Strategie per la garanzia della sicurezza e qualità microbiologica. Progetti di ricerca 2014

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1 Strategie per la garanzia della sicurezza e qualità microbiologica Progetti di ricerca 2014 Parma, 17 giugno 2014 TECNOLOGIE, SICUREZZAE QUALITA NELLATRASFORMAZIONE DEGLI ALIMENTI Giornata di aggiornamento sull attività di ricerca della Stazione Sperimentale Industria Conserve Alimentari

2 Dipartimento di Microbiologia PARMA 7 ricercatori 4 tecnici 1 co.co.pro. 2 borsisti ANGRI 2 ricercatori 1 tecnico Parma ( (+39) (+39) Angri (SA) ( (+39) (+39)

3 Attività del Dipartimento di Microbiologia Ricerca Parole chiave Biopreservazione Tecniche di decontaminazione Caratterizzazione genomica Popolazioni microbiche Modellazione predittiva Analisi ACCREDIA N e N Microbial Challenge test Studi di shelf-life Causa di alterazione Ricerca microrganismi patogeni Microbiota prodotti fermentati Identificazioni di batteri e miceti Prove di stabilità e sterilità

4 Aree di ricerca 2014 POPOLAZIONI MICROBICHE Microbiota Alterazione QUALITÀ HPP Ozono Ohmico Calore SICUREZZA Controllo patogeni Biocompetizione Validazione di processo di prodotto

5 Popolazioni microbiche P Valutazione della problematica nell identificazione delle popolazioni microbiche: nuove strategie molecolari P Difetto di vena in prosciutto crudo - approfondimenti

6 P1419-VALUTAZIONE DELLA PROBLEMATICA DELL IDENTIFICAZIONE DELLE POPOLAZIONI MICROBICHE: NUOVE STRATEGIE MOLECOLARI Contatto Maria Angela Frustoli Tel CEPPI BATTERICI APPARTENENTI ALLA STESSA SPECIE INDISTINGUIBILI DA UN PUNTO DI VISTA BIOCHIMICO PULSE FIELD GEL ELECTROPHORESIS

7 SCOPO METODO OBIETTIVI Determinazione semiquantitativa di microrganismi Studio di popolazioni microbiche Identificazioni specie batteriche e micetiche RT PCR + HRM DGGE PCR RFLP Riduzione dei tempi analitici Possibilità di differenziazione inter ed intra specie Studio del microbiota di prodotti tipici Studio dei microrganismi di alterazione Superamento dei limiti dell identificazione tradizionale Tempi brevi di risposta specificità

8 P Difetto di vena in prosciutto crudo - approfondimenti Contatto Silvia Grisenti Tel silvia.grisenti@ssica.it La problematica oggetto dello studio riguarda l insorgenza di difetti di alterazione del prosciutto crudo localizzati all'uscita della vena femorale: "difetti di vena". La presenza del difetto è denunciata da un odore sgradevole (putrefattivo-butirrico) percepito attraverso l ago-sonda. E stata evidenziata, in prosciutti che presentavano il difetto, la presenza di microrganismi in grado di crescere in presenza di elevate concentrazioni saline e a temperature di refrigerazione, ma non è stato possibile attribuire con certezza la presenza di tali batteri all'insorgenza del difetto. I composti organici volatili presenti nello spazio di testa dei prosciutti sono stati identificati e semi-quantificati.

9 Risultati ottenuti Presenza di ceppi alotolleranti o moderatamente alofili non ascrivibili al microbiota tipico. Gram negativi: Halomonas Salinivibrio Proteus Psychrobacter Halanaerobium 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% C74 C69 C68 C77 C72 Gram positivi: Corynebacterium Brevibacterium Carnobacterium Marinilactibacillus Alkalibacterium Con l analisi GC-MS sono stati identificati e quantificati almeno 23 composti per i quali sono state rilevate differenze tra prosciutti con e senza difetto. I segnali che aumentano nei prosciutti con difetto derivano da molecole generate dal metabolismo microbico a carico di proteine, carboidrati e lipidi.

10 Riproduzione del difetto in sistemi modello Progettazione del sistema modello: Terreni colturali Porzioni di prosciutto Sistemi modello Inoculo Inoculo di microrganismi identificati come possibili responsabili del difetto in sistema modello a base prosciutto Verifica dell accrescimento microbico Analisi dei composti volatili Analisi

11 Riproduzione del difetto in prosciutto (in fase di esecuzione) Inoculo Reperimento di prosciutti alla fine della fase fredda Prosciutti Inoculo di microrganismi identificati come possibili responsabili del difetto in prosciutto Verifica accrescimento microbico Analisi dei composti volatili Analisi Sulla base dei risultati ad oggi ottenuti, non è possibile escludere che l insorgenza del difetto possa essere associata allo sviluppo contemporaneo o susseguente di microrganismi appartenenti a generi diversi.

12 QUALITÀ STABILITÀ E SHELF-LIFE P Determinazione della resistenza termica e della capacità di accrescimento di sei ceppi di B.coagulans in derivati del pomodoro a diversi valori di residuo ottico, di ph e di temperatura d incubazione; valutazione dell effetto di trattamenti termici sub-letali nel tempo. P Impiego di ozono gassoso per la sanitizzazione e il prolungamento della shelf-life di frutti di bosco. P Valutazione della termoresistenza di lieviti in presenza/assenza di ascospore in creme di farcitura. P Definizione dei parametri di termoresistenza microbica mediante trattamento ohmico. SSICA

13 P Determinazione della resistenza termica e della capacità di accrescimento di sei ceppi di B.coagulans in derivati del pomodoro a diversi valori di residuo ottico, di ph e di temperatura d incubazione; valutazione dell effetto di trattamenti termici sub-letali nel tempo Contatto Giuseppe Pirone Tel giuseppe.pirone@ssica.it B. coagulans capacità di alterare derivati del pomodoro non concentrati. Alcuni ceppi sono in grado di accrescersi in pomodoro concentrato a 18 Brix ma non è nota analoga capacità dopo applicazione di trattamenti termici. Derivati del pomodoro e/o prodotti compositi (tipo salse) con valori di residuo ottico più elevato rispetto a prodotti tradizionali.

14 P Impiego di ozono gassoso per la sanitizzazione e il prolungamento della shelf-life di frutti di bosco. Contatto Maria Paola Previdi Tel paola.previdi@ssica.it I frutti di bosco sono prodotti estremamente delicati; per questo motivo non vengono lavati o trattati (blaching) prima della commercializzazione. Rischio sanitario - legato al consumo di tali prodotti se non trattati termicamente Scopo: abbattimento della carica microbica, allungamento della shelf-life, sicurezza del prodotto

15 Risultati preliminari Mirtilli, More, Lamponi, Fragole microflora costituita prevalentemente da Muffe e Lieviti ufc/g La concentrazione di tale microflora è molto variabile da frutto a frutto; le muffe sono predominanti. Mirtillo: 100 ppm O 3 = circa 2 D (muffe) in 90 min. Mora: 100 ppm O 3 = circa 2 D (muffe) in 30 min. SSICA

16 P Valutazione della termoresistenza di lieviti in presenza/assenza di ascospore in creme di farcitura. Contatto Barbara Franceschini Tel barbara.franceschini@ssica.it I lieviti osmofili sono tra i microrganismi più frequentemente ritrovati come causa d alterazione di creme di farcitura ad elevato contenuto zuccherino TRATTAMENTO TERMICO INFLUENZATO DA: basso valore di attività dell acqua (a w ) del prodotto capacità di questi lieviti di formare ascospore SSICA

17 OBIETTIVI DELLO STUDIO confronto tra la termoresistenza di: cellule vegetative di miscele di cellule vegetative ed aschi/ascospore in substrato colturale a ridotta a w e in creme di farcitura ad alto contenuto zuccherino. RISULTATI ATTESI Indicazioni per trattamenti termici idonei applicabili a creme di farcitura SSICA

18 Validazione di processi di inattivazione microbica Contatto Paola Mutti Tel Identificazione e raccolta di microrganismi target per lo studio delle cinetiche di inattivazione batterica in differenti matrici alimentari sottoposte a diverse tipologie di agenti inattivanti. Validazione mediante linee guida internazionali di impianti e processi coinvolti nelle tecnologie di riempimento asettico. Valutazione dei trattamenti di inattivazione microbica per mezzo di agenti chimici e fisici.

19 Log ufc/ml P Definizione dei parametri di termoresistenza microbica mediante trattamento ohmico Inattivazione termica Listeria monocytogenes SSICA tempo (min) Specie batterica e collezione di appartenenza L. monocytogenes ATCC 7644 L. monocytogenes SSICA L. monocytogenes Scott A Andamento a 55 C Andamento a 60 C Andamento a 63 C Valutazione delle termoresistenze di differenti microrganismi patogeni in misto d uovo pastorizzato con tecnologia Ohmica. T di trattamento ( C) D T medio (min) Dev.st 55 4,98 0, ,65 0, ,54 0, ,51 0, ,38 0, ,87 0, ,63 1, ,35 0, ,36 0,02 z ( C) 8,5 8,7 6,1

20 CONTROLLO PATOGENI E BIOCOMPETIZIONE P Caratterizzazione della flora fungina superficiale dei culatelli e valutazione di metodi di biocontrollo per contrastare l instaurarsi di muffe sgradite P Inattivazione e controllo di microrganismi patogeni in alimenti: valutazione del possibile impiego di microrganismi quali agenti di biocompetizione

21 Strategie per la garanzia della sicurezza e qualità microbiologica Inattivazione e controllo di microrganismi patogeni in alimenti: valutazione del possibile impiego agenti di biocontrollo M. Silvia Grisenti Parma, 17 giugno 2014 TECNOLOGIE, SICUREZZAE QUALITA NELLATRASFORMAZIONE DEGLI ALIMENTI Giornata di aggiornamento sull attività di ricerca della Stazione Sperimentale Industria Conserve Alimentari

22 SICUREZZA e STABILITA microbiologica si basano sull applicazione di una serie di fattori limitanti lo sviluppo microbico chiamati OSTACOLI Per i controllo di uno sviluppo microbico inopportuno sono disponibili diverse sostanze conservanti o differenti trattamenti tecnologici. L applicazione di queste soluzioni spesso interferisce con le caratteristiche sensoriali e non è ben accetta dal consumatore. I consumatori chiedono prodotti naturali minimamente trattati con meno conservanti possibile e di elevato valore nutrizionale L applicazione di strategie di biocontrollo basata sull inoculo di colture antagoniste potrebbe essere una valida alternativa.

23 Strategie di biocontrollo Gli agenti di biocontrollo sono microrganismi antagonisti (batteri, virus, funghi) aggiunti ad un alimento al fine di inattivare e/o inibire lo sviluppo di microrganismi patogeni o alteranti e/o prolungare così la vita commerciale dei prodotti mantenendo le proprietà organolettiche il più a lungo possibile. In particolare, i batteri lattici, oltre a competere per i nutrienti, producono numerosi metaboliti ad attività anti-microbica quali: acidi organici perossido di idrogeno diacetile batteriocine Sono riconosciuti come GRAS (Generally Recognized As Safe) da FDA essendo normalmente impiegati in prodotti fermentati

24 Progetti SSICA 2014 Impiego di agenti di bioprotezione come strategia per il controllo di L. monocytogenes in salmone affumicato Controllo di Listeria monocytogenes in prosciutto crudo: strategie per affrontare il limite tolleranza zero nell export extra UE Caratterizzazione della flora fungina superficiale dei culatelli e valutazione di metodi di biocontrollo per contrastare l instaurarsi di muffe sgradite

25 Impiego di agenti di bioprotezione come strategia per il controllo di L. monocytogenes in salmone affumicato Salmone affumicato: Minimally Processed Foods subiscono un trattamento di conservazione moderato mild necessitano uno stoccaggio e una distribuzione refrigerata hanno un attività dell acqua superiore a 0,85 hanno un ph superiore a 4,5 Il salmone affumicato rientra nella categoria degli alimenti pronti al consumo ready to eat e minimamente processati lightly preserved. I lightly preserved fish products sono alimenti altamente deperibili.

26 Regolamento (CE) 2073/2005 Criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari Criterio microbiologico definisce l accettabilità di un prodotto, di una partita di prodotti alimentari o di un processo, in base all assenza, alla presenza o al numero di microrganismi e/o in base alla quantità delle relative tossine/metaboliti, per unità di massa, volume area o partita Art.3 OSA Produttori RTE Assicurare prodotti conformi ai criteri microbiologici e nel rispetto dei limiti stabiliti (allegato 1): categoria di alimenti, piano di campionamento, limiti microbiologici, metodi analitici, fase in cui il criterio si applica. Studi sulla vita commerciale (di cui all allegato 2) per verificare il rispetto dei criteri per l intera durata della vita commerciale.

27 L. monocytogenes e salmone affumicato Salmone affumicato Caratteristiche: Temperatura di conservazione: 4 C a w medio 0,96 Listeria monocytogenes Condizioni di sviluppo Temperatura: 2,5-44 C a w 0,92 Contaminazione della materia prima Contaminazione POST PROCESSO (affettamento e confezionamento) ph medio 6,2 ph 5,0 9,0 Criterio alimentare 1.2 Alimenti pronti che costituiscono terreno favorevole alla crescita di Listeria monocytogenes diversi da quelli destinati ai lattanti e a fini medici speciali Piano di campionamento Limiti n c m M ufc/g (5) 5 0 Assente in 25 g (7)

28 Scopo del lavoro: Valutazione del possibile impiego di alcuni ceppi di batteri lattici in salmone affumicato preaffettato e confezionato sottovuoto: Lactococcus lactis subsp. Lactis e Leuconostoc carnosum come agenti di bioprotezione nei confronti di L. monocytogenes mediante allestimento di MCT. Disegno sperimentale Le baffe, dopo un iniziale caratterizzazione microbiologica e chimico-fisica, sono state porzionate e confezionate in buste sottovuoto al fine di allestire 4 diverse linee di prodotto: PL: Prodotto + L. monocytogenes PLS: Prodotto + L. monocytogenes + coltura bioprotettiva PS: Prodotto + coltura bioprotettiva Controllo temperatura mista (3gg a 2 C + 3gg a 4 C + 44gg a 8 C) temperatura costante (60gg a 8 C) 100µl Scott A, ATCC 7644 L1,L2,L ufc/g 100µl Lactococcus lactis subsp. lactis Leuconostoc carnosum 10 6 ufc/g

29 Log ufc/g Log ufc/g Batteri lattici C Giorni Incubazione a temperatura mista (3gg a 2 C + 3gg a 4 C + 44gg a 8 C) Giorni Controllo PLS PS C Giorni Controllo PLS PS Incubazione a temperatura costante (60gg a 8 C) Giorni

30 ph Incubazione a temperatura mista (3gg a 2 C + 3gg a 4 C + 44gg a 8 C) 7,00 6,50 6,00 5,50 Controllo linea PS 5, Giorni 7,00 6,50 Incubazione a temperatura costante (60gg a 8 C) 6,00 5,50 5, Controllo Linea PS Giorni

31 Log ufc/g Log ufc/g Listeria monocytogenes Incubazione a temperatura mista (3gg a 2 C + 3gg a 4 C + 44gg a 8 C) PL MISTA PLS MISTA Giorni Incubazione a temperatura costante (60gg a 8 C) PL 8 C PLS 8 C Giorni

32 considerazioni Nelle condizioni di conservazione normalmente applicate per il salmone affumicato L. monocytogenes, se presente, potrebbe raggiungere in tempi brevi livelli critici. L utilizzo di agenti di protezione: Lactococcus lactis subsp. Lactis e Leuconostoc carnosum si è rivelata un efficace strategia per il controllo della crescita di L. monocytogenes in salmone affumicato. Se il trattamento con colture bioprotettive fosse inserito nello standard di produzione attraverso uno studio di validazione si potrebbe far rientrare il prodotto nella categoria: alimenti che non supportano la crescita di L. monocytogenes Problemi aperti Individuare sulla linea un punto di nebulizzazione adatto Inserire sul mercato un prodotto con una CMA elevata ad inizio shelf-life

33 Controllo di Listeria monocytogenes in prosciutto crudo: strategie per affrontare il limite tolleranza zero nell export extra UE 9 CFR PART Control of L. monocytogenes in RTE meat and poultry products IL PRODOTTO È ESPOSTO IN FASE POST-LETALE? Definizione di ambiente post-letale: l area di uno stabilimento nella quale il prodotto, che è stato sottoposto ad un trattamento letale, entra in contatto con l ambiente In quale alternativa riteniamo/vogliamo/possiamo far rientrare il prodotto? Alternativa 1 - trattamento post-letale e agente/processo antimicrobico (documentata l efficacia dei trattamenti) Alternativa 2 - trattamento post-letale o agente/processo antimicrobico (documentata l efficacia dei trattamenti) Alternativa 3 utilizzo di misure di sanificazione

34 FSIS Compliance Guideline: Controlling Listeria monocytogenes in Post-lethality Exposed Ready-to-Eat Meat and Poultry Products Trattamenti post-letali: Trattamenti impiegati allo scopo di ridurre o eliminare i livelli di contaminazione dei RTE da L. monocytogenes Trattamenti post-letali riduzione di 2 Log ( o almeno 1) Lattati, acetati, di-acetati, ozono e Batteriofagi Agenti e Processi antimicrobici accrescimento al massimo di 1 Log (mai superiore a 2 log) prima che il prodotto esca dallo stabilimento per tutta la durata della shelf-life

35 I Batteriofagi sono i più abbondanti microrganismi nell ambiente (acqua e alimenti). Sono innocui per esseri umani, animali e piante. Sono virus che infettano e uccidono solo i batteri. Sono altamente specifici e non influenzano: I batteri desiderati negli alimenti (colture starter) I commensali del tratto intestinale La naturale flora batterica dell ambiente Batteriofagi: meccanismo d azione

36 Scopo del lavoro: Valutazione del possibile impiego di batteriofagi sulla superficie di tranci di prosciutto crudo confezionato sottovuoto: LISTEX P100 come agente di bioprotezione nei confronti di L. monocytogenes mediante allestimento di MCT. Disegno sperimentale Inoculo Confezionamento Shelf-life Incubazione a (20gg a 4 C + 40gg a 8 C ) 10 7 ufp/cm 2 sul prodotto Incubazione a (20gg a 4 C + 20gg a 8 C + 20gg a 20 C) 130 Tranci campioni campioni campioni non + L. monocytogenes 10 2 ufc/g + L. monocytogenes 10 5 ufc/g inoculati

37 Log ufc/g Log ufc/g Temperatura C Prova 1 Inoculo L. monocytogenes 10 3 ufc/g Giorni Incubazione a (20gg a 4 C + 40gg a 8 C ) Media di 5 campioni analizzati Giorni 1,3 riduzioni logaritmiche 1,5 riduzioni logaritmiche Inoculo L. monocytogenes 10 6 ufc/g Giorni 2,1 riduzioni logaritmiche 1,7 riduzioni logaritmiche

38 Log ufc/g Log ufc/g Temperatura C Prova 2 Inoculo L. monocytogenes 10 2 ufc/g Giorni Incubazione a (20gg a 4 C + 20gg a 8 C + 20gg a 20 C) Media di 5 campioni analizzati Giorni 1,4 riduzioni logaritmiche 3,5 riduzioni logaritmiche Inoculo L. monocytogenes 10 6 ufc/g ,6 riduzioni logaritmiche 2 1 3,2 riduzioni logaritmiche Giorni 2,2 riduzioni logaritmiche

39 considerazioni I dati preliminari mostrano che il fago P100 è in grado di ridurre la concentrazione di L. monocytogenes sulla superficie di prosciutto crudo (a w 0,92) Dopo 24 ore dal trattamento (4 C): A livelli di L. monocytogenes di circa 100 ufc/g: nd >1 Log A livelli di L. monocytogenes di circa 10 6 ufc/g: nd >2 Log Al termine della shelf-life (60 giorni): Nei prosciutti non trattati non è mai stato osservato accrescimento. Nei prosciutti trattati con fagi, L. monocytogenes a temp C : nd 1,5 Log L. monocytogenes a temp C: nd 3,2 Log Il fago ha mantenuto azione litica per l intera durata del periodo di osservazione nella seconda prova.

40 Caratterizzazione della flora fungina superficiale dei culatelli e valutazione di metodi di biocontrollo per contrastare l instaurarsi di muffe sgradite Obiettivi dello studio: Identificare e caratterizzare la flora fungina superficiale autoctona, altresì individuando eventuali specie responsabili di fenomeni alterativi. Valutare l efficacia di metodi microbiologici di biocontrollo per contrastare l instaurarsi di muffe sgradite.

41 In futuro.. Applicazione di agenti di biocontrollo nel corso della shelf-life di altre tipologie di prodotti Impiego di batteriofagi in prosciutto crudo con differenti caratteristiche fisicochimiche, prodotti carnei cotti, vegetali o ittici..proposte???