriori prodotti o collari insetticidi. Tutti gli animali vennero esaminati clinicamente e periodicamente allo scopo di individuare segni clinici compatibili con la malattia. Al termine dello studio si prelevò un campione di sangue a ciascuno degli animali per ottenere il titolo di anticorpi anti-leishmania. Nel corso dello studio la maggior parte dei cani presentarono una situazione clinica normale, eccetto alcuni individui appartenenti a entrambi i gruppi di trattamento che soffrirono ferite superficiali accompagnate da una lieve linfoadenomegalia come conseguenza di lotte fra di essi. Altri 7 animali del gruppo non trattato mostrarono linfoadenomegalia e alopecia nell ultimo mese di controllo. Al termine dello studio, questi 7 animali furono gli unici a risultare sieropositivi per la Leishmania (DAT 1/400) (Figura 23). In questi animali l infezione fu confermata dall osservazione diretta di amastigoti di Leishmania all interno dei macrofagi in alcuni campioni di linfonodi o midollo osseo ottenuti mediante l agoaspirato. Tutti gli animali trattati si mantennero sieronegativi e non mostrarono i segni clinici della malattia. 32

34 IV. Efficacia clinica di Leisguard Figura 23. Titolo di anticorpi anti-leishmania (DAT) dei cani del grupo trattato con Leisguard (n=120) e di quelli del gruppo controllo (n=120) alla fine del trattamento. 1/1600 Titolo (DAT) 1/1400 1/1200 1/1000 1/800 1/400 1/200 0 Cut off= 1/400 Controllo Le differenze osservate tra il gruppo controllo e il gruppo trattato in termini di incidenza della malattia (5.83% vs 0%) risultarono statisticamente significative (p<0.001). Se ne desume così, all evidenza, la grande efficacia di un programma di prevenzione come quello stabilito nello studio di cui trattasi. In zone ad alta incidenza L efficacia preventiva di Leisguard in zone ad alta incidenza venne dimostrata in uno studio a Valencia (Spagna), su un totale di 183 cani sani sieronegativi per la Leishmania (IFI<1/80), appartenenti a più di 24 distinte razze, di entrambi i sessi e varie età e pesi, che risiedevano in zone extraurbane con una prevalenza superiore al 20%. Lo studio venne realizzato con l autorizzazione dell Agenzia Spagnola dei Medicinali e dei Prodotti Sanitari e fu suddiviso in due fasi: Fase I La prima fase (LLinás et al. 2011a) durò 21 mesi e fu eseguita su 90 cani distribuiti in due gruppi omogenei: il gruppo trattato ed il gruppo controllo (Figura 24). 33

35 Figura 24. Caratteristiche dei cani in entrambi i gruppi e analisi di omogeneità. Controllo P valore Sesso (n y %) Maschi Femmine 25 (56.8%) 19 (43.2%) 25 (54.3%) 21 (45.7%) Età (años) Media±DS Range 5 (2.2) (2.3) Peso (kg) Media±DS Range Meticcio Altre * 20.3 (10. 83) 20.4 (8.46) (50.0%) 23 (50.0%) Razza (n y %) 13 (29.5%) 31 (70.5%) * Fino a 24 razze diverse Gli animali del gruppo trattato (n=44) ricevettero una dose di Leisguard di 1ml/10kg/24h per 30 giorni consecutivi, ogni 4 mesi per i 21 mesi di durata dello studio. In tutti i casi il primo trattamento fu effettuato all inizio del periodo di attività del vettore (maggio-giugno). Gli animali del gruppo controllo non ricevettero invece nessun trattamento. Gli animali furono assegnati aleatoriamente a ciascun gruppo. Tutti i proprietari dei cani concordarono di non applicare collari o altri prodotti insetticidi per tutto il periodo dello studio. Tutti gli animali furono sottoposti periodicamente a degli accertamenti per eventualmente individuare i segni clinici patognomonici della malattia. In ogni analisi veniva estratto un campione di sangue di tutti gli animali per determinarne il titolo di anticorpi anti- Leishmania. Quando dagli esami emergevano segni clinici compatibili con la malattia (linfoadenomegalia, dermatite ) ed un titolo positivo di anticorpi (IFI 1/80)- sintomi indicativi di infezione attiva e della progressione della malattia- l animale veniva escluso dallo studio e trattato in base al criterio clinico del veterinario. Con i risultati ottenuti da questo lavoro si realizzarono due analisi statistiche: dopo 12 e 21 mesi dall inizio dello studio. La percentuale di animali malati (sierologia positiva e sintomatologia clinica) fu significativamente più bassa nel gruppo trattato con Leisguard che nel gruppo controllo, sia dopo 12 mesi (7% vs. 35%; p=0.003) che dopo 21 mesi (11% vs. 48%; p<0.001) (Figura 25). 34

36 IV. Efficacia clinica di Leisguard Figura 25. Percentuale di animali con infezione attiva e progressione della malattia negli animali dopo 12 e 21 mesi dall inizio del programa di prevenzione con Leisguard nel gruppo trattato. % p<0.001 p= % 35% 11% 7% mese 12 mese 21 Controllo Inoltre, come si evince dal grafico 26, dall analisi di tutti i cani sieropositivi di entrambi i gruppi al momento in cui furono esclusi dallo studio, risultò che i titoli di anticorpi anti-leishmania erano più elevati nel gruppo controllo che nel gruppo trattato con Leisguard. Figura 26. Distribuzione dei titoli anticorpali nei cani di entrambi i gruppi esclusi dallo studio. Controllo % <1/40 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/

37 Allo stesso modo, come si osserva nel grafico 27, si riscontrarono differenze statisticamente significative tra i due gruppi (p<0.001), a favore del gruppo trattato con Leisguard : tali risultati sono quelli osservati in relazione al tempo trascorso fino all esclusione degli animali dallo studio. Figura 27. Curve di evoluzione della percentuale di animali sieronegativi clinicamente sani in entrambi i gruppi dello studio. % p < Controllo Mesi Basandoci sulla somma delle percentuali dei cani sani e malati in entrambi i gruppi alla fine dello studio, l efficacia preventiva che si attribuisce al programma di trattamento con Leisguard alle condizioni del presente studio fu dell 80% (Figura 28). Secondo questi dati, infatti, il rischio di sviluppare la malattia clinica (calcolata in termini di Odds-ratio) è 7.2 volte inferiore negli animali trattati con Leisguard che negli animali non trattati (p<0.001). Figura 28. Interpretazione dei risultati dopo 21 mesi. Controllo (n= 46) (n= 44) Infetti Sani 22 (48%) 24 (52%) 5 (11%) 39 (89%) Efficacia preventiva = / 0.48 = 0.8 (80%) Odds-ratio (OR) = 0.48/ 0.52) / (0.11/ 0.89) = 7.2 (I.C. 95% = ) Significatività statistica p <

38 IV. Efficacia clinica di Leisguard Fase II Gli obiettivi della seconda fase dello studio furono, in primo luogo, confermare e avvalorare i risultati della prima parte aumentando il numero degli animali in studio grazie all aggiunta di 93 cani sieronegativi (DAT<1/400) provenienti dalla stessa zona geografica e dallo stesso centro veterinario degli animali della prima fase e, in secondo luogo, quello di prolungare le osservazioni al successivo periodo di attività del vettore (LLinás et al., 2011 b). In questa seconda fase, tutti i cani ricevettero due trattamenti preventivi con Leisguard, uno all inizio e un altro alla fine del periodo di attività del vettore (maggio/ giugno e settembre/ottobre) a una dose di 1 ml/10 kg/24 h per 30 giorni consecutivi. Gli animali furono sottoposti a degli accertamenti periodici per 9 mesi per identificare eventuali segni clinici compatibili con la malattia. Al termine dello studio si fece un prelievo di sangue a ogni animale per determinare il titolo di anticorpi anti- Leishmania. Come già era avvenuto nella fase I, neppure in questa fase di controllo si applicarono sui cani dei collari insetticidi o altri prodotti repellenti. I risultati di questa seconda parte dello studio furono poi messi a confronto con quelli ottenuti dal gruppo controllo de la fase I (controllo storico). Nel corso dello studio la maggior parte dei cani presentarono una situazione clinica normale, senza mostrare nessun segno compatibile con la Leishmaniosi. Tuttavia, l analisi sierologica dei campioni di sangue ottenuti alla fine dello studio mise in evidenza la presenza di 7 animali sieropositivi: 1 cane con un titolo DAT=1/800 e 6 cani con un titolo DAT=1/1600. La percentuale di animali sieropositivi ottenuti nella seconda fase dello studio fu simile a quello del gruppo trattato (dopo 12 mesi) della fase I (7.5% e 7%, rispettivamente). Mettendo a confronto questa percentuale con quella degli animali sieropositivi nel gruppo non trattato della prima fase (controllo storico) le differenze osservate furono statisticamente significative (7.5% vs 35%; p<0.001). In conformità con questi dati, si desume che l efficacia preventiva attribuibile al programma di prevenzione con Leisguard risultò essere dell 80%, così da avallare i risultati ottenuti nella prima fase (Figura 29). In conclusione si deve sottolineare che solo 4 dei cani inclusi nel gruppo trattato con Leisguard presentarono segni clinici dovuti a un effetto secondario al trattamento (2 galattorrea, 1 feci blande e 1 diarrea). 37

39 Figura 29. Interpretazione dei risultati mettendo a confronto gli animali sottoposti a trattamento della Fase II con quelli non trattati nella Fase I, dopo 12 mesi. Fase II (n= 93) Controllo Fase I (n= 44) Malati Sani 7 (7.5%) 86 (92.5%) 16 (35%) 30 (65%) Efficacia preventiva (80%) Significatività statistica p < Leisguard è un trattamento sicuro ed efficace per ridurre il rischio di sviluppare un infezione attiva da Leishmania in caso di contatto con il parassita, quando si somministra seguendo un programma di prevenzione strategico in zone endemiche a bassa o alta incidencia della malattia. 38

40 V. Come usare Leisguard nella pratica? V.1. Il prodotto Leisguard si presenta in flaconi di 60 ml di sospensione ad una concentrazione di 5 mg di domperidone/ml, che corrisponde a 1 ml per ogni 10 kg di peso (equivalente a 0.5 mg/kg di principio attivo). Il prodotto si presenta con due siringhe incluse nella confezione che permettono un dosaggio molto preciso per animali di qualsiasi peso. Un flacone di 60 ml è sufficiente per un trattamento di 30 giorni per un cane di 20 kg. Nel caso in cui rimanga del prodotto nella confezione, questo può essere utilizzato in un altro ciclo di trattamento, sempre che si somministri entro gli 8 mesi successivi all apertura del confezionamento primario. In tutte le prove realizzate con Leisguard il prodotto è stato tollerato dai cani senza problemi, sia in somministrazione orale, sia mescolato all alimento. Di fatto, secondo gli studi di farmacocinetica e biodisponibilità realizzati con Leisguard, quando lo si somministra insieme al cibo si raggiungono concentrazioni plasmatiche superiori del principio attivo piuttosto che quando viene dato a digiuno (Figura 30). Allo stesso modo è stato provato che in qualsiasi modalità di somministrazione (forzata o nell alimento), si ottengono dei picchi di prolattina molto simili (Figura 31). Pertanto, la somministrazione nell alimento è particolarmente indicata quando si tratta di cani mantenuti individualmente o che vivono da soli. Se non si può garantire che il paziente ingerisca tutto l alimento con la dose di prodotto adeguata al suo peso, per esempio quando si hanno vari cani che convivono nello stesso ambiente, è di gran lunga preferibile assicurarsi del corretto dosaggio di Leisguard somministrandolo direttamente in bocca. Ciononostante la somministrazione ripetuta di dosi troppo elevate o al contrario troppo basse di Leisguard nell alimento potrebbe compromettere il picco di prolattina ed il suo ritorno al livello di base, fatto che potrebbe modificare la sua efficacia sia quanto alla prevenzione che al trattamento della Leishmaniosi. Dato che il potenziamento della risposta cellulare si raggiunge grazie ad una successione di picchi transitori di prolattina (Rovensky et al. 1995, 1996 y 1999) che si verificano quando Leisguard è somministrato nella posologia corretta, è necessario stabilire il peso esatto dell animale e somministrare il prodotto nella dose precisa utilizzando l opportuno dosatore. 39

41 Figura 30. Livelli plasmatici di domperidone dopo la somministrazione di una dose di Leisguard a digiuno o insieme all alimento (media ± deviazione standard) con l alimento a digiuno 25 ng/ml ore Figura 31. Livelli plasmatici di prolattina dopo la somministrazione di una dose di Leisguard a digiuno o insieme all alimento (Media ± DS). 40 con l alimento a digiuno 30 ng/ml ore 40

42 V. Come usare Leisguard nella pratica? V.2. Un eccellente profilo di sicurezza Il domperidone (principio attivo di Leisguard ) praticamente non attraversa la barriera ematoencefalica, motivo per cui non gli si attribuiscono effetti secondari di tipo extrapiramidale (Reyntjens et al.,1978; Rooyen et al.,1981; Kohli et al.,1983). Leisguard gode inoltre di un ampio margine di sicurezza, come risulta dalle prove cliniche effettuate, in cui, dopo aver applicato vari cicli di trattamento a più di 300 cani, si sono rilevati solamente dei casi isolati di galattorrea, feci blande o diarrea. D altro canto negli studi di tolleranza si somministrò il prodotto a dosi fino a 5 volte superiori a quelle terapeutiche per un anno senza riscontrare effetti avversi evidenti. Di conseguenza non c è da aspettarsi nessuna alterazione nel paziente in caso di sovradosaggio. Gli studi sull apparato riproduttore effettuati su animali da laboratorio non hanno evidenziato nessun indizio di effetti teratogenici o tossici nè per l embrione nè per la madre, neppure a dosi 20 volte superiori a quella raccomandata. Tuttavia, dato che non vi sono sufficienti studi controllati su cagne gestanti, si impone una valutazione critica del rapporto rischio/beneficio prima di procedere al loro trattamento in tale condizione. Se si somministra il prodotto a femmine di cane gestanti, infatti, è molto probabile che si produca un aumento di produzione del latte. Per il suo meccanismo d azione il prodotto deve quindi essere usato con precauzione in animali con antecedenti medici di pseudogestazione, dato che potrebbe contribuire ad esacerbarne la sintomatologia. V.3. Il paziente: l importanza della diagnosi precoce Come in qualunque malattia grave, la diagnosi precoce dell infezione da Leishmania è fondamentale per garantire il successo di qualsiasi terapia. Tuttavia, così come si è descritto nei paragrafi anteriori, cani clinicamente sani possono stare sviluppando la Leishmaniosi in forma silente. Secondo Baneth et al., 2008, la malattia renale può essere l unica alterazione apparente in cani infetti. Pertanto, per conoscere esattamente lo stato del paziente è necessario complementare l esame clinico con prove diagnostiche specifiche. In funzione dei risultati si dovrà stabilire una terapia idonea, sia essa preventiva o terapeutica. 41

43 Studi recenti hanno dimostrato che una delle tecniche diagnostiche con maggiore capacità di identificare precocemente l infezione da Leishmania infantum è il test ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), mentre altri test utilizzati per identificare la Leishmaniosi come la IFI e PCR quantitativa, possiedono una minore affidabilità diagnostica (Rodriguez-Cortés et al., 2010). È altresì importante tenere presente che qualunque sia il test che scegliamo di usare, questo sia di tipo quantitativo, in quanto ci offre migliori informazioni sui gradi di sieropositività e possiede un certo valore prognostico, così come anche una maggiore sensibilità. Di fatto, anche nel caso in cui si sia ottenuto un risultato positivo mediante un test qualitativo rapido, gli esperti di Leishmaniosi consigliano di rivalutare nuovamente il paziente sottoponendolo a un test quantitativo (Cardoso et al., 2004a; Podaliri et al., 2011; Solano-Gállego et al., 2011). In un studio realizzato recentemente all Università Autonoma di Barcellona, si misero a confronto diversi kit sierologici commerciali per diagnosticare l infezione e si dimostrò che l affidabilità dei test ELISA quantitativi è significativamente superiore ai test rapidi o qualitativi. Tra questi, il migliore kit in commercio per individuare animali infettati con Leishmania infantum è il Leiscan Leishmania Elisa Test, i cui risultati presentano un affidabilità del 98% in quanto a sensibilità e precisione e un valore di 0.93 in quanto a capacità predittiva negativa. Anche nelle misurazioni globali, come l area sotto la curva ROC (Receiver Operating Characteristic), fu significativamente superiore a tutti i test qualitativi. (Rodriguez Cortés et al., 2011) Pertanto, l uso sistematico della sierologia quantitativa, anche in cani asintomatici, si è dimostrato essenziale per una diagnosi precoce dell infezione, fondamentale per il successo della terapia. In base al risultato della sierologia si può stabilire un piano d azione per ogni paziente, sia esso terapeutico o preventivo. V.4. Cosa fare dopo una diagnosi precoce positiva? Come si è già detto in precedenza, anche in assenza di segni clinici o prove diagnostiche, il risultato della sierologia ci permettono di stabilire il protocollo iniziale di trattamento, specialmente se è stata fatta una valutazione quantitativa, giacché così possiamo agire in funzione del grado di sieropositività (Figura 32). 42

44 V. Come usare Leisguard nella pratica? Figura 32. Diagnosi sierologica di Leishmaniosi passo a passo (Ferrer L. y Roura X. 2012). SIEROLOGIA positiva negativa titolo basso titolo alto citologia delle lesioni positiva citologia delle lesioni negativa Senza lesioni cutanee PCR del midollo osseo e/o gangli linfatici positiva Citologia delle lesioni cutanee negativa Istologia, immunoistochimica, PCR di biopsie della pelle positive Istologia, immunoistochimica, PCR di biopsie della pelle positive LEISHMANIOSI NO LEISHMANIOSI 43 Di fronte a un titolo sieropositivo alto (Leiscan Rz >1.5; IFI >1/160), c è da considerare che il paziente possa essere in procinto di sviluppare la Leishmaniosi (Oliva et al. 2006). Si devono quindi realizzare delle prove complementari di conferma per inquadrare clinicamente l animale. Oltre a realizzare un esame clinico completo, è necessario cercare di individuare il parassita con tecniche di isolamento o PCR e riconoscere eventuali alterazioni clinico-patologiche attraverso un protidogramma e prove di funzionalità renale. In base ai risultati ottenuti da tutte queste prove si può determinare l inquadramento clinico dell animale e in funzione della sua gravità scegliere il trattamento più adeguato. Nello schema 34 si riassumono le terapie raccomandate secondo la situazione clinica del cane. Per quei cani in cui è stata riscontrata - dopo una diagnosi completa - un infezione con sintomatologia lieve o che sono semplicemente esposti al rischio d infezione, si è dimostrato che Leisguard è sufficiente come unico strumento terapeutico per ridurre la sintomatologia clinica e il titolo anticorpale. Al contrario, un titolo anticorpale elevato è tipico invece di casi in cui l infezione si trova in uno stadio più avanzato ed è caratterizzata da una maggior severità clinica e una risposta immunitaria cellulare deficiente (Figura 33).

45 Figura 33. Quadri clinici e risposta immunitaria di cani che vivono in un area dove Leishmania infantum è endemica (Solano- Gállego et al., 2009). CANI CHE VIVONO IN ZONE ENDEMICHE non infetti sani infetti - Sieronegativi - Assenza di risposta cellulare - PCR - Infetti pero resistenti alla Leishmaniosi clinica - Sieropositivi variabili (livelli da negativi o moderati) - Risposta cellulare - PCR +/- Svilupperanno la malattia? - Sieropositivi alti - Risposta cellulare - PCR + Leishmaniosi clinica - Sieropositivi alti - Risposta cellulare - PCR + : presente; : diminuita o assente; PCR - : PCR negativo; PCR +: PCR positivo ; PCR +/- : positivo o negativo Sieropositivita elevata In questi casi è raccomandabile ridurre la carica parassitaria con prodotti leishmanicidi o leishmaniostatici, per poi di seguito somministrare Leisguard in modo da ottenere il massimo effetto immunomodulatore e migliorare la prognosi del paziente. Seguendo le raccomandazioni attuali (Solano-Gállego et al., 2011) si deve fare una nuova valutazione del paziente 30 giorni dopo il trattamento con un leishmanicida o leishmaniostatico, momento in cui si può iniziare il primo ciclo di trattamento con Leisguard nella posologia raccomandata (1ml/10kg/d x 30d). Questi pazienti devono essere periodicamente valutati ogni 3-4 mesi per un anno e si raccomanda di ripetere quadrimestralmente il trattamento con Leisguard facendolo coincidere con gli esami clinici di controllo. È però indicato ripetere l analisi sierologica ogni 6 mesi. Nel caso in cui, una volta trascorsi 6-12 mesi dall inizio della terapia, si raggiunga la stabilizzazione della situazione del paziente (miglioramento clinico evidente, normalizzazione del protidogramma e stabilizzazione o riduzione dei livelli anticorpali) si può mantenere il paziente all interno di un programma di prevenzione di recidive con Leisguard nelle modalità descritte qui di seguito (programma Leispro ). 44

46 V. Come usare Leisguard nella pratica? Di fronte a una sieropositività bassa (Leiscan Rz ; IFI 1/80-1/160) ed in assenza di altri segni correlati alla malattia, ci troviamo di fronte a un cane che è stato punto da flebotomi infettanti e ha instaurato una risposta immunitaria verso la Leishmania. Ciononostante, non possiamo sapere se la risposta immunitaria dell animale sarà efficace-tipo Th1- e sarà quindi in grado di mantenere la malattia sotto controllo, o si inclinerà invece per una risposta inefficace di tipo Th2. In questi casi, fino all arrivo di Leisguard, la mancanza di un trattamento che funzionasse come agente terpeutico e preventivo allo stesso tempo ha fatto si che classicamente si consigliasse di non trattare il paziente e di aspettare il controllo successivo per dissipare i dubbi in quanto all evoluzione sierologica e clinica dell infezione. Questa strategia conduce al rischio che la malattia nel frattempo progredisca silenziosamente e che quando si inizi il trattamento l animale si trovi già in uno stadio avanzato dell infezione e la progrosi sia quindi più incerta. Ad ogni modo, nel bilancio del rapporto rischi/benefici, le raccomandazioni vigenti consideravano che il rischio di utilizzare le terapie disponibili fino ad oggi-generare possibili effetti avversi e fenomeni di resistenza che riguardano sia la malattia canina sia quella umana- superavano di gran lunga gli eventuali benefici che potessero apportare. Ciononostante, l osservanza di questa raccomandazione in molte situazioni cliniche in cui potevano intervenire altri fattori non è stata mai universalmente rispettata. Con Leisguard, questo conflitto può essere risolto, nel senso che la sua somministrazione in pazienti che sono stati esposti al parassita- però su cui esiste il dubbio che stiano effettivamente sviluppando la malattia- può soltanto aiutarli a superarla da sé, senza generare nessun tipo di resistenza né effetti collaterali rilevanti. Per cui, il bilancio rischi/benefici sull uso di Leisguard in qualunque sierologia con titolo basso (positiva) o dubbia risulta chiaramente positivo e può evitare che in una percentuale di casi, la cui entità attualmente non si conoce, la malattia progredisca a stadi più avanzati. Sieropositivita bassa In questi casi dunque, il trattamento con Leisguard, nella posologia raccomandata (1ml/10kg/d x 30 d), deve essere iniziato immediatamente dopo la diagnosi sierologica positiva, malgrado la possibilità che il veterinario-seguendo il proprio criterio clinico-realizzi ulteriori prove diagnostiche complementarie che permettano di caratterizzare meglio la situazione del paziente. In funzione del rischio dell epoca dell anno e della zona in cui vive l animale, si consiglia di ripetere un ciclo di trattamento 4 mesi dopo il primo e, seguendo le raccomendazioni attuali, ripetere un altro test sierologico 6 mesi dopo. Nel caso in cui i titoli degli anticorpi si siano stabilizzati o siano diminuiti e in assenza di altri segni clinici, possiamo conosce il paziente in un programma di prevenzione con Leisguard seguendo le modalità descritte più avanti (programma Leispro ). In caso contrario, si deve fare una valutazione completa della situazione clinica del paziente, come già si è detto in precedenza. 45

47 V.5. Come agire di fronte a una diagnosi precoce incerta? Se il risultato della sierologia è dubbio (Leiscan Rz o IFI 1/80) non si può determinare se il cane è sieropositivo; nel caso in cui il parassita non sia stato identificato mediante altre tecniche si raccomanda di ripetere l analisi dopo 6 mesi per confermare o scartare la diagnosi. Qualora gli animali fossero sieropositivi, avrebbero comunque titoli anticorpali molto bassi. Questo indicherebbe che probabilmente ci troviamo di fronte a una semplice infezione, mantenuta sotto controllo dal proprio sistema immunitario dell animale o ancora in una fase ancora molto incipiente. Dubbio Ad ogni modo, quando il risultato è incerto si raccomanda di iniziare quanto prima il trattamento preventivo con Leisguard nella posologia proposta. In questa maniera aumentiamo le possibilità che la risposta immunitaria sia efficace. Se così fosse, ciò risulterebbe evidente dalla diminuzione o negativizzazione del titolo anticorpale riscontrabile dagli esami sierologici, da ripetersi 6 mesi dopo l inizio della somministrazione del prodotto. Come nel caso precedente, se l evoluzione del paziente è stata favorevole, si può iniziare un programma di prevenzione con Leisguard adeguato alle esigenze del cane (programma Leispro ). 46

48 RISULTATO SIEROLOGÍA SITUAZIONE CLINICA Esposti, infetti o con malattia lieve Leishmaniosi clinica moderata Leishmaniosi clinica severa Leishmaniosi clinica grave Figura 34. Tabella riassuntiva sull approccio terapeutico in funzione della situazione clinica SEGNI CLINICI ALTERAZIONI CLINICO- PATOLOGICHE TERAPIA CONTROLLO PERCHÉ LEISGUARD? +/- Asintomatico o Linfadenopatia, dermatite papulare o esfoliativa Senza alterazioni Profilo renale normale (Creatinina< 1,4 mg/dl; UPC < 0,5) (1ml/10 kg/d x 30d) Ripetere dopo 4 mesi. e nuova valutazione clinica 6 mesi dopo Se controllato Programma preventivo secondo il rischio. Se 6 m > iniziale Nuova valutazione completa. Non esiste la sicurezza che questi cani siano malati, però non possiamo sapere se sono all inizio di un processo clinico a rischio di peggiorare. contribuirà a scatenare una risposta efficace di tipo Th1, se fosse necessario. Se dopo 6 mesi all iniziale, il programma preventivo proteggerà questi cani in caso di future esposizioni al parassita + / /+++ ++/+++ + Dermatite esfoliativa, onicogrifosi, anoressia, perdita di peso, epistassi, febbre + lesioni da immunocomplessi: uveite, artrite, glomerulonefrite + tromboembolia polmonare, sindrome nefrosica Anemia non rigenerativa, ipergammaglobulinemia, ipoalbuminemia. Iperviscosità sierica Profilo renale normale (Creatinina< 1,4 mg/dl; UPC < 1) + malattia renale cronica IRIS I UPC >1 o IRIS II (Creatinina 1,4-2 mg/dl) + malattia renale cronica IRIS III (Creatinina >5 mg/dl. UPC>5) Leishmanicida e/o Leishmaniostatico Leihsmanicida e/o Leishmaniostatico + IRIS per il rene Leishmaniostatico + IRIS per il rene Nuova valutazione clinica 30 giorni dopo. A seguire: (1ml/10 kg/d x 30d). Nuova valutazione clinica ogni 3-4 mesi + ogni 4 mesi x1 anno. ogni 6 mesi Se la situazione è sotto controllo: Programma preventivo secondo il rischio. La risposta immunitaria di questi cani si è scompensata, si osserva un predominio Th2 e la situazione clinica degli animali tende ad aggravarsi. Il trattamento con leishmanicidi abbassa inizialmente la carica parassitaria, però riequilibrerà la risposta immunitaria verso i Th1 per fare in modo che la risposta immunitaria dell animale si stabilizzi a lungo termine. Se e i controlli clinici semestrali mostrano una stabilizzazione del paziente, il programma preventivo proteggerà questi cani da eventuali ricadute o in caso di nuove esposizioni al parassita. contribuirà a riequilibrare la risposta immunitaria verso quella mediata dai Th1, senza danneggiare il rene.

49 V.6. Come agire di fronte a una diagnosi precoce negativa? Con un titolo sierologico negativo (Leiscan Rz <0.9; IFI <1/80) e in assenza di altri segni clinici o alterazioni clinico-patologiche, ci troviamo di fronte a un paziente sano del quale non possiamo sapere se quando entrerà in contatto con flebotomi infettanti sarà in grado di combattere l infezione da solo o se finirà con lo sviluppare la malattia. In questi casi, possiamo ricorrere a un programma preventivo, adatto alle caratteristiche della zona in cui vive il paziente e al suo stile di vita, in modo da combinare l uso strategico di Leisguard con controlli sierologici ripetuti con Leiscan, (programma Leispro ). Analisi di rischio Un cane che vive en una zona endemica è esposto al rischio di contrarre l infezione. In questi casi, il fattore principale che deve preoccupare è il tasso d infezione nella zona in cui risiede e la stagione dell anno in cui si possono trovare i flebotomi infettanti. Quanto maggiore è l incidenza e lunga la stagione, maggiore è il rischio di contatto tra il cane e il vettore, per cui aumenta di conseguenza anche il rischio di contagio. Da alcuni studi epidemiologici si sono ricavati gli indici di prevalenza d infezione in varie zone endemiche: essi sono di grande aiuto per prendere delle decisioni in quanto a gestione del rischio. (Vedasi l allegato 1 ove sono raccolti i dati disponibili fino ad oggi). In maniera approssimativa, Franco et al., (2011) propongono tre gradi di sieroprevalenza: Bassa (<5%), Media (5-20%) o Alta (>20%), gradi di cui si è già fatto uso per prendere delle decisioni in merito. Tuttavia, dobbiamo tener conto del fatto che ci possono essere notevoli differenze quanto a incidenza della malattia in popolazioni canine molto simili che vivono a pochi km di distanza. Ciò è dovuto a una gran varietà di fattori ambientali che possono determinare l abbondanza di flebotomi in un area determinata (Cardoso et al., 2004a), ragion per cui è praticamente impossibile conoscere le caratteristiche epidemiologiche della zona dove vive il paziente. La densità dei flebotomi gioca un ruolo fondamentale nella comparsa e nella disseminazione della malattia (Martín Sánchez et al., 2009). I flebotomi si riproducono in zone rurali, dove si accumula materiale organico e in aree con un umidità relativamente alta (tane di animali, tronchi e ceppi di alberi e arbusti) e in ambienti umanizzati che riuniscono determinate condizioni (come legnaie, stalle, giardini, tombini e fosse settiche, discariche di spazzatura, ecc...). È però in ambienti umanizzati con abbondanti aree verdi (per esempio, zone residenziali della periferia delle città) dove si trova una maggior densità di flebotomi e in cui il rischio di infezione aumenta fino a un 70% (Nieto 2004). 48

50 V. Come usare Leisguard nella pratica? C è poi da considerare il fatto che, anche se i flebotomi sono più numerosi all inizio dell estate (giugno/luglio), in questa epoca hanno un basso potere infettante, poiché hanno avuto poco tempo per prelevare il parassita da cani già infetti per trasmetterlo ad altri. È quindi più probabile che i flebotomi con maggior capacità infettante siano proprio quelli che troviamo a fine stagione (fine settembre e tutto ottobre): per questo il rischio di contagio è maggiore nella stagione autunnale. Il clima influenza direttamente il periodo di attività del parassita e può variare in funzione dell anno (Lucientes 2004, Oliva et al., 2006). Nelle aree più meridionali, infatti, il flebotomo può essere già attivo a fine febbraio per poi scomparire all inizio di dicembre, mentre in zone settentrionali il suo periodo di attività inizia a maggio e finisce al principio di novembre (Lucientes 2004). Con l altitudine aumentano le precipitazioni e diminuisce la temperatura, quindi peggiorano considerevolmente le condizioni di sopravvivenza dei flebotomi (Gálvez et al., 2011). Ciononostante, la presenza dei flebotomi non è l unico fattore di rischio che agisce sulle percentuali di l incidenza della malattia in una determinata zona: dobbiamo considerare altri fattori come la razza e lo stile di vita del cane. Si è visto infatti che le razze pure e in particolare il Boxer, il Rottweiler, il Cocker Spaniel e il Pastore Tedesco sono particolarmente sensibili, mentre i meticci delle zone endemiche e razze particolari come il Podenco Ibicenco sono più resistenti (Nieto 2004, Solano- Gallego et al., 2011). Lo stile di vita dell animale è di grande importanza perché la situazione cambia notevolmente a seconda di dove vive il cane-se fuori o dentro casa- e soprattutto dove trascorre le ore notturne (Sousa et al 2011). Le ore dal tramonto a mezzanotte sono infatti quelle in cui l attività del flebotomo è più intensa (Lucientes 2004). Per questo, il fatto che il cane dorma all aria aperta implica che il rischio di contagio (Odds Ratio) sia 3.3 volte maggiore di quando dorme dentro. È per questa ragione che i cani da guardia presentano un rischio d infezione 3-4 volte superiore rispetto ad altri cani. Vivere in un ambiente urbano sembrerebbe rappresentare un fattore di rischio rispetto a vivere in zone rurali, probabilmente per l esistenza di numerosi giardini e una maggior densità di cani (Cortés et al., 2007, Martín Sánchez et al., 2009, Sousa et al., 2011). Peraltro va anche considerata la rilevanza dello stato nutrizionale del cane giacché eventuali carenze rappresentano un fattore determinante per l instaurarsi della malattia, atteso che quest ultima si trova in relazione diretta con le condizioni del sistema immunitario dell ospite (Nieto 2004). Sono stati descritti casi in cui animali con Leishmaniosi clinica che soffrivano di una certa denutrizione (per la competitività fra cani viventi in collettività), guariscono semplicemente grazie ad una buona alimentazione. Questo è anche uno dei motivi per cui la Leishmaniosi umana riguarda principalmente paesi poveri con elevati tassi di malnutrizione (WHO 2010). 49

51 In tutte le situazioni di rischio descritte, Leisguard funziona in maniera efficace come strumento di prevenzione. In ogni caso preme sottolineare che le raccomandazioni d uso devono essere determinate tenendo in considerazione i fattori menzionati e comunque che gli interventi vanno adottati in conformità con l albero delle decisioni descritto nello schema della (Figura 35). Figura 35. Raccomandazioni sull uso preventivo di Leisguard secondo il rischio d infezione (animali sieronegativi). Sierologia negativa Analisi di rischio Vive in zona no endemica (Prevalenza < 5%) Vive in zone endemiche (Prevalenza 5-20%) Vive in zone endemiche (Prevalenza >20%) Non viaggia mai Viaggia puntualmente a zone endemiche Viaggia abitualmente a zone endemiche Dorme dentro casa Dorme all aria aperta Alto rischio Basso rischio annuale Gennaio-marzo Durante permanenza dopo 3-6 mesi Meticcio o razza non predisposta Rischio intermedio Boxer, Pastore tedesco, Rottweiler, Cocker Giugno-ottobre- febbraio + repellente annuale Gennaio-marzo Giugno e ottobre + repellente annuale Gennaio-marzo 50

52 Negativa Nel caso in cui la sierologia sia negativa, dovrà tener conto in primo luogo del grado di prevalenza di ciascuna zona (Bassa <5%, Media 5-20% o Alta >20%). In funzione di questa classificazione, si propongono linee d azione diverse che servono a orientare il veterinario clinico (programma preventivo Leispro ). In questo senso è conveniente utilizzare l informazione sul grado di prevalenza più recente a disposizione sull area in cui vive il cane, oppure cercare di stabilire la percentuale che si riferisce all incidenza della malattia basandosi sui risultati dei test di screening sierologici nella stessa zona o clinica veterinaria. Anche se il risultato può variare in funzione dei criteri di valutazione utilizzati, in diversi studi epidemiologici si osserva che circa il 50% degli animali sieropositivi mostrano qualche sintomo o alterazione clinico-patologica legata alla malattia (Gálvez et al., 2010; Marty et al., 2007; Solano-Gallego et al., 2001; Brandonisio et al., 1992). Perciò, basandosi sulla percentuale di cani con Leishmaniosi clinica è possibile estrapolare, in maniera orientativa, quale potrebbe essere la prevalenza della malattia in un collettivo determinato. Zona non endemica (Prevalenza bassa <5%) In zone in cui sussistono condizioni climatologiche avverse per la sopravvivenza del flebotomo o in cui la densità di cani è molto bassa, si riscontrano percentuali assai basse di animali sieropositivi. Di conseguenza il rischio di contrarre la malattia attraverso il contatto con il vettore nei cani che risiedono in queste aree è notevolmente ridotto. Tuttavia, in tali zone possono apparire casi di Leishmaniosi in cui il cane si è contagiato dopo essere stato per un periodo più o meno lungo di tempo in una zona endemica. Oltretutto, negli ultimi tempi sono state descritte vie di contagio diverse come la materno-fetale (Nieto 2004) o attraverso trasfusioni sanguigne (Solano-Gallego et al., 2011) o ancora attraverso le punture di zecca (Podaliri et al., 2011): casi che potrebbero comunque verificarsi in tali zone anche se va riconosciuto che la probabilità che l infezione si produca attraverso queste vie è alquanto inferiore a quella che si verifica mediante il flebotomo. Per questo motivo, se il cane vive in quest area e non viaggia o non si trattiene mai in zone a rischio è assai improbabile che entri in contatto con il parassita. Tuttavia in questi casi è comunque raccomandabile procedere a un test sierologico una volta l anno. Così si può reagire rapidamente in caso di contagio senza dover somministrare al cane nessun prodotto. In generale, si consiglia un analisi sierologica durante il periodo invernale, preferibilmente tra gennaio e marzo, quando sarà già trascorso il tempo sufficiente tra la stagione in cui il flebotomo ha potuto trasmettere la malattia e il momento in cui l animale abbia sviluppato la sieropositività nel caso sia stato infettato. 51

53 V. Come usare Leisguard nella pratica??? Maggio Giugno Iuglio Agosto Settembre Ottobre Novembre Dicembre Gennaio Febbraio Marzo Aprile Se il cane viaggia Nel caso in cui il cane che risiede abitualmente in una zona non endemica effettui visite frequenti a località dove Leishmania è endemica, per esempio nei fine settimana, sarà necessario applicare un programma preventivo normalmente previsto per le zone endemiche e non per quella abituale. Se invece lo spostamento a una zona endemica è occasionale o saltuario, per esempio in occasione delle vacanze estive, si dovrà applicare un programma preventivo adeguato alla situazione. In quest ultimo caso si raccomanda un trattamento con Leisguard per tutto il periodo di permanenza nella zona a rischio. Secondo i dati disponibili sull attivazione cellulare, l effetto immunomodulatore del domperidone è già evidente dopo 5 giorni dall inizio della terapia (Gómez Ochoa et al., 2004), ma può addirittura presentarsi prima. Pertanto, in pratica, il trattamento preventivo con Leisguard può essere contemporaneo all arrivo alla zona a rischio. Ciononostante, anche qualora la permanenza nella zona endemica fosse più breve, sarebbe necessario rispettare la posologia raccomandata e mantenere comunque la somministrazione fino alla fine del trattamento per 30 giorni consecutivi. Se la permanenza si prolunga oltre il mese, si può stabilire un secondo periodo di trattamento lasciando un intervallo di riposo di 3 mesi al massimo tra l uno e l altro. Oltre a questo, si consiglia di sottoporre l animale a un test sierologico da 3 a 6 mesi dopo l inizio del periodo di vacanze per identificare qualunque indizio d infezione. Zona endemica (Prevalenza media 5-20%) Nel caso di quei cani che vivono in zone endemiche con una prevalenza tra il 5 ed il 20% sarà necessario prendere le adeguate precauzioni per evitare il contagio. Questi cani si trovano in una situazione evidente di rischio di contagio, anche nel caso in cui trascorrano poco tempo all esterno. In queste aree, il periodo di attività del flebotomo di solito si estende da maggio a ottobre, sebbene possano verificarsi delle variazioni da un anno all altro per questioni legate al clima. In questi casi si consiglia un programma di prevenzione con Leisguard consistente nel somministrare due trattamenti annuali, uno all inizio della stagione epidemiologica e un altro alla fine, di solito quindi a giugno e a ottobre. Questo programma ha dimostrato, nelle negli studi clinici descritti in precedenza, di essere efficace per ridurre drasticamente il rischio di contrarre la malattia. In più è raccomandabile aggiungere l uso di sostanze repellenti contro gli insetti, (siano essi in forma di collari o spray/spot-on) che, agendo in maniera indipendente, hanno un ruolo complementare che abbassa ulteriormente il rischio di contrarre la malattia. 52

54 Dal momento che non esiste un sistema di prevenzione efficace al 100% non si può trascurare l importanza di una diagnosi precoce, che offre la possibilità di intervenire con maggior garanzia di successo in caso di necessità. Come si è già detto, il momento più adatto per eseguire uno screening sierologico in queste zone sarebbe il periodo invernale, preferibilmente tra gennaio e marzo. In questo senso bisogna ricordare che Leisguard non ha effetti sulla puntura dell insetto, ma agisce evitando lo sviluppo clinico della malattia. Per questo, il fatto di trovare eventualmente valori di sieropositività bassa in un cane che segue il programma di prevenzione con il prodotto indica soltanto che l animale è entrato in contatto con il parassita, ma non che stia sviluppando la malattia. Maggio Giugno Iuglio Agosto Settembre Ottobre Novembre Dicembre Gennaio Febbraio Marzo Aprile Zona endemica (Prevalenza alta >20%) In zone dove sono state descritte prevalenze molto alte (>20%), è dato riscontrare, da un lato, un habitat ed una climatologia favorevoli alla moltiplicazione dei flebotomi e dall altro anche un alta densità della presenza di cani. Queste circostanze fanno si che si possano trovare dei flebotomi infettanti fino all autunno avanzato e dall inizio della primavera, senza che vi sia quindi una stagione epidemiologica ben definita. Perciò, in queste aree è necessario stabilire un programma di prevenzione più intensivo con la somministrazione di Leisguard con frequenza quadrimestrale. Nella maggior parte dei casi potrebbero prevedersi dei trattamenti a giugno, ottobre e febbraio. L efficacia di questo protocollo è stata dimostrata dalle analisi cliniche illustrate nei paragrafi anteriori, da cui risulta che il rischio d infezione si ridusse ben 7 volte. La stessa indicazione di trattamento sarebbe consigliabile per quei cani che, pur vivendo in zone con minor incidenza della malattia, siano sottoposti a fattori di rischio addizionali, quale principalmente il sistema di vita all aria aperta nelle ore notturne (p.e. cani da guardia) oppure che appartengano a una delle razze descritte come particolarmente sensibili. In queste zone ad alto rischio abbiamo una grande esposizione al flebotomo durante quasi tutte le epoche dell anno, per cui è conveniente non trascurare altri mezzi preventivi, come l uso di insetticidi repellenti e cercare di evitare che il cane frequenti o dorma in zone con una elevata presenza di flebotomi in ore notturne. 53

55 V. Come usare Leisguard nella pratica? Sotto tale profilo vanno segnalati vari studi che attribuiscono all uso di collari o spot-on a base di permetrine una notevole efficacia preventiva grazie al loro effetto repellente sui flebotomi (Ferroglio et al., 2008; Miró et al., 2007; Foglia Manzillo et al., 2006). Considerata l efficacia di questi prodotti indipendentemente dall effetto immunomodulatore di Leisguard, risulta evidente la grande importanza del loro uso combinato. A questo proposito, sappiamo dai risultati degli studi di Foglia Manzillo et al., (2006) e Llinás et al., (2010a), entrambi condotti in zone ad alta prevalenza, che l efficacia attribuibile all uso di collari insieme a Leisguard quadrimestralmente arriverebbe a essere del 98%. Per questo è molto raccomandabile combinare qualsiasi prodotto repellente registrato con Leisguard per raggiungere un grado di protezione praticamente completo. Va infine osservato che nonostante l utilizzo implementato di tutti questi strumenti resta comunque raccomandabile la realizzazione di un test sierologico una volta l anno ai fini di reagire rapidamente di fronte a qualunque indizio d infezione. Maggio Giugno Iuglio Agosto Settembre Ottobre Novembre Dicembre Gennaio Febbraio Marzo Aprile? 54

56 Programma PREVENZIONE Il vero controllo (4) MAGGIO GIUGNO LUGLIO AGOSTO SETTEMBRE Rz < 0,9 IFI <1/80 Negativo Rz= IFI= 1/80 Dubbio (2) 5-20% prevalenza: LEISGUARD giugno e ottobre > 20% prevalenza e cani ad alto rischio (1) : LEISGUARD < 5% prevalenza: LEISCAN una volta l anno (3) TRATTAMENTO Rz= IFI=1/80-1/160 SIEROLOGIA+ BASSA Segni clinici lievi Rz > 1.5 (IFI > 1/160) SIEROLOGIA+ ALTA Segni clinici evidenti MESE 1 MESE 2 MESE 3 MESE 4 MESE 5 Leishmanicida e/o leishmaniostatico 30 giorni prima di iniziare LEISPRO TRATTAMENTO (1) Alto rischio: cane che dorme all aria aperta o di una razza sensibile (Boxer, Rottweiler, Pastore tedesco, Cocker). (2) Dubbio: Ripetere LEISCAN dopo 6 mesi. (3) (3) Cani che viaggiano a zone endemiche: Viaggio puntuale: LEISGUARD durante la permanenza / Viaggio abituale: LEISGUARD secondo prevalenza e rischio della zona. (4) Utilizzare un repellente contro i flebotomi registrato per l uso comprese le stagioni dell anno di attività del flebotomo (periodo minimo da maggio a ottobre).

57 della Leishmaniosi OTTOBRE NOVEMBRE DICEMBRE GENNAIO FEBBRAIO MARZO APRILE e trattamento addizionale a febbraio Nuova valutazione clinica MESE 6 (4) LEISCAN + SEGNI CLINICI + ANALISI A PREVENZIONE Mantenere TRATTAMENTO Nuova valutazione clinica completa 54 56

58 VI. Domande frequenti - Se una cagna sottoposta a un trattamento preventivo con Leisguard dovesse restare incinta, si deve continuare a somministrare il prodotto o è preferibile interromperlo? Così come si specifica nel prospetto, gli studi fatti su animali di laboratorio non mostrarono nessuna controindicazione alla somministrazione del prodotto durante la gestazione. Tuttavia l insufficienza degli studi su cagne incinte induce a ritenere necessario che il veterinario effettui una valutazione caso per caso dei rischi/benefici. Ai fini di tale valutazione si dovrà anche tener conto del livello di rischio, in relazione soprattutto ai seguenti fattori: la prevalenza della zona, il periodo dell anno, la razza dell animale, nonché la circostanza che l animale dorma o meno all aria aperta. - Se una cagna che segue un trattamento preventivo con Leisguard dovesse prendere il farmaco durante l allattamento, si può continuare a somministrarle il prodotto o è preferibile interrompere il trattamento? Purtroppo non sono stati condotti degli studi specifici su cagne in allattamento. Tuttavia in altre specie, inclusa quella umana, si è rilevato un aumento della produzione lattea quando si segue il trattamento in tali periodi. Pertanto può presumersi che il trattamento con Leisguard induca lo stesso effetto in di una cagna che allatta. D altra parte nel periodo di allattamento si produce un aumento fisiologico della prolattinemia che potrebbe conferire già di per sé un grado di protezione adeguato contro la Leishmaniosi. Per questa ragione, onde avere la certezza che la produzione di latte della cagna si mantenga a livelli normali, si può saltare il ciclo di trattamento o, in funzione del livello di rischio e dell epoca dell anno, aspettare che finisca l allattamento per riprendere la somministrazione di Leisguard. - Si può dare Leisguard insieme ad altri farmaci in un animale malato? Non è conveniente somministrare il prodotto associandolo ad antiacidi come l omeprazolo o la cimetidina. Non si deve utilizzare Leisguard insieme a dopaminergici come la dopamina o la dobutamina: va peraltro tenuto presente che il prodotto è un antagonista della cabergolina. Nelle prove cliniche realizzate fino ad ora non sono state descritte interazioni con altri farmaci. Dal punto di vista dell efficacia il meccanismo d azione di Leisguard è completamente indipendente dai prodotti leishmanicidi o leishmaniostatici utilizzati abitualmente nei cani. Di fatto, è stato descritto il trattamento congiunto del prodotto con Allopurinolo in cui è stata osservata una buona risposta senza riscontrare effetti avversi di nessun tipo. 57

59 - Per quanto riguarda il protocollo di prevenzione della Leishmaniosi cos è più raccomandabile: l uso di Leisguard o di vaccini contro la Leishmania? La base di questi trattamenti è simile, dato che entrambi sono finalizzati a potenziare la risposta immunitaria cellulare efficace contro la Leishmaniosi e prevenire così lo sviluppo della malattia clinica nel cane. La differenza principale fra i due prodotti è che i vaccini possiedono un antigene che provocherà un certo grado di produzione di anticorpi specifici anche se l animale non è infetto, mentre invece Leisguard potenzia la risposta immunitaria senza generare di per sé una risposta sierologica. La produzione di anticorpi a seguito della vaccinazione conduce alla possibilità di interferenze nella diagnosi sierologica dei cani (EMEA 2011). Per questo motivo la vaccinazione può far diminuire l efficacia delle campagne di diagnosi precoce. Leisguard non interferisce con la sierologia e quindi permette di individuare i cani sieropositivi in maniera più facile, sicura e precoce che non se questi fossero vaccinati. Inoltre l uso di vaccini in animali sieropositivi non è indicato: in questi casi risulta assai più raccomandabile l uso di Leisguard. Quanto poi all efficacia clinica, in zone ad alta prevalenza Leisguard ha dimostrato un efficacia preventiva* dell 80%. D altro lato, la probabilità o rischio di sviluppare la Leishmaniosi clinica (calcolata in termini di opportunità o Odds**) è di 7.2 volte inferiore negli animali trattati con Leisguard che in quelli non trattati. Per finire, l attivazione cellulare che protegge dall infezione si produce entro i primi 5 giorni dall inizio del trattamento con Leisguard. * Efficacia reale attribuibile al programma di trattamento dopo aver scartato i casi che senza essere trattati/ vaccinati non avrebbero comunque sviluppato la malattia. ** Probabilità del cane di contrarre la malattia o di non contrarla a seconda che sia trattato/vaccinato o meno. 58

60 VI. Domande frequenti - Si può combinare il trattamento con Leisguard con il vaccino contro la Leishmania? Sia Leisguard che i vaccini contro la Leishmania mirano a potenziare la risposta immune cellulare. I loro meccanismi di azione sono compatibili ed è probabile che, anche se non sono stati eseguiti studi che lo dimostrino in modo assolutamente inoppugnabile, il loro uso combinato aumenti l efficacia di entrambi. D altronde l attivazione cellulare che si ottiene con Leisguard si produce prima dei 5 giorni dopo l inizio del trattamento, essendo la risposta più precoce possibile. Per questa ragione, l uso di Leisguard durante il primo programma vaccinale potrebbe offrire una protezione molto più precoce particolarmente necessaria se si vaccina nella stagione in cui vi è più abbondanza di flebotomi. - L efficacia è differente a seconda dell ora del giorno in cui si somministra Leisguard? Nei cani, a differenza degli essere umani, non è stato descritto un ritmo circadiano regolare delle concentrazioni plasmatiche di prolattina, cosi che non vi è un momento particolare della giornata in cui sia preferibile somministrare il prodotto. D altro canto, i picchi di prolattina raggiunti con il trattamento con Leisguard sono molto superiori ai normali (in assenza di allattamento), per cui il suo effetto è indipendente da piccole variazioni nella prolattinemia basale. - A partire da che età si può somministrare Leisguard? Leisguard è un farmaco molto sicuro sia per i cani adulti come per i cuccioli e non è necessario attendere un età minima per iniziare il trattamento. Dal punto di vista dell efficacia si può ottenere una protezione adeguata dalle prime settimane di vita grazie all effetto di Leisguard sull immunità innata. Di fatto è risultato che la prolattina gioca un ruolo fondamentale nello sviluppo e maturazione del sistema immunitario dei mammiferi (Swarko-Sonta K. 1992). 59

61 - Ridurre la risposta Th2 presenta qualche inconveniente? In cani infetti Leisguard aumenta la risposta Th1, però non elimina la risposta Th2. Come anche succede nei cani resistenti alla malattia si produce un riequilibrio tra le due risposte in modo tale da mantenere un certo grado di risposta umorale insieme alla risposta cellulare efficace. In studi specifici, si è dimostrato che Leisguard non influisce sulla rapidità o sull intensità della sieroconversione dopo l uso di vaccini virali usati abitualmente nei cuccioli (Salichs et al., 2006a, Salichs et al., 2006b). - Si può provocare iperprolattinemia somministrando Leisguard? L uso di Leisguard nella posologia raccomandata provoca episodi acuti di iperprolattinemia completamente reversibili (picchi). Non si osservano al contrario accumulo o iperprolattinemia prolungata nel tempo. Questi picchi di prolattina sono i responsabili dell attivazione dell immunità cellulare che protegge dall infezione da Leishmania, possiedono un ampiezza molto inferiore a quelli di una cagna in allattamento e ridiscendono giornalmente ai livelli basali. Per questa ragione è molto raro che si presentino effetti indesiderabili negli animali trattati con questo prodotto. Ciononostante, se si utilizzano dosi più elevate o modalità di somministrazione diverse da quelle raccomandate, si possono produrre delle variazioni nell ampiezza dei picchi giornalieri di prolattina che potrebbero compromettere l efficacia del trattamento. Allo stesso modo dosi inferiori a quelle raccomandate possono essere insufficienti a produrre una liberazione completa della prolattina ipofisaria. Pertanto è indispensabile adeguare la dose al peso dell animale da trattare e rispettare scrupolosamente le modalità di somministrazione raccomandate. - Possiamo alterare i livelli di altri ormoni oltre alla prolattina? A causa del suo effetto antidopaminergico si è osservato che negli esseri umani il prodotto produce un certo aumento della TSH senza importanza clinica. D altra parte invece è stato dimostrato che non influisce sui livelli di 18-hidroxicorticosterona, cortisolo, renina, angiotensina, aldosterone e ormone della crescita. - È vero che il domperidone può provocare alterazioni cardiache? In alcuni studi realizzati sugli esseri umani si è osservato che quando si somministra il Leisguard per via intravenosa può aumentare il rischio di aritmie ventricolari e di un aumento della lunghezza dell intervallo QT. Tuttavia, in studi specifici condotti sui cani non è stato osservato alcun effetto a livello cardiaco a dosi molto superiori a quelle raccomandate neppure se somministrato per via endovenosa. 60

62 VI. Domande frequenti - Si può dare Leisguard a una cagna che ha mostrato episodi di pseudogestazione? Si, però il prodotto deve essere usato con attenzione, poiché in questi pazienti si possono raggiungere livelli di prolattina più elevati e di conseguenza si potrebbe produrre un certo grado di galattorrea. Se questo sintomo si presenta in forma lieve è consigliabile proseguire il trattamento fino alla fine, dal momento che è indicativo del fatto che si stanno ottenendo livelli protettori di prolattina. Se si presenta invece in forma marcata e non vi fosse una remissione del sintomo quando il trattamento viene interrotto, si può somministrare cabergolina per normalizzare il paziente. Tuttavia cabergolina e Leisguard non devono mai essere dati in associazione a causa dei loro effetti antagonisti. - Si può dare Leisguard per periodi inferiori ai 30 giorni senza che ciò comprometta la sua efficacia clinica? L effetto di Leisguard ssull attivazione transitoria delle cellule fagocitarie si osserva poco tempo dopo l inizio del trattamento. Tuttavia, il sistema immunitario si orienta progressivamente verso una risposta duratura di tipo prevalentemente cellulare (Th1): questa risulta significativa soltanto verso il termine dei 30 giorni consecutivi di trattamento. Per questa ragione le osservazioni effettuate nel corso dello studio clinico del prodotto sono state fatte con cicli di trattamento di almeno 30 giorni: non esistono studi che dimostrino l efficacia di trattamenti più corti. Di conseguenza la durata raccomandata del trattamento non deve essere ridotta per non compromettere l efficacia dello stesso. - Cosa succede se si sospende il trattamento per qualche giorno? L effetto stimolante di Leisguard sulla risposta immune si produce come conseguenza della ripetizione dei picchi transitori di prolattina che si verificano giornalmente dopo la somministrazione di ciascuna dose del prodotto. L interruzione puntuale del trattamento (due o tre dosi al massimo) non dovrebbe compromettere significativamente l efficacia dello stesso. Nel caso che ciò avvenga, comunque, è raccomandabile riprendere il trattamento il prima possibile e somministrare le dosi mancanti fino a completare l intero ciclo di 30 giorni di trattamento. Ad ogni modo, nel caso in cui la sospensione della somministrazione superi le tre dosi consecutive, non si può garantire la completa efficacia del trattamento, per cui si consiglia di iniziare nuovamente un ciclo completo di 30 giorni consecutivi di Leisguard. 61

63 - Leisguard può indurre la presentazione di malattie autoimmuni? Un incremento prolungato al di sopra dei valori fisiologici dei livelli ematici di prolattina (iperprolattinemia) è stato in effetti messo in relazione con la presentazione di malattie autoimmuni. Tuttavia, per raggiungere tali concentrazioni, è necessario che aumenti non soltanto la liberazione, ma anche e piuttosto significativamentela sintesi di prolattina. La somministrazione di Leisguard produce un picco irreversibile di prolattina all interno di un intervallo fisiologico (molto al di sotto dei livelli raggiunti durante l allattamento) che ritorna comunque giornalmente alle sue concentrazini basali e senza che si verifichi un accumulo di questo ormone. Ciò è dovuto al fatto che Leisguard non agisce stimolando direttamente la sintesi di prolattina, ma semplicemente induce la liberazione fisiologica della prolattina ipofisaria. Di conseguenza, non è suffragato da nessuna prova il fatto che l uso di Leisguard sia legato alla presentazione di malattie autoimmuni, non essendosene osservati casi né nella specie umana, né in quella canina, malgrado l ampio uso del domperidone nelle ultime decadi in entrambe le specie citate. 62

64 VII. Scheda Tecnica Leisguard 5 mg/ml sospensione orale per cani Ogni ml contiene: Principio attivo: domperidone 5 mg Eccipienti: Para-Hidroxibenzoato di metilo (E 218) Para-Hidroxibenzoato di propilo (E 216) Giallo di chinoleina (E 104) 1.80 mg 0.20 mg 0.20 mg FORMA FARMACEUTICA Sospensione orale Sospensione di colore giallo DATI CLINICI Specie di destino Cane Indicazioni d uso 1. Riduzione del rischio di sviluppare un infezione attiva e la malattia clinica derivanti dal contatto con Leishmania infantum, mediante il potenziamento dell immunità cellulare specifica. L efficacia del prodotto è stata dimostrata in cani sottoposti a ripetute esposizioni naturali al parassita in zone ad elevato rischio di infezione. 2. Controllo della progressione della leishmaniosi canina nelle fasi precoci della malattia (cani con livelli anticorpali positivi da bassi a moderati e sintomi clinici lievi come linfadenopatia periferica o dermatite papulare). Controindicazioni Non utilizzare quando la stimolazione della motilità gastrica potrebbe essere pericolosa, per esempio in caso di emorragia intestinale, ostruzione meccanica o perforazione digestiva. 63

65 Non usare in animali con ipersensibilità conosciuta a domperidone o alcuni eccipienti. Non usare in animali con tumori ipofisari che inducono la secrezione di prolattina (adenoma ipofisario) Dovuto alla sua metabolizzazione epatica, il domperidone non dovrebbe essere somministrato a pazienti con insufficienza epatica. Avvertenze speciali In caso di infezioni gravi, dovrebbe iniziarsi il trattamento eziologico opportuno per diminuire la carica parassitraria prima di iniziare un trattamento con questo farmaco veterinario. In ogni caso, e tenendo in conto la gran variabilità nell evoluzione della malattia, si raccomanda una stretta supervisione del paziente per adeguare il trattamento alla fase clinica in cui si trova l animale, secondo le necessità. Avvertenze speciali per il suo uso in animali La somministrazione di questo farmaco veterinario produce un aumento transitorio della prolattina plasmatica e potrebbe indurre alterazioni endocrine come la galattorrea. Per questo motivo deve essere usato con precauzione in animali con storia medica di pseudogestazione. Precauzioni specifiche che deve prendere la persona che somministra il farmaco agli animali Le persone con ipersensibilità nota al domperidone o a qualche eccipiente devono evitare ogni contatto con il farmaco. In caso di ingestione accidentale, consultare un medico e mostrare il foglio illustrativo o l etichetta. Se a seguito dell esposizione a questo farmaco la persona manifesta i sintomi di un eruzione cutanea, deve consultare con un medico e mostrargli questa avvertenza. Il gonfiore del viso, labbra e occhi, così come difficoltà di respirazione sono considerati sintomi di maggior gravità e richiedono attenzione medica urgente. Non fumare, mangiare o bere durante la manipolazione del prodotto. 64

66 VII. Scheda Tecnica Reazioni avverse Questo prodotto veterinario è ben tollerato nelle dosi e tempi di trattamento raccomandate. Negli studi clinici furono riportati rari/sporadici casi di galattorrea durante il trattamento con Leisguard. Quest effetto è considerato una conseguenza dei picchi di prolattina indotti dal domperidone e sparisce quando si interrompe il trattamento. Uso durante la gravidanza e l allattamento Gravidanza - Gli studi di sperimentazione effettuati sull apparato riproduttore degli animali non mostrarono indizi di effetti teratogenici e tossici per l embrione relazionati con l uso del farmaco. A dosi 20 volte superiori alla dose raccomandata non si osservarono segni di tossicità per la madre negli animali da laboratorio. Tuttavia non esistono sufficienti studi ben controllati in cagne in gestazione, di conseguenza questo farmaco si utilizzerà in gravidanza esclusivamente sotto controllo veterinario in base alla valutazione del rapporto rischi/benefici. Allattamento - La somministrazione di domperidone a femmine di varie specie durante il periodo di allattamento produce un aumento della produzione di latte. È possibile che la somministrazione di Leisguard a cagne che stanno allattando produca lo stesso effetto. Interazione con altri farmaci ed altre forme di interazione La cabergolina è un antagonista della dopamina che inibisce la liberazione di prolattina nell ipofisi. Per questa ragione, i suoi effetti sono antagonisti a quelli del domperidone. Non somministrare insieme a protettori gastrici come l omeprazolo o la cimetidina né ad altri antiacidi. Il domperidone non deve essere usato con dopaminergici come la dopamina o la dobutamina. 65

67 Posologia e via di somministrazione 0.5 mg/kg/dí, equivalenti a 1 ml di Leisguard /10 kg di peso corporeo, una volta al giorno per 4 settimane consecutive. Leisguard può essere somministrato direttamente in bocca o mescolato con l alimento. Per garantire il dosaggio corretto si deve determinare il peso corporale dell animale con la maggior precisione possibile. Agitare bene prima dell uso. Esistono vari protocolli di somministrazione: a Riduzione del rischio di contrarre un infezione attiva di leishmaniosi e della malattia clinica dopo il contatto con Leishmania infantum. In animali sieronegativi che non hanno mai presentato rischi di infezione da Leishmania spp. ma che vivono o si recano in una zona endemica, si programmerà il trattamento con domperidone tenendo conto della prevalenza temporale dei vettori della leishmaniosi (Phlebotomus spp.) nella località geografica attuale o di destinazione del paziente. Nelle aree ad alta prevalenza o in zone climatiche con una stagione epidemiologica prolungata deve essere somministrato un trattamento ogni 4 mesi. Nell area mediterranea sarebbe consigliabile somministrare il trattamento a giugno, ottobre e febbraio. Nelle zone a bassa prevalenza, può essere sufficiente un trattamento all inizio della stagione epidemiologica e un altro, poco dopo la fine della suddetta stagione. In ogni caso, sarà il veterinario a decidere la strategia di trattamento in funzione dell incidenza locale della malattia e dell eventuale presenza di vettori infettanti. b Controllo della progressione della leishmaniosi canina nelle prime fasi della malattia. Si inizierà il trattamento immediatamente dopo la diagnosi per aiutare l animale ad autolimitare la malattia. 66

68 VII. Scheda Tecnica Il trattamento con Leisguard può essere ripetuto tutte le volte che sia necessario in conformità ai controlli clinici e sierologici condotti dal veterinario. Sovradosaggio In studi clinici di tolleranza realizzati sul cane questo farmaco veterinario è stato somministrato a dosi cinque volte superiori alla dose raccomandata per intervalli di tempo superiori ad un anno senza che siano i comparsi effetti controindicati evidenti. PROPRIETÀ FARMACOLOGICHE Gruppo farmacoterapeutico: altri agenti protozoari Codice ATCvet: P51AX24 Proprietà farmacodinamiche Il domperidone è un antagonista della dopamina che stimola la liberazione di prolattina nell ipofisi. La sua somministrazione ripetuta giornalmente dà luogo a picchi giornalieri reversibili di prolattina nel sangue con effetti stimolanti dell immunità cellulare, che porta all attivazione della capacità fagocitica dei leucociti e di conseguenza, ad a una riduzione efficace del numero di microrganismi intracellulari (Leishmania spp.) in condizioni in vitro. Il domperidone ha anche proprietà antiemetiche e gastrocinetiche per il suo antagonismo con i recettori della dopamina. Dati farmacocinetici Assorbimento In cani a digiuno, il domperidone si assorbe rapidamente dopo la sua somministrazione per via orale, raggiungendo una concentrazione plasmatica massima (C max ) di 16.6 mg/ml dopo 2 ore. La bassa biodisponibilità del domperidone orale (24%) è dovuto a un importante effetto metabolico di primo passo nella parete intestinale nel fegato. La biodisponibilità del domperidone non è compromessa se somministrato con l alimento. In studi condotti su cani a dosi orali tra i 2.5 ed i 40 mg/kg, si osservò che il domperidone non si accumula né induce il suo metabolismo. La frazione di domperidone unita alle proteine plasmatiche oscilla tra il 91% e el 93%. 67

69 Distribuzione Gli studi di distribuzione in animali con il farmaco marcato radioattivamente indicano che si distribuisce ampliamente a tutti i tessuti, anche se non attraversa facilmente la barriera ematoencefalica. Nei ratti piccole quantità di farmaco possono attraversare la placenta. Metabolismo Il domperidone subisce un rapido e ampio metabolismo epatico mediante idrossilazione e N desalquilazione. L idrossilazione aromatica del domperidone produce l idrossidomperidone che rappresenta il principale metabolito che si trova nelle feci. I metaboliti risultanti dalla N-desalquilazione e i suoi coniugati possono trovarsi nell urina. Nessuno dei metaboliti indentificati è farmacologicamente attivo. Eliminazione La semivita di eliminazione (T1/2) è di 3.2 ore, il volume di distribuzione (Vd) di 3.3 l/kg e la clearance plasmatica (Cl) di 0.73 l/h/kg. La proporzione di farmaco che viene eliminato inalterato è piccola (15% dell escrezione fecale e approssimativamente, il 2% dell escrezione urinaria). Le quantità di domperidone eliminate in feci e urina corrispondono, rispettivamente, al 60% e al 28% della dose orale. Nel latte può trovarsi in quantità molto ridotte. 68

70 VII. Scheda Tecnica DATI FARMACEUTICI Lista degli eccipienti Sorbitolo liquido (non cristallizzabile) Cellulosa microcristallina e carboximetilcellulosa di sodio para-hidroxibenzoato di metile para-hidroxibenzoato di propile Saccarina sodica Polisorbato 20 Giallo di chinolina Aromatizzante alla frutta Idrossido sodico Acqua purificata Incompatibilità In assenza di studi di compatibilità, questo farmaco veterinario non deve essere somministrato insieme ad altri farmaci. Periodo di validità Periodo di validità del farmaco veterinario nella confezione originale integra: 30 mesi. Periodo di validità dopo l apertura del flacone: 8 mesi Raccomandazioni speciali di conservazione Conservare nella confezione originale. Proteggere dalla luce. Natura e composizione del contenitore primario Flacone di 60 ml di polietilene ad alta densità (HDPE) con chiusura che consiste in adattatore di polietilene a bassa densità (LDPE) e tappo a ghiera di HPDE a prova di bambino. Confezione di cartone con un flacone e due siringhe (cilindro di polietilene a bassa densità, stantuffo di polistirene e pistone di polietilene a bassa densità), una di esse con una graduazione fino a 3 ml e l altra fino a 5 ml. 69

71 Precauzioni speciali per l eliminazione del farmaco veterinario non utilizzato o dei residui derivati dallo stesso. Tutti i farmaci veterinari non utilizzati o i residui derivati dagli stessi dovranno essere eliminati in conformità con le normative locali. NUMERI DELL AUTORIZZAZIONE ALL IMMISSIONE IN COMMERCIO: Modalità di dispensazione: farmaco per uso veterinario. Soggetto a prescrizione veterinaria. 70

72 VIII. Allegato 1 Prevalenza della Leishmaniosi canina in diversi studi

73 Regione Provincia Comune Prevalenza Riferimenti bibliografici (%) Abruzzo, Molise Pescara, Teramo 20.10% Gradoni (unpublished), 1994 Abruzzo, Molise Pescara, Teramo 31.20% Gradoni (unpublished), 1995 Abruzzo, Molise Pescara, Teramo 29.10% Gradoni (unpublished), 1996 Abruzzo, Molise Pescara, Teramo 36.20% Gradoni (unpublished), 1997 Abruzzo, Molise Pescara 15.30% Dalla et al., 1999 Basilicata Matera Matera 60% Gradoni (unpublished), 1997 Basilicata Matera Pisticci 56% Gradoni (unpublished), 1997 Calabria Cosenza 21.1% Gradoni (unpublished), 1995 Calabria Cosenza 23.3% Gradoni (unpublished), 1996 Calabria Cosenza 19.1% Gradoni (unpublished), 1997 Campania Napoli San Sebastiano al Vesuvio 29.6% Maroli et al., 2001 Campania Napoli San Sebastiano al Vesuvio 27.3% Baldi et al., 2000 Campania Napoli San Sebastiano al Vesuvio 32.1% Baldi et al., 2000 Campania Napoli San Giorgio a Cremano 9.0% Maroli et al., 2001 Campania Napoli San Giorgio a Cremano 5.2% Baldi et al., 2000 Campania Napoli San Giorgio a Cremano 11.8% Baldi et al., 2000 Campania Napoli Santa Anastasia 40.4% Maroli et al., 2001 Campania Napoli Santa Anastasia 19.4% Baldi et al., 2000 Campania Napoli Santa Anastasia 50.0% Baldi et al., 2000 Campania Napoli Santa Anastasia 13.9% Gradoni et al., 2005 Campania Napoli Santa Anastasia 64.1% Gradoni et al., 2005 Campania Napoli Santa Anastasia 47.4% Oliva et al., 2006 Campania Napoli Pollena-Trocchia 36.0% Maroli et al., 2001 Campania Napoli Pollena 30.1% Baldi et al., 2000 Campania Napoli Pollena 48.1% Baldi et al., 2000 Campania Napoli Massa di Somma 39.2% Maroli et al., 2001 Campania Napoli Massa di Somma 29.0% Baldi et al., 2000 Campania Napoli Massa di Somma 45.4% Baldi et al., 2000 Campania Napoli San Giorgio a Cremano 14.5% Maroli et al., 2001 Campania Napoli 16.9% Baldi et al., 2004 Campania Napoli 23.2% Baldi et al., 2004 Campania Napoli 16.7% Baldi et al., 2004 Campania Napoli 16.0% Baldi et al., 2004 Campania Napoli, Salerno 17.3% Gradoni (unpublished), 1995 Campania Napoli, Salerno 27.1% Gradoni (unpublished), 1996 Campania Napoli, Salerno 30.0% Gradoni (unpublished), 1997 Campania Napoli, Salerno, Benevento; 21.8% Scalone et al., 2002 Caserta; Avellino Campania Salerno 20.8% Baldi et al., 2004 Campania Salerno 22.2% Baldi et al., 2004 Campania Salerno 18.7% Baldi et al., 2004 Campania Salerno 20.1% Baldi et al., 2004 Campania Avellino 16.8% Baldi et al., 2004 Campania Avellino 27.3% Baldi et al., 2004 Campania Avellino 20.8% Baldi et al., 2004 Campania Avellino 11.9% Gradoni (unpublished), 1996 Campania Avellino 24.3% Gradoni (unpublished), 1997 Campania Benevento 30.7% Baldi et al., 2004 Campania Benevento 26.1% Baldi et al., 2004 Campania Benevento 28.7% Baldi et al., 2004 Campania Benevento 28.3% Baldi et al., 2004 Campania Benevento 42.6% Gradoni (unpublished), 1995 Campania Benevento 14.1% Gradoni (unpublished), 1996 Campania Benevento 12.6% Gradoni (unpublished), 1997 Campania Caserta 14.3% Baldi et al., 2004 Campania Caserta 18.1% Baldi et al., 2004 Campania Caserta 13.9% Baldi et al., 2004 Campania Caserta 18.7% Baldi et al., 2004 Campania Caserta 10.1% Gradoni (unpublished), 1995 Campania Caserta 22.1% Gradoni (unpublished), 1996 Campania 21.0% Cringoli et al.,

74 Regione Provincia Comune Prevalenza Riferimenti bibliografici (%) Campania 13.2% Baldi et al., 2004 Campania Napoli 15.1% Baldi et al., 1997 Emilia-Romagna Modena Maranello 20.8% Capelli et al., 2004a Emilia-Romagna Modena Maranello 20.83% Baldelli et al., 2004 Emilia-Romagna Ravenna 3.6% Capelli et al., 2004a Emilia-Romagna Ravenna 4.46% Baldelli et al., 2004 Emilia-Romagna 2.8% Baldelli & Di Francisco, 1997 Emilia-Romagna Bologna Ozzano Dell'Emilia 11.25% Mollicone et al., 2003 Emilia-Romagna Bologna Ozzano Dell 'Emilia 2.70% Mollicone et al., 2002 Emilia-Romagna Bologna Castel San Pietro Terme 4.30% Mollicone et al., 2002 Emilia-Romagna Bologna Castel San Pietro Terme, 2.50% Capelli et al., 2004a Ozzano dell'emilia Emilia-Romagna Rimini Saludecio 2.6% Capelli et al., 2004a Emilia-Romagna Rimini Saludecio 6.2% Baldelli et al., 2001 Emilia-Romagna Rimini San Giovanni in Marignano 2.9% Baldelli et al., 2001 Emilia-Romagna Rimini San Giovanni in Marignano 16.7% Capelli et al., 2004a Emilia-Romagna Rimini Riccione 0.9% Capelli et al., 2004a Lazio Frosinone 23.9% Macri et al., 2005 Lazio Latina 35.0% Macri et al., 2005 Lazio Latina 17.0% Macri et al., 2005 Lazio Latina 29.7% Gradoni (unpublished), 1995 Lazio Latina Latina 31.3% Gradoni (unpublished), 1996 Lazio Latina 31.7% Gradoni (unpublished), 1997 Lazio Rieti 34.5% Macri et al., 2005 Lazio Rieti 20.9% Gradoni (unpublished), 1995 Lazio Rieti 37.4% Gradoni (unpublished), 1996 Lazio Rieti 35.8% Gradoni (unpublished), 1997 Lazio Roma 5.0% Federico et al., 1991 Lazio Roma Olevano Romano 38.4% Rossi et al., 2004 Lazio Roma Olevano Romano 33.3% Rossi et al., 2004 Lazio Roma 24.5% Macri et al., 2005 Lazio Roma 22.7% Gradoni (unpublished), 1991 Lazio Roma 21.7% Gradoni (unpublished), 1992 Lazio Roma 22.3% Gradoni (unpublished), 1993 Lazio Roma 17.7% Gradoni (unpublished), 1994 Lazio Roma 24.7% Gradoni (unpublished), 1995 Lazio Roma 27.2% Gradoni (unpublished), 1996 Lazio Roma 26.5% Gradoni (unpublished), 1997 Lazio Roma 27.0% Macri, 1999 Lazio Roma Roma 15.0% Macri, 1999 Lazio Roma Roma 18.5% Longo et al., 1999 Lazio Viterbo 30.5% Macri et al., 2005 Lazio Viterbo 17.6% Gradoni (unpublished), 1995 Lazio Viterbo 25.0% Gradoni (unpublished), 1996 Lazio Viterbo 30.5% Gradoni (unpublished), 1997 Liguria 26.2% Zaffaroni et al., 1999 Liguria Imperia, Savona 36.1% Rubaudo et al., 2000 Liguria Imperia, Savona 22.0% Rubaudo et al., 2000 Liguria Imperia, Savona 30.3% Zaffaroni et al., 1999 Liguria Imperia, Savona 22.1% Zaffaroni et al., 1999 Liguria Imperia, Savona, Genova 30.0% Gradoni (unpublished), 1994 Lombardia Brescia Brescia 6.4% Capelli et al., 2004a Marche Ancona 1.4% Gradoni (unpublished), 2001 Marche Ascoli Piceno 20.8% Maroli (unpublished), 2001 Marche Macerata 13.7% Bongiorno et al., 2003 Marche Macerata 29.6% Maroli (unpublished), 2001 Marche Macerata Camerino 29.7% Maroli (unpublished), 2001 Marche Pesaro 12.0% Gradoni (unpublished), 2001 Piemonte Alessandria Casale Monferrato 3.90% Ferroglio et al., 2002 Piemonte Alessandria Tortona 1.30% Capelli et al., 2004 Piemonte Asti 11% Biglino et al.,

75 Regione Provincia Comune Prevalenza (%) Riferimenti bibliografici Piemonte Asti % Ferroglio et al., 2000 Piemonte Asti Asti 10.70% Capelli et al., 2004 Piemonte Biella Biella 0.30% Ferroglio et al., 2002 Piemonte Cuneo Cuneo 0.90% Capelli et al., 2004a Piemonte Cuneo Cuneo 1.20% Capelli et al., 2004a Piemonte Torino Torino 4.5% Ferroglio et al., 2002 Piemonte Torino Ivrea 5.80% Ferroglio et al., 2002 Piemonte Torino Ivrea 3.40% Capelli et al., 2004a Puglia Bari Bari 20.0% Otranto et al., 2007 Puglia Foggia San Giovanni Rotondo 12.2% Brandonisio et al., 1990 Puglia Foggia San Marco in Lamis 22.5% Brandonisio et al., 1990 Puglia Foggia Rignano Garganico 6.7% Brandonisio et al., 1990 Puglia Foggia Gargano 14.4% Brandonisio et al., 1992 Puglia Foggia 17.3% Otranto et al., 2009 Puglia Lecce Parabita 12.0% Calisi and Zaccarelli, 2004 Puglia Lecce Galatina 18.0% Calisi and Zaccarelli, 2004 Puglia Lecce Maglie 7.0% Calisi and Zaccarelli, 2004 Puglia Taranto Ginosa 17.0% Otranto et al., 2007 Puglia Taranto Ginosa 37.1% Gradoni (unpublished), 1997 Puglia Taranto Manduria 11.1% Gradoni (unpublished), 1997 Puglia, Basilicata 32.7% Gradoni (unpublished), 1993 Puglia, Basilicata 37.0% Gradoni (unpublished), 1995 Puglia, Basilicata 38.4% Gradoni (unpublished), 1996 Puglia, Basilicata 38.3% Gradoni (unpublished), 1997 San Marino 1.30% Capelli et al., 2004a San Marino 1.35% Baldelli et al., 2004 San Marino 1.40% Baldelli et al., 2005 San Marino 7.10% Baldelli et al., 2005 San Marino 2.80% Rossi et al., 2005 Sardegna Cagliari Soleminis 2.6% Gramiccia et al., 1990 Sardegna Cagliari 56.2% Manunta et al., 2005 Sardegna Cagliari 39.4% Gradoni (unpublished), 1992 Sardegna Cagliari 39.3% Gradoni (unpublished), 1993 Sardegna Cagliari 38.0% Gradoni (unpublished), 1994 Sardegna Cagliari 33.5% Gradoni (unpublished), 1995 Sardegna Cagliari 37.0% Gradoni (unpublished), 1996 Sardegna Cagliari 27.5% Manunta et al., 1999 Sardegna Nuoro 35.5% Manunta et al., 2005 Sardegna Oristano 49.8% Manunta et al., 2005 Sardegna Sassari 13.6% Satta et al., 1997 Sardegna Sassari Castelsardo 16.3% Solinas et al., 1996 Sardegna Sassari Valledoria 14.5% Solinas et al., 1996 Sardegna Sassari Sedini 14.0% Solinas et al., 1996 Sardegna Sassari Badesi 11.2% Solinas et al., 1996 Sardegna Sassari 29.5% Manunta et al., 2005 Sardegna Sassari 39.9% Manunta et al., 1999 Sardegna Sassari, Nuoro 37.6% Gradoni (unpublished), 1996 Sardegna Sassari, Nuoro 34.7% Gradoni (unpublished), 1997 Sardegna Sassari, Nuoro 32.9% Manunta et al., 1999 Sardegna Sassari, Nuoro 29.5% Manunta et al., 1999 Sardegna Sassari, Nuoro 30.7% Scalone et al., 2002 Sardegna Sassari, Nuoro 29.5% Scalone et al., 2002 Sardegna 37.5% Manunta et al., 1999 Sardegna 36.5% Manunta et al., 2005 Sicilia Agrigento Lampedusa 39.1% Romagnoli et al., 2002 Sicilia Agrigento 55.5% Poglayen et al., 2005 Sicilia Agrigento 31.0% Poglayen et al., 2005 Sicilia Agrigento 46.8% Torina et al., 2005c Sicilia Agrigento 39.5% Torina et al., 2005c Sicilia Agrigento 56.9% Torina et al., 2005c Sicilia Agrigento 48.8% Torina et al., 2005c 74

76 Regione Provincia Comune Prevalenza (%) Riferimenti bibliografici Sicilia Agrigento 74.2% Torina et al., 2005c Sicilia Catania 44.9% Gambino et al., 1997 Sicilia Catania 60% Orndorff et al., 2000 Sicilia Messina 31.4% Di Muccio et al., 2004 Sicilia Messina Messina 56.1% Forino et al., 2002 Sicilia Messina 31.3% Brianti et al., 2005 Sicilia Palermo Palermo 27.7% Francaviglia et al., 2005 Sicilia Palermo 16.0% Torina et al., 2005b Sicilia Palermo 41.0% Torina et al., 2005b Sicilia Palermo 10.0% Torina et al., 2005b Sicilia Palermo 35.0% Torina et al., 2005b Sicilia Palermo 45.0% Torina et al., 2005b Sicilia Palermo, Trapani, Agrigento 15.10% Gradoni (unpublished), 1987 Sicilia Palermo, Trapani, Agrigento 24.40% Gradoni (unpublished), 1988 Sicilia Palermo, Trapani, Agrigento 33.20% Gradoni (unpublished), 1989 Sicilia Palermo, Trapani, Agrigento 35.80% Gradoni (unpublished), 1990 Sicilia Palermo, Trapani, Agrigento 42.30% Gradoni (unpublished), 1991 Sicilia Palermo, Trapani, Agrigento 43.90% Gradoni (unpublished), 1992 Sicilia Palermo, Trapani, Agrigento 34.60% Gradoni (unpublished), 1993 Sicilia Palermo, Trapani, Agrigento 32.20% Gradoni (unpublished), 1994 Sicilia Palermo, Trapani, Agrigento 31.30% Gradoni (unpublished), 1995 Sicilia Palermo, Trapani, Agrigento 31.40% Gradoni (unpublished), 1996 Sicilia Palermo, Trapani, Agrigento 34.0% Gradoni (unpublished), 1997 Sicilia Palermo, Trapani, Agrigento 39.9% Scalone et al., 2002 Sicilia Palermo, Trapani, Agrigento 40.4% Scalone et al., 2002 Sicilia Trapani Pantelleria 34.00% Gradoni (unpublished), 1997 Sicilia 32.9% Caracappa et al., 2000 Sicilia 26.05% Torina et al., 2005a Toscana Livorno Isola d'elba 22.2% Gradoni et al., 1988 Toscana Arezzo 3.30% Gradoni (unpublished), 1993 Toscana Arezzo 6.90% Gradoni (unpublished), 1994 Toscana Arezzo 12.90% Gradoni (unpublished), 1995 Toscana Arezzo 18.80% Gradoni (unpublished), 1996 Toscana Arezzo 21.70% Gradoni (unpublished), 1997 Toscana Firenze 13.3% Gradoni (unpublished), 1991 Toscana Firenze 19.6% Gradoni (unpublished), 1992 Toscana Firenze 17.3% Gradoni (unpublished), 1993 Toscana Firenze 12.5% Gradoni (unpublished), 1994 Toscana Firenze 16.2% Gradoni (unpublished), 1995 Toscana Firenze 17.1% Gradoni (unpublished), 1996 Toscana Firenze 12.8% Gradoni (unpublished), 1997 Toscana Grosseto 7.3% Gradoni (unpublished), 1991 Toscana Grosseto 3.5% Gradoni (unpublished), 1992 Toscana Grosseto 12.4% Gradoni (unpublished), 1993 Toscana Grosseto 9.7% Gradoni (unpublished), 1994 Toscana Grosseto 25.4% Gradoni (unpublished), 1995 Toscana Grosseto 30.3% Gradoni (unpublished), 1996 Toscana Grosseto 26.5% Gradoni (unpublished), 1997 Toscana Pisa 1.4% Mancianti et al., 1996 Toscana Pisa 15.8% Gradoni (unpublished), 1992 Toscana Pisa 14.5% Gradoni (unpublished), 1993 Toscana Pisa 13.7% Gradoni (unpublished), 1994 Toscana Pisa 14.2% Gradoni (unpublished), 1995 Toscana Pisa 10.0% Gradoni (unpublished), 1996 Toscana Pisa 8.6% Gradoni (unpublished), 1997 Toscana Pisa Palaia 19.5% Pedonese et al., 2000 Toscana Pisa Palaia 21.9% Pedonese et al., 2000 Toscana Pisa Pomarance 37.8% Pedonese et al., 2000 Toscana Pisa Volterra 37.8% Pedonese et al., 2000 Toscana Pisa Volterra 24.2% Pedonese et al., 2000 Toscana Pisa Volterra 25.3% Pedonese et al.,

77 Regione Provincia Comune Prevalenza (%) Riferimenti bibliografici Toscana Pisa Guardistallo 21.6% Pedonese et al., 2000 Toscana Pisa Guardistallo 15.7% Pedonese et al., 2000 Toscana Pisa Peccioli 45.2% Pedonese et al., 2000 Toscana Pisa Terricciola 49.0% Pedonese et al., 2000 Toscana Pisa San Miniato 5.4% Pedonese et al., 2000 Toscana Pistoia 13.0% Gradoni (unpublished), 1993 Toscana Pistoia 3.1% Gradoni (unpublished), 1994 Toscana Pistoia 16.6% Gradoni (unpublished), 1995 Toscana Pistoia 1.7% Gradoni (unpublished), 1996 Toscana Pistoia 2.8% Gradoni (unpublished), 1997 Toscana Siena 3.2% Gradoni (unpublished), 1992 Toscana Siena 27.2% Gradoni (unpublished), 1993 Toscana Siena 4.9% Gradoni (unpublished), 1994 Toscana Siena 13.3% Gradoni (unpublished), 1995 Toscana Siena 9.6% Gradoni (unpublished), 1996 Toscana Siena 2.8% Gradoni (unpublished), 1997 Toscana Livorno Isola d'elba 14.2% Gradoni et al., 1988 Trentino Trento Arco 3.6% Capelli et al., 2004a Trentino alto adige Trento 3.9% Capelli et al., 2004b Umbria Perugia 8% Maresca et al., 2009 Umbria Castiglione del lago 30.8% Maroli (unpublished), 2000 Umbria Castiglione del lago 18.2% Maroli (unpublished), 2001 Umbria Magione 20.0% Maroli (unpublished), 2000 Umbria Marsciano 19.0% Maroli (unpublished), 2000 Umbria Tuoro sul Trasimeno 5.9% Maroli (unpublished), 2000 Umbria, Marche 15.6% Gradoni (unpublished), 1995 Umbria, Marche 21.6% Gradoni (unpublished), 1996 Umbria, Marche 29.3% Gradoni (unpublished), 1997 Valle d Aosta 0.70% Ferroglio et al., 2002 Valle d Aosta Aosta Aosta 0.40% Ferroglio et al., 2002 Valle d Aosta Aosta Aosta 1.20% Capelli et al., 2004a Veneto Rovigo Rovigo 0.90% Capelli et al., 2005 Veneto Venezia Venezia 3.70% Capelli et al., 2004a Veneto Verona 21.90% Capelli et al., 2004a Veneto Verona 24.60% Capelli et al., 2004a Veneto Verona 3.50% Capelli et al., 2004a Veneto Verona 2.50% Capelli et al., 2004a Veneto Verona Verona 4.30% Natale et al., 2004 Veneto Verona Verona 1.20% Natale et al., 2004 Veneto Verona Verona 2.40% Natale et al., 2004 Veneto Verona 2.70% Capelli et al., 2004b Veneto Verona 1.60% Capelli et al., 2004b Veneto Verona, Padova, Venezia 16.20% Scalone et al., 2002 Veneto Verona, Padova, Venezia 17.40% Scalone et al., 2002 Veneto 2.9% Poglayen 1997, Maroli 1995 Veneto 2.50% Capelli et al.,

78 IX. Bibliografia BALDELLI A, DI FRANCESCO A. Surveillance of canine leishmaniasis in the Emilia-Romagna region (Italy). Acta Parasitologica Turcica, 1997; 21 (supplement 1): 143. BALDELLI R, BATTELLI G, MAROLI M, MOLLICONE E, GUDI A, STEGAGNO G, TASINI G. A new stable focus of canine leishmaniasis in northern Italy. Parassitologia, 2001; Dec; 43(4): BALDELLI R, PIVA S, DI FRANCESCO A, LOMBARDINI A, BATTISTINI M, BATTELLI G. Epidemiology of canine leishmaniosis in the Emilia-Romagna Region (northern italy): an update. Atti XXIII Congresso Societa Italiana di Parassitologia; Parassitologia, 2004; 46; Suppl.1; 24. BALDELLI R, PIVA S, DI FRANCESCO A, BATTISTINI M, POGLAYEN G. Autochthonous focus of canine leishmaniosis in the Republic of San Marino. Proceedings of 3rd World Congress on Leishmaniosis (Worldleish 3), Palermo-Terrasini, Italy, 10-15/04/2005; P BALDI L, ROMANO R, CASAPULLA R, MIZZONI V, BOVE R, PASQUA A, AUTIERO N, D AMORE N, SCALONE A, GRADONI L. Visceral leishmaniasis control in Campania (Italy): a pilot project.. IZSS/MZCC/WHO Workshop on New Trends in Leishmaniasis Epidemiology and Control in the Mediterranean area, Palermo (Italy), 1997, September 1997 (mimeographed document). BALDI L, ROMANO R, CASAPULLA R, MIZZONI V, BOVE R, PASQUA A, AUTIERO N, D AMORE N, SCALONE A, GRA- DONI L. Visceral Leishmaniasis control in Campania (Italy): a pilot project. Animal biology, 2000; 9; BALDI L, MIZZONI V, GUARINO A. Vecchi e nuovi focolai di leishmaniosi canina in campania. Parassitologia, 2004; 46; BANETH G, KOUTINAS A, SOLANO-GALLEGO L, BOURDEAU P, FERRER L. Canine Leishmaniosis new concepts and insights on an expanding zoonosis: part one. Trends in parasitology, 2008; Vol. 24 No.7: BARONE JA. Domperidone: a peripherally acting dopamine2-receptor antagonist. The Annals of pharmacotherapy, 1999; Vol. 33, pp BIGLINO A, BOLLA C, CONCIALDI E, TRISCIUOGLIO A, ROMANO A AND FERROGLIO E. Asymptomatic Leishmania infantum Infection in an Area of Northwestern Italy (Piedmont Region) Where Such Infections Are Traditionally Nonendemic. J Clin Microbiol, 2010; January; 48 (1): BONGIORNO G, HABLUETZEL A, KHOURY C, MAROLI M. Host preference of phlebotomine sand flies at a hypoendemic focus of canine leishmaniasis in central Italy. Acta tropica, 2003; 88; BONILLA-ESCOBAR DL. Respuesta inmune a la leishmaniasis: algo más que linfocitos T. Piel, 2005; 20(8): BOURDEAU P, DOVAL A, ROUSSEL A. Canine Leishmaniosis in France. Results of a National Survey with 1345 Clinics. European Veterinary Parasitology College (EVPC) Annual Conference Zagreb/Croatia, June 16 th th BRANDONISIO O, CARELLI G, CECI L, CONSENTI B, FASANELLA A, PUCCINI V. Indagine sulla diffusione della Leishmaniosi nel cane e nell uomo sul promontorio del gargajo. ATTI XVI Congresso Societa italiana di parassitologia; Parassitologia, 1990; 32; Suppl.1; BRANDONISIO O, CARELLI G, CECI L, CONSENTI B, FASANELLA A, PUCCINI V. Canine leishmaniasis in the gargano promontory (Apulia, South Italy). Eur. J. Epidemiol , March 1992; BRIANTI E, GAGLIO G, SORGI C, POGLAYEN G, GRAMICCIA M, GIANNETTO S. A cross-sectional study of canine leishmaniasis with serology and Nested Polymerase Chain Reaction in Salina Island (Southern Italy). Proceedings of 3rd World Congress on Leishmaniosis (Worldleish 3) 2005; Palermo-Terrasini, Italy, 10-15/04/2005; P BROGDEN RN, CARMINE AA, HEEL RC, SPEIGHT TM, AVERY GS. Domperidone. A review of its pharmacological activity, pharmacokinetics and therapeutic efficacy in the symptomatic treatment of chronic dyspepsia and as an antiemetic. Drugs, 1982; 24:

79 CALISI A AND ZACCARELLI N. Canine leishmaniasis in the Salento peninsula of Apulia, Italy: a preliminary report. 2004; Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biologiche Ambientali, Università degli Studi del Salento, Lecce, Italy. CAPELLI G, NATALE A, FRANGIPANE DI REGALBONO A, ET AL. (2003) Serological and entomological surveillance of a new autochthonous focus of canine leishmaniasis in north-eastern Italy. in: Proceedings of the 19th International Conference of the WAAVP, August 10 14, 2003; New Orleans, LA, p. 92. CAPELLI G, BALDELLI R, FERROGLIO E, GENCHI C, GARDONI L, GRAMICCIA M, MAROLI M, MORTARINO M, PIE- TROBELLI M, ROSSI L, RUGGIERO M. Monitoraggio della leishmaniosi canina in nord italia: Aggiornamenti da un network scientifico. Parassitologia, 2004a; 46; CAPELLI G, NATALE A, FRANGIPANE DI REGALBONO A, ZAMPICCOLI R, GATTI F, CESTARO F, GRAMICCIA M, MAROLI M, PIETROBELLI M. (2004b). Spreading of canine leishmaniasis in North-Eastern Italy. Proceedings of IX European Multicolloqium of parasitology (EMOP IX), Valencia, Spain, July 2004; P. 133, 116 (O). CARACAPPA S, VESCO G, GLORIOSO NS, SCHIAVO MR, DARA S, NIFOSI D, SCAVUZZO A, CLESI G, VITALE F. Leishmaniasis in dogs: seroepidemiological survey in Sicily. Animal biology, 2000; 9; CARDOSO L, RODRIGUES M, SANTOS H, SCHOONE GJ, CARRETA P, VAREJÃO E, VAN BENTHEM B, AFONSO MO, ALVES-PIRES C, SEMIÃO-SANTOS SJ, RODRIGUES J, SCHALLIG HD. Sero-epidemiological study of canine Leishmania spp. infection in the municipality of Alijó (Alto Douro, Portugal). Vet Parasitol., 2004a; May 7;121(1-2): CHAVEZ-RUEDA K, HERNANDEZ J, ZENTENO E, LEANOS-MIRANDA A, LEGORRETA-HAQUET MV, BLANCO-FAVE- LA F. Identification of prolactin as a novel immunomodulator on the expression of co-stimulatory molecules and cytokine secretions on T and B human lymphocytes. Clinical Immunology., 2005; 116: CORTES S, AFONSO MO, ALVES-PIRES C, CAMPINO L. Stray dogs and leishmaniasis in urban areas, Portugal. Emerg Infect Dis., 2007; Sep;13(9): CRINGOLI G, RINALDI L, CAPUANO F, BALDI L, VENEZIANO V, CAPELLI G. Serological survey of Neospora caninum and Leishmania infantum co-infection in dogs. Vet Parasitol. 2002; Jul 2; 106(4): DALLA VILLA P, RUGGERI F. Situazione epidemiologica della leishmaniosi canina nella provincia di Pescara. Atti del Congresso di Igiene Urbana Veterinaria, 1999; Rome; Italy; December 1999; P DI MUCCIO T, SCALONE A, LUDOVISI A, ORSINI S, BRIANTI E, GAGLIO G, FORINO D, IDONE P, LIBRANTI L, GRA- DONI L, POGLAYEN G, GRAMICCIA M, GIANNETTO S. Comparative performance of serological, parasitological and molecular techniques for the detection of canine leishmaniasis in the endemic focus of Salina Island, Italy. 2004; Atti XXIII Congresso Societa Italiana di Parassitologia; Parassitologia; 46; Suppl.1; 39. EMEA European Medicines Agency CaniLeish: EMEA/V/C/ European Public Assessment Reports (EPAR) - Summary for the public FEDERICO G, DAMIANO F, CALDAROLA G, FANTINI C, FIOCCHI V, ORTONA L. A seroepidemiological survey on Leishmania infantum infection. Eur J Epidemiol. 1991; Jul; 7(4): FERRER L, ROURA X. La serología y la leishmaniosis canina. PV ARGOS 04/2012. FERROGLIO E, POGGI M, TRISCIUOGLIO A.Evaluation of 65% permethrin spot-on and deltamethrin-impregnated collars for canine Leishmania infantum infection prevention. Zoonoses Public Health., 2008; Apr;55(3): FERROGLIO E, ROSSI L, MIGNONE W, MAROLI M. Sandfly vectors investigation of an unstable focus of canine leishmaniasis in Italy (Piedmont) and the risk of permanent infection transmission ATTI XXI Congresso Societa Italiana di Parassitologia; Parassitologia, 2000; 42; Suppl.1; 114. FERROGLIO E, MIGNONE W, SARACCO M, RAIMONDO C, CASTALDO S, TRISCIUOGLIO A, MANCIANTI F, GUISO P, TARELLO V, AMBROGIO M, TRENTIN C, BALLOCCHI E, FURNO R, SALA L. Prevalence of seroreactors to Leishmania infantum in the canine population of North-West Italy. Parassitologia, 2002; 44 (Suppl. 1),

80 IX. Bibliografia FOGLIA MANZILLO V, OLIVA G, PAGANO A, MANNA L, MAROLI M, GRADONI L. Deltamethrin-impregnated collars for the control of canine leishmaniasis: evaluation of the protective effect and influence on the clinical outcome of Leishmania infection in kennelled stray dogs. Vet Parasitol., 2006; Nov 30;142(1-2): FORINO D; VALENTI S. Sulla Presenza in cani di anticorpo Anti-leishmania: Indagine Eseguita Nella Fascia Tirrenica della provincia di MessinaATTI XXII Congresso Societa Italiana di Parassitologia; Parasitologia, 2002; 44; Suppl.1; 68 FRANCAVIGLIA F, GIAMBRUNO P, LOMBARDO S, PETROTTA E, VITALE M, VILLARI S, GENTILE S, GLORIOSO NSLeishmaniasis survey in dog pound of Palermo (Italy). Proceedings of 3rd World Congress on Leishmaniosis (Worldleish 3), Palermo-Terrasini, Italy, 10-15/04/2005; P FRANCO AO, DAVIES CR, MYLNE A, DEDET JP, GÁLLEGO M, BALLART C, GRAMICCIA M, GRADONI L, MOLINA R, GÁLVEZ R, MORILLAS-MÁRQUEZ F, BARÓN-LÓPEZ S, PIRES CA, AFONSO MO, READY PD, COX J. Predicting the distribution of canine leishmaniasis in western Europe based on environmental variables. Parasitology, 2011; Sep 14:1-14. FUJINO T, KATO H, YAMASHITA S, ARAMAKI S, MORIOKA H, KORESAWA M, MIYAUCHI F, TOYOSHIMA H, TO- RIGOE T. Effects of Domperidone on serum prolactin levels in human beings. Endocrinoogy. Japon., 1980; 27 (4): GÁLVEZ R, MIRÓ G, DESCALZO MA, NIETO J, DADO D, MARTÍN O, CUBERO E, MOLINA R. Emerging trends in the seroprevalence of canine leishmaniasis in the Madrid region (central Spain). Vet Parasitol., 2010; May 11;169(3-4): GÁLVEZ R, DESCALZO MA, GUERRERO I, MIRÓ G, MOLINA R. Mapping the current distribution and predicted spread of the leishmaniosis sand fly vector in the madrid region (Spain) based on environmental variables and expected climate change. Vector Borne Zoonotic Dis., 2011; Jul;11(7): GAMBINO G, BASILE A, MOCCIARO C, CHIFARI N, GRAZIA ZISA M, CORRIERE G, MIRA L, PICCIONE E, MAN- SUETO P, TANTILLO R, VITALE G, MANSUETO S. La leishmaniosi canina in provincia di Catania: situazione epidemiological del Giornale Italiano di Malattie Infettive, 1997; 3, GÓMEZ-OCHOA P, GASCÓN M, CASTILLO JA. Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. Tesis Doctoral. Universidad de Zaragoza, GÓMEZ-OCHOA P, SABATE D. Study of the effect of the administration of EV-4820 on the cell-mediated immune response in healthy dogs. ESTEVE veterinaria. Internal Report nr: EV-07/07-SN, GÓMEZ-OCHOA P, SABATE D. Efficacy study of an oral treatment with Domperidone at 0.5mg/kg/day during 30 consecutive days in dogs with mild clinical Leishmaniosis. ESTEVE veterinaria Internal Report nr: EV-07/08-SN, 2009a. GÓMEZ-OCHOA P, SABATE D. A study of the response of macrophage derived from circulating monocites of healthy dogs treated with EV-4820, to the in vitro infection with Leishmania infantum. ESTEVE veterinaria Internal Report: EV-07/09-SN, 2009b. GÓMEZ-OCHOA P, CASTILLO J.A., GASCÓN M, ZARATE JJ., ALVAREZ F, COUTO G. Use of Domperidone in the treatment of canine visceral Leishmaniosis: A clinical trial. The Veterinary Journal, 2009c; 179: GÓMEZ-OCHOA P, SABATE, D. Efficacy and safety study of a treatment program with EV 4870 for the control of Canine Leishmaniosis. ESTEVE veterinaria Internal Report EV-08/05-SN, 2009d. GÓMEZ-OCHOA P, LARA A, COUTO G, MARCEN JM, PERIS A, GASCÓN M, CASTILLO JA.The Nitroblue tetrazolium reduction test in canine Leishmaniosis. Vet Parasitol., 2010a; Aug 27;172(1-2): GÓMEZ-OCHOA P, LLINÁS J. Clinical Efficacy and Safety of EV-4870 in the treatment of Canine Leishmaniosis in seropositive dogs with mild clinical signs and/or clinicopathological disturbances. ESTEVE veterinaria Internal Report nr: EV-08/19- SN, 2010b. GÓMEZ-OCHOA P, SABATE D, HOMEDES H, FERRER L. Efficacy of domperidone for the treatment of mild and moderate cases of canine leishmaniosis: clinical and immunological short-term follow-up. Proceedings of the 21st ECVIM Congress, 2011; abstract no. Im

81 GÓMEZ-OCHOA P, SABATE, D, HOMEDES J, FERRER L. Use of the nitroblue tetrazolium reduction test for the evaluation of Domperidone effects on the neutrophilic function of healthy dogs. In Press. GRADONI L, GRAMICCIA M, MANCIANTI F, PIERI S. Studies on canine leishmaniasis control. 2. Effectiveness of control measures against canine leishmaniasis in the isle of Elba, Italy. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine & Hygiene, 1988; 82: GRADONI L, FOGLIA MANZILLO V, PAGANO A, PIANTEDOSI D, DE LUNA R, GRAMICCIA M, SCALONE A, DI MUCCIO T, OLIVA G. Failure of a multi-subunit recombinant leishmanial vaccine (MML) to protect dogs from leishmania infantum infection and to prevent disease progression in infected animals. Vaccine, 2005; 23; GRAMICCIA M, BETTINI S, GRADONI L, CIARMOLI P, VERRILLI ML, LODDO S, CICALÒ C. Leishmaniasis in Sardinia. 5. Leishmanin reaction in the human population of a focus of low endemicity of canine leishmaniasis. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1990; May-Jun; 84(3): HALL JA, WASHABAU RJ. Gastric prokinetic agents. In: Bonagura J.: Kirk s Current Veterinary Therapy XIII Small Animall Practice, 2000; pp JOHNSON AG. Domperidone in the treatment of gastroesophageal reflux disease. In: Advances in drug therapy of gastroesophageal Reflux Disease. Front Gastrointesinal Res. Basel, Karger, 1992;Vol. 20, pp KATO H, FUJINO T, ARAMAKI S, KORESAWA M, YAMASHITA S, TORIGOE T. The role of Domperidone in the regulation of prolactin release in rats. Life Sciences., 1980; Vol. 26 (16), pp KOHLI JD, GLOCK D, GOLDBERG LI. Selective DA2 vs DA1 antagonist activity of Domperidone in the periphery. European Journal of Pharmacology,1983: 89: LARRAGA V, CARRASCO M, RODON J. Study of the effect of Domperidone administered by oral route at two different dosages on the cell-mediated immune response in healthy Beagle dogs. CIB-CSIC Internal Report nr: CIN/EV-05/03-SN, LIMA G, VALLOCHI AL, SILVA UR, BEVILACQUA E, KIFFER M, ABRAHAMSOHN IA The role of polymorphonuclear leukocytes in the resistance to cutaneous leishmaniasis. Immunol Lett, 1998; 64: LLINÁS J, GÓMEZ-OCHOA P, SABATÉ D, HOMEDES J, FERRER L. Clinical efficacy of a domperidone-based treatment program for the prevention of canine leishmaniosis. Proceedings of the 46th AVEPA-SEVC Congress, 2011a. LLINÁS J., SABATE D, Efficacy and safety study of a treatment program with LEISGUARD for the control of Canine Leishmaniosis in a highly endemic geographical area - Extension. ESTEVE veterinaria Internal Report nr: EV- 10/04-SN, 2011b. LONGO L, BACCI F, BELLINI F, DE ANGELIS MA, PERINO R, SPAZIANI A. (1999). Leishmaniosi canina: due anni di osservazione presso il presidio canile sanitario di Roma. Atti del Congresso di Igiene Urbana Veterinaria; Rome; Italy; December, 1999; PP LUCIENTES J. Los flebotomos. Vectores de la Leishmaniosis. Actas Congreso Leishmaniosis centenario del Col.legi Oficial de Veterinaris de Tarragona. 6 Marzo MACRI G. (1999). La leishmaniosi canina: aspetti clinici ed epidemiologici con particolare riferimento alla diffusione della malattia a Roma e nel Lazio. Atti del Congresso di Igiene Urbana Veterinaria; Rome; Italy; December, 1999; PP MACRI G, ROMBOLA P, MICELI M, SCARPULLA M, PETTIROSSI N, LILLINI E. Seroprevalence of canine leishmaniosis in Latium Region. Proceedings of 3rd World Congress on Leishmaniosis (Worldleish 3), Palermo-Terrasini, Italy, 2005; 10-15/04/2005; p MANCIANTI F, PEDONESE F, MELOSI M, BERNARDINI M.). Preliminary record on canine leishmaniosis in the province of Pisa (Tuscany). Parassitologia, 1996; 38: 315. MANUNTA ML, SOLINAS G, SCALA A, SATTA G. Monitoraggio siero-epidemiologico sulla leishmaniosi canina in Sardegna. Atti del Congresso di Igiene Urbana Veterinaria; Rome; Italy; December 1999;

82 IX. Bibliografia MANUNTA ML, SANNA PASSINO E, TILOCCA V, BRIANTI E, SCALA A. Canine leishmaniosis in Sardinia (Italy). A review. Proceedings of 3rd World Congress on Leishmaniosis (Worldleish 3), Palermo-Terrasini, Italy, 10-15/04/2005; P MARESCA C, SCOCCIA E, BARIZZONE F, CATALANO A, MANCINI S, PAGLIACCI T, PORRINI M, PRINCIPATO M, VENDITTI G, GRELLONI V. A survey on canine leishmaniasis and phlebotomine sand flies in central Italy. Res Vet Sci, 2009; Aug; 87(1):36-8. Epub MAROLI M, SANSONI L, BIGLIOCCHI F, KHOURY C, VALSECCHI M Reperimento di Phlebotomus neglectus Tonnoir, 1921 (=P. major s.l.) in un focolaio di leishmaniosi nel nord Italia (Provincia di Verona). Parassitologia, 1995; 7, MAROLI M, MIZZONI V, SIRAGUSA C, D ORAZI A, GRADONI L Evidence for an impact on the incidence of canine leishmaniasis by the mass use of deltamethrin-impregnated dog collars in southern Italy. Medical and Veterinary Entomology, , MARTÍN-SÁNCHEZ J, MORALES-YUSTE M, ACEDO-SÁNCHEZ C, BARÓN S, DÍAZ V, MORILLAS-MÁRQUEZ F. Canine leishmaniasis in southeastern Spain. Emerg Infect Dis., 2009; May;15(5): MARTY P, IZRI A, OZON C, HAAS P, ROSENTHAL E, DEL GIUDICE P, GODENIR J, COULIBALY E, GARI-TOUSSAINT M, DELAUNAY P, FERRUA B, HAAS H, PRATLONG F, LE FICHOUX Y. A century of leishmaniasis in Alpes-Maritimes, France. Ann Trop Med Parasitol. 2007; Oct;101(7): MATERA L. Action of Pituitary and Lymphocyte Prolactin. Neuroimmunomodulation, 1997;4: MATERA L, MORI M. Cooperation of Pituitary Hormone Prolactin with InterIeukin-2 and Interleukin-12 on Production of Interferon-γ by Natural Killer and T Cells. Annals New York Academy Of Sciences, 2000; pp MATERA L, MORI M, GELETTO A. Effect of prolactin on the antigen presenting function of monocyte-derived dendritic cells. Lupus, 2001; 10, MIRÓ G, GÁLVEZ R, MATEO M, MONTOYA A, DESCALZO MA, MOLINA R. Evaluation of the efficacy of a topically administered combination of imidacloprid and permethrin against Phlebotomus perniciosus in dog. Vet Parasitol., 2007; Feb 28;143(3-4): MOLLICONE E, BATTELLI G, BALDELLI R. Autochthonous focus of canine leishmaniosis in the bologna province (Italy). ATTI XXII Congreso Societa Italiana di Parassitologia; Parassitologia, 2002; 44; Suppl.1; 113. MOLLICONE E, BATTELLI G, GRAMICCIA M, MAROLI M, BALDELLI R A stable focus of canine leishmaniosis in the Bologna Province (Italy). Parassitologia, 2003; 45, NIETO J. Leishmaniasis canina: Riesgo Epidemiológico. Actas Congreso Leishmaniosis centenario del Col.legi Oficial de Veterinaris de Tarragona. 6 Marzo ORNDORFF G R, COOPER B A, SMITH W, RYAN J R. Canine visceral leishmaniasis in Sicily. Military Medicine, 2000; 165, OLIVA G, SCALONE A, FOGLIA MANZILLO V, GRAMICCIA M, PAGANO A, DI MUCCIO T, GRADONI L. Incidence and time course of leishmania infantum infections detected by parasitological, serological and Nested-PCR Techniques in a cohort of naive dogs exposed to three consecutive transmission seasons. J Clin Microbiol. 2006; April; 44(4): OTRANTO D, PARADIES P, CAPRARIIS DE D, STANNECK D, TESTINI G, GRIMM F, DEPLAZES P AND CAPELLI G. Toward diagnosing leishmania infantum infection in asymptomatic dogs in an area where leishmaniasis is endemic. Clin. Vaccine Immunol, 2009; 16, OTRANTO D, PARADIES P, LIA RP, LATROFA MS, TESTINI G, CANTACESSI C, MENCKE N, GALLI G, CAPELLI G, STANNECK D. Efficacy of a combination of 10% imidacloprid/50% permethrin for the prevention of leishmaniasis in kennelled dogs in an endemic area, 2007; Mar 31; 144(3-4): Epub 2007 Jan

83 PALTRINIERI S, SOLANO-GALLEGO L, FONDATI A, et al. Guidelines for diagnosis and clinical classification of leishmaniasis in dogs. J Am Vet Med Assoc., 2010;236: PENNISI MG, DE MAJO M, MASUCCI M, BRITTI D, VITALE F, DEL MASO R. Efficacy of the treatment of dogs with leishmaniosis with a combination of metronidazole and spiramycin. The Veterinary Record, 2005; March 12, 156, PEDONESE F, MANCIANTI F, BERNARDINI S, MELOSI M. Further records on canine leishmaniosis in the Province of Pisa (Tuscany). Animal Biology, 2000; 9; PODALIRI VULPIANI M, IANNETTI L, PAGANICO D, IANNINO F, FERRI N. Methods of Control of the Leishmania infantum Dog Reservoir: State of the Art. Vet Med Int. 2011; Epub 2011 Jul 7. POGLAYEN G, MARANGON S, MANCA MG ET AL. A new outbreak of canine leishmaniosis in the north-east of Italy. Acta Parasitologica Turcica, 1997; 21 (Suppl. 1), 143. POGLAYEN G, BALDELLI R, PIRRERA A, DI FRANCESCO A, PIVA S, MICCICHE A, SORGI C. Monitoring of canine leishmaniosis in the Agrigento Province (Italy). Proceedings of 3rd World Congress on Leishmaniosis (Worldleish 3), Palermo- Terrasini, Italy, 2005; 10-15/04/2005; p192. POLCINSKI P, DZITKO K, DLUGONSKA H. Prolactin as a modulator of antiparasitic immunity. Wiad Parazytol., 2007; 53(4): PRAKASH A, WAGSTAFF AJ. Domperidone, a review of its use in diabetic gastropathy. Drugs, 1998; 56 (3); REBER PM. Prolactin and Immunomodulation. The American Journal of Medicine.,1993; Vol 95 pp REYNTJENS A. Domperidone: Upper digestive clinical pharmacology and antiemetic properties. Proceedings of a Satellite Symposium of the First European Symposium on Gastrointestinal Motility. Bologna, Sept 7-8,1982. REYNTJENS AJ, NIEMEGEERS CJ, VAN NUETEN JM, LADURON P, HEYKANTS J, SCHELLEKENS KH, MARS- BOOM R, JAGENEAU A, BROEKAERT A, JANSSEN PA. Domperidone, a novel and safe gastrokinetic anti-nauseant for the treatment of dyspepsia and vomiting. Arzneimittelforschung, 1978; 28(7): RODRÍGUEZ-CORTÉS A, OJEDA A, FRANCINO O, LÓPEZ-FUERTES L, TIMÓN M, ALBEROLA J. Leishmania infection: laboratory diagnosing in the absence of a gold standard. Am J Trop Med Hyg, 2010; Feb;82(2): RODRÍGUEZ-CORTÉS A,OJEDA A, TODOLÍ F, ALBEROLA J., Performance of Commercially Available Diagnostic Tests to Detect Leishmania infantum Infection Using a Real Gold Standard. Veterinary Parasitology 2010 (in press). ROMAGNOLI P, MACRI G, GRADONI L, MAROLI M. (Serological Survey on canine leishmaniasis and first record of Phlebotomine sand flies in the southest italian focus of leishmaniasis: Lampedusa island, Sicily. ATTI XXII Congresso Societa Italiana di Parassitologia; Parassitologia, 2002; 44; Suppl.1; 154. ROOYEN JM, OFFERMEIER J. Peripheral dopaminergic receptors. Physiological and pharmaceutical aspects of the therapeutic importance. Sa Medical Journal.1981;59(10): ROSSEAU D, DEMARTINO S, FERRUA B, MICHIELS JF, ANJUERE F, FRAGAKI K, et al. In vivo involment of polymorphonuclar neutrophils in Leishmania infantum infection. BMC Microbiology., 2001; 1: ROSSI E, BONGIORNO G, SCALONE A, DI MUCCIO T, CIOLLI E, GRAMICCIA M, GRADONI L, MAROLI M. Epidemiological studies in a new canine leishmaniasis focus in Rome province, central Italy. Atti XXIII Congresso Societa Italiana di Parassitologia; Parassitologia, 2004; 46; Suppl.1; 63. ROSSI L, BALDELLI R, CAPELLI G, FERROGLIO E, GENCHI C, GRADONI L, GRAMICCIA M, MAROLI M, MOR- TARINO M, PIETROBELLI M, RUGGIERO M.. Leishmap: the network for monitoring the spread of canine leishmaniasis and its vectors in Northern Italy. Proceedings of 3rd World Congress on Leishmaniosis (Worldleish 3), Palermo-Terrasini, Italy, 10-15/04/2005; 2005; p

84 IX. Bibliografia ROSSI E, BONGIORNO G, CIOLLI E, DI MUCCIO T, SCALONE A, GRAMICCIA M, GRADONI L, MAROLI M. Seasonal phenology, host-blood feeding preferences and natural Leishmania infection of Phlebotomus perniciosus (Diptera, Psychodidae) in a high-endemic focus of canine leishmaniasis in Rome province, Italy. Acta Tropica, 2008; 105 (2), February ROVENSKY J, BUC M, LOJDA Z, RUZICKOVA M, BLAZICKOVA S, RAUOVA L, MISTINA T, VIGAS M, LACKOVIC V. Effect of Domperidone-Induced hyperprolactinemia on selected immune parameters in healthy women. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 1995; 43: ROVENSKY J, FERENCIK M, VIGAS M. Effect of domperidone-induced hyperprolactinemia on the activity of some lysosomal enzymes in peripheral polymorphonuclear leukocytes of healthy women. Int.J. Immunotherapy, 1996; XII (1/2): ROVENSKY J, LACKOVIC V, VESELKOVA Z, HORVATHOVA M, KOSKA J, BLAZICKOVA S, VIGAS M. Plasma cytokine concentration and the cytokine producing ability of whole blood cell cultures from healthy females with pharmacologically induced hyperprolactinemia. Int. J. Tissue React., 1999; XXI (2): RUBAUDO L, ZAFFARONI E, LANFRANCHI P, MIGNONE W. (2000). Epidemiological patterns of canine visceral leishmaniasis in Western Liguria (Italy). Animal biology; 9; SABATÉ D, HOMEDES J. Study of the kinetic profile of the hormone prolactin after oral administration of Domperidone to male beagle dogs. ESTEVE veterinaria. Internal Report nr: EV-04/05-SN, SABATÉ D, HOMEDES J. Study of the kinetic profile of the hormone prolactin after oral administration of Domperidone to female beagle dogs. ESTEVE veterinaria. Internal Report nr: EV-04/10-SN, 2006a. SABATÉ D, HOMEDES J. Study of the kinetic profile of the hormone prolactin after repeat oral administration of Domperidone to beagle dogs. ESTEVE veterinaria. Internal Report nr: EV-04/14-SN, 2006b. SALICHS M, SABATÉ D, HOMEDES J. Estudio de eficacia de la domperidona para inducir una estimulación inmunológica tras la vacunación de cachorros de 6 semanas de vida. Internal Report nr: EV-05/14-SN, 2006a. SALICHS M, SABATÉ D, HOMEDES J. Estudio de eficacia de la domperidona para inducir una estimulación inmunológica tras la vacunación de cachorros de 8 semanas de vida. Internal Report nr: EV-05/15-SN, 2006b. SATTA G, GRAMICCIA M, PINTORE A, SOLINAS G, PUGGIONI G, ULLIO A 6 GRADONI L. An investigation of leishmaniasis by leishmanin skin test in northern Sardinia, Italy. Acta Parasitologica Turcica, 1997; 21 (supplement 1): 142. SCALONE A, DE LUNA R, OLIVA G, BALDI L, SATTA G, VESCO G, MIGNONE W, TURILLI C, MONDESIRE RR, SIMPSON D, DONOGHUE AR, FRANK GR, GRADONI L. Evaluation of the leishmania recombinant K39 antigen as a diagnostic marker for canine leishmaniasis and a validation of a standardized ensyme-linked immunosorbent assay. Veterinary Parasitology, 2002; 104; SCARPONA S, ROMEI F, DI CICCO E, ROSSI G. The spontaneous and stimulated Nitroblue Tetrazolium (NBT) test in mononuclear cells of dogs with Leishmaniosis: an useful method to assess the cell mediated immune-response. Proceedings of the 2nd International Congress on Canine leishmania, 2010; Pisa. p 167. SMELT SC, COTTERELL SE, ENGWERDA CR, KAYE PM. B (2000) cell-deficient mice are highly resistant to Leishmania donovani infection, but develop neutrophilmediated tissue pathology. J Immunol., 2000; SOLANO-GALLEGO L, MORELL P, ARBOIX M, ALBEROLA J, FERRER L. Prevalence of Leishmania infantum infection in dogs living in an area of canine leishmaniasis endemicity using PCR on several tissues and serology. J Clin Microbiol Feb;39(2): SOLANO-GALLEGO L, KOUTINAS A, MIRÓ G, CARDOSO L, PENNISI MG, FERRER L, BOURDEAU P, OLIVA G, BANETH G. Directions for the diagnosis, clinical staging, treatment and prevention of canine leishmaniosis. Vet Parasitol., 2009; Oct 28;165(1-2):

85 SOLANO-GALLEGO L, MIRÓ G, KOUTINAS A, CARDOSO L, PENNISI MG, FERRER L, BOURDEAU P, OLIVA G, BANETH G, LeishVet guidelines for the practical management of canine leishmaniosis. The LeishVet Group. Parasit Vectors., 2011; May 20;4:86. SOLINAS G, PINTORE A, PUGGIONI G, SATTA G, MORETTI F, SANNA L. Epidemiological survey on canine leishmaniasis of a north Sardinia human cutaneos focus by leishmania infantum. EMOP VII ABSTRACTS; Parassitologia, 1996; 38; 321; E1 23. SOUSA S, LOPES AP, CARDOSO L, SILVESTRE R, SCHALLIG H, REED SG, CORDEIRO DA SILVA A. Seroepidemiological survey of Leishmania infantum infection in dogs from northeastern Portugal. Acta Trop., 2011; Oct-Nov;120 (1-2):82-7. SWARKO-SONTA K. Prolactin as an immunoregulatory hormone in mammals and birds. Immunology Letters.,1992; 33: TAKAHASHI T, KUROSAWA S, WILEY JW, OWYANG C. Mechanism for the Gastrokinetic Action of Domperidone. Gastroenterology, 1991; 104: TORINA A, NICOSIA S, VULLO A, SCHIAVO MR, VESCO G, CARACAPPA S. Leishmania infantum and tick borne disease co-infection in dogs. Proceedings of 3rd World Congress on Leishmaniosis (Worldleish 3) 2005a; Palermo-Terrasini, Italy, 10-15/04/2005; P TORINA A, POLIZZI D, CURRO V, CARACAPPA S. Age and sex are influent on canine leishmaniasis epidemiology? Proceedings of 3rd World Congress on Leishmaniosis (Worldleish 3), Palermo-Terrasini, Italy, 2005b; 10-15/04/2005; P TORINA A, SOLE M, VITALE F, PINELLA V, MANISCALCO M. Epidemiological observation in an endemic areas of cutaneous leishmaniasis in Sicily. Proceedings of 3rd World Congress on Leishmaniosis (Worldleish 3), Palermo-Terrasini, Italy, 2005c; 10-15/04/2005; P VERA-LASTRA O, JARA LJ, ESPINOZA LR. Prolactin and autoimmunity. Autoimmun. Rev., 2002; Dec;1(6): VICH-GL9: Good Clinical Veterinary Practices. EMEA/CVMP/VICH/595/1998 WHO TECHNICAL REPORT SERIES ; NO. 94 Control of the leishmaniasis: report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniases WHO Library Geneva, March ZAFFARONI E, RUBAUDO L, LANFRANCHI P, MIGNONE W. Epidemiological patterns of canine leishmaniasis [correction of leishmaniosis] in Western Liguria (Italy). Vet Parasitol Feb 1;81(1):11-9. ZANDBERGEN VG, HERMANN N, LAUFS H, SOLBACH W, LASKAY T. Leishmaniapromastigotes release a granulocyte chemotactic factor and induce interleukin-8 release but inhibit gamma interferon-inducible protein 10 productionby neutrophil granulocytes. Infect Immun., 2002; 70:

86