- Uno dei meccanismi biologici più importanti è connesso al controllo della divisione e proliferazione cellulare.

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1 - L obiettivo principale della ricerca biomedica consiste nel tentativo di comprendere, a livello molecolare, processi biologici complessi al fine di migliorare la salute ed il benessere dell uomo. - Uno dei meccanismi biologici più importanti è connesso al controllo della divisione e proliferazione cellulare. - Infatti, alterazioni in questo meccanismo sono alla base di molte malattie dell uomo, in particolare dell insorgenza di tumori. - Tuttavia, e non solo per evidenti motivi etici, l uomo spesso non è l organismo più idoneo per la sperimentazione biologica. ORGANISMI MODELLO

2 ORGANISMI MODELLO - Il loro utilizzo deve essere economico; - Devono poter essere tenuti in condizioni controllate di laboratorio occupando il minor spazio possibile; - Devono avere un ciclo di riproduzione rapido; - Devono originare una progenie numerosa; - La sequenza del loro genoma deve essere nota; - Devono avere caratteristiche che permettano l applicazione delle più moderne tecnologie genetiche e molecolari. conservazione evolutiva

3 il batterio Escherichia coli il lievito Saccharomyces cerevisiae il moscerino della frutta Drosophila melanogaster il nematode Caenorhabditis elegans il pesce Dania rerio (zebrafish) il topo Mus musculus la pianta erbacea infestante Arabidopsis thaliana

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5 LIEVITO mammifero onorario a? mammifero onorario Università degli Studi di Milano Settore Didattico, via Celoria 20, Milano Laboratorio 105

6 GRUPPO DI LAVORO A cura di: Prof.ssa Cinzia Grazioli, insegnante di Scienze delle scuole secondarie di secondo grado, distaccata presso il Cus-Mi-Bio Prof.ssa Maria Grazia Fiorin, IIS P.Levi, Bollate Prof.ssa Cristina Gritti, Liceo Statale G.Galilei, Caravaggio Prof.ssa Maria Teresa Oliveira, IPSIA Fiocchi, Lecco Prof.ssa Olga Pecorari, ITSOS M.Curie, Cernusco sul Naviglio Prof.ssa Maria Rosaria Quarta, IIS Schiapparelli, Milano Prof.ssa Giovanna Tabita, IIS Leonardo da Vinci, Cologno Monzese Supervisione di: Prof. Paolo Plevani, Dipartimento di Biologia e Biotecnologie, Università degli Studi di Milano.

7 Vantaggi generali del lievito Saccharomyces cerevisiae per studi di Genetica E un eucariote unicellulare che può essere cresciuto facilmente in terreni liquidi o solidi definiti fornendo un completo controllo dei parametri ambientali; Può esistere stabilmente sia come organismo aploide che diploide: in tal modo, mutazioni recessive possono facilmente essere isolate ed analizzate in ceppi aploidi, mentre analisi di complementazione possono essere fatte in ceppi diploidi. I prodotti della meiosi possono essere facilmente analizzati Importanza di tali caratteristiche per screening genetici

8 Il ciclo vitale del lievito Saccharomyces cereviae e la sua importanza per l analisi genetica Sporulazione e divisione meiotica spore Un asco che contiene le 4 spore aploidi prodotte durante il processo meiotico. asco Il ciclo vitale del lievito Saccharomyces cerevisiae. I due ceppi aploidi (a e alfa) possono accoppiarsi e formare il ceppo diploide a/alfa che, in condizioni limitanti di nutrienti, va incontro a sporificazione rigenerando nel processo meiotico spore aploidi. U n m i c r o s c o p i o c o n micromanipolatore utilizzato per la dissezione degli aschi.

9 Argomento di oggi: Il controllo del ciclo cellulare Perché il lievito è stato e continua ad essere il modello biologico più importante per lo studio di questo essenziale processo

10 Il ciclo cellulare Il ciclo cellulare è una sequenza ordinata di eventi che possono essere eseguiti solo quando l evento precedente è stato correttamente completato. Fase S (una solo volta per ciclo) e completata prima di M.

11 I checkpoints intrinseci controllano la successione degli eventi in condizioni fisiologiche Cromosomi non ancorati alle fibre del fuso mitotico Genome segregation Mitosi non finita Genome duplication ids Replicazione del DNA incompleta

12 Checkpoints estrinseci si aggiungono a quelli intrinseci in condizioni patologiche (ad es. danni al DNA) danni al DNA cromosomi non ancorati alle fibre del fuso mitotico Genome segregation mitosi non finita Genome duplication ids danni al DNA danni al DNA replicazione del DNA incompleta

13 Il ciclo cellulare come integrazione fra eventi continui e discontinui Processi continui: crescita cellulare, sintesi proteica, ribosomi, mitocondri, membrane etc. Processi discontinui: replicazione dei cromosomi, segregazione dei cromosomi L organismo modello per lo studio dell integrazione degli eventi del ciclo cellulare è stato il lievito S.cerevisiae

14 - Il lievito S.cerevisiae si divide per gemmazione - Importanza del coordinamento tra aumento della massa e ciclo cromosomico

15 Il lievito per lo studio del ciclo cellulare G1 S G2 M S.cerevisiae si divide per gemmazione. La posizione delle cellule durante il ciclo può essere Stabilita osservando vari parametri : Morfologia cellulare Contenuto del DNA Morfologia del nucleo Il centro di organizzazione dei microtuboli La morfologia delle fibre del fuso 15

16 Il lievito per lo studio del ciclo Le cellule possono essere bloccate: G1 con alpha-factor S con HU M con nocodazolo Temperatura utilizzando mutanti cdc Colture sincrone possono essere ottenute mediante: - Blocco e rilascio (alpha factor, HU, Nocodazole, temperatura) - Possono essere analizzate mediante citofluorimetria a flusso

17 Avendo a disposizione cellule sincrone si possono fare molte osservazioni morfologiche e molecolari, per es. valutare il livello di specifiche proteine

18 Lee Hartwell, premio Nobel 2001, per la scoperta dei mutanti cell division cycle (cdc) Geni che controllano il ciclo cellulare devono essere essenziali per la vitalità cellulare. a) Come si possono trovare mutazioni in geni essenziali per la vita della cellula? b) Come si possono individuare (tra le mutazioni che aboliscono la vitalità di una cellula) le mutazioni che bloccano specifiche funzioni richieste per il controllo del ciclo cellulare?

19 a) Come si possono trovare mutazioni in geni essenziali per la vita della cellula? Ricerca di mutazioni letali-condizionali; ad es. temperatura-sensibili ts La tecnica del replica-plating per individuare mutazioni temperatura-sensibili in lievito (vedi testo per i dettagli). La stessa tecnica è utilizzata per individuare analoghe mutazioni anche nei batteri.

20 Individuazione di mutanti cdc in lievito

21 Combinando più mutazioni cdc che informazioni possiamo ottenere? Mutanti cdc bloccati in diverse fasi del ciclo cellulare. Il gene CDC28 codifica per una funzione richiesta per il passaggio dalla fase G1 alla fase S. Infatti, tutte le cellule cdc28 mutanti si bloccano con la morfologia tipica di cellule in G1 (senza gemma) dopo trasferimento alla temperatura non-permissiva. Il gene CDC7 codifica una funzione richiesta per la fase S. Infatti, tutte le cellule mutanti cdc7 hanno la stessa morfologia (una gemma più piccola della cellula madre, tipica di cellule in fase S). Cellule che portano entrambe le mutazioni si bloccano con la morfologia tipica dei mutanti cdc28 e non di mutanti cdc7, indicando che il gene CDC28 agisce temporalmente prima del gene CDC7. Il gene CDC28 agisce prima del gene CDC7

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23 G1 A G1 1st cycle M S M S B G2 G1 G1 G2 A 2nd cycle M S B M S G2 G2

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25 Vantaggi generali del lievito Saccharomyces cerevisiae per studi di clonaggio e di Biologia Molecolare Il lievito è facilmente trasformabile. Esistono una varietà di vettori di clonaggio che possono essere introdotti in lievito ed usati per esprimere geni omologhi o eterologhi; Tali vettori possono mantenersi come elementi extracromosomici o essere indotti ad integrarsi in specifiche posizioni nel genoma di lievito; In tal caso, l integrazione nel genoma avviene per lo più tramite ricombinazione omologa; Facilità di esperimenti 1) di Knock-out; 2) Knock-in; 3) mutagenesi GENOMICA FUNZIONALE: REVERSE GENETICS

26 Clonaggio di tutti i geni CDC mediante complementazione funzionale Cosa vuole dire???? Costruzione di una libreria di DNA in un vettore plasmidico. Diversi frammenti di DNA di un organismo (colori diversi) sono inseriti nello stesso vettore di clonaggio, ed i plasmidi ricombinanti vengono utilizzati per trasformare cellule di E.coli o lievito. Nella popolazione di plasmidi ricombinanti è rappresentato tutto il genoma dell organismo utilizzato per la preparazione della libreria. Cosa succede se in una cellula di lievito porta una mutazione recessiva in una gene cdc ed in tale cellula si fa entrare un plasmide che porta il gene selvatico?

27 La sviluppo di vettori per il clonaggio in lievito ha portato a scoperte estremamente importanti per l individuazione e studio di regioni di DNA essenziali per la stabilità del genoma: - Origini di replicazione del DNA - Centromeri - Telomeri Vettori: YIp (Yeast Integrative plasmid) YRp (Yeast Replicative plasmid) YCp (Yeast Centromeric plasmid) YAC (Yeast Artificial Chromosome)

28 Un paziente può essere l equivalente di un mutante di lievito

29 La stabilità del genoma: il problema 46 cromosomi; 6.5 miliardi di nucleotidi da replicare e segregare Il DNA deve essere riparato

30 Il DNA è l unica molecola che la cellula si prende la fatica di riparare Centinaia di lesioni diverse causate da: a) Metabolismo cellulare b) Agenti chimico-fisici

31 Il numero di lesioni endogene/cellula/24 ore è molto elevato: sistemi di riparazione devono essere altamente efficienti ssdna breaks interstrand crosslinks dsdna breaks

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33 Una singola mutazione in un gene che codifica per una funzione richiesta per la riparazione del DNA può causare instabilità genomica Cellula normale Mutazione in Instabilità un gene della genomica riparazione del DNA Cellula tumorale

34 Fenotipo mutatore

35 Instabilità genomica in cellule tumorali Rotture Delezioni Traslocazioni Inversioni Duplicazioni Amplificazioni

36 La risposta della cellula a danni al DNA è molto complessa Riparazione Danni al DNA DNA damage checkpoints Ciclo cellulare Replicazione del DNA Trascrizione Apoptosi Meccanismi conservati dal lievito all uomo Mutazioni nei geni dei checkpoints causano instabilità genomica