Metodi per la produzione di proteine ricombinanti
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- Filippo Cuomo
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1 Metodi per la produzione di proteine ricombinanti
2 Lo sviluppo di tecnologie per la produzione di proteine ricombinanti ha dato un impulso enorme alla ricerca sulle proprietà strutturali e funzionali delle proteine La produzione di proteine ricombinanti ha ricadute industriali e farmaceutiche importanti
3 Processi industriali che utilizzano proteine Agriculture ANIMAL FEED Baking BREWING DETERGENTS Fermented Products FOOD Fruit Juices PHARMACEUTICALS Pulp and Paper Starch Processing Textiles Source:
4 Alcune proteine umane ricombinanti da tempo approvate per uso medico Insulin (1987) Interleukin 2 (1989) Human growth hormone (1991) Glucagon (1992) Interferon gamma (1992) Erytropoietin (1992) Factor VIII (1993) Human DNAse (1994) Follitropin (1995) Calcitonin (1997) Recombinant Vaccines: Pertussis Hepatitis B Difteria Lyme disease
5 Produzione di proteine utilizzabili come farmaci Centinaia di proteine umane ad uso terapeutico sono state prodotte tramite la tecnologia rdna Il loro valore commerciale è enorme Si stima che il loro mercato valga oltre 150 miliardi di $ Ormone crescita Genentech 250 milioni $ Insulina Eli Lilly 277 miliioni $ Eritropoietina Amgen 2.15 miliardi $
6 Proteine Ricombinanti Ci sono differenze tra le proteine prodotte per usi industriali e quelle prodotte per uso terapeutico Queste riguardano la SICUREZZA (identità con il prodotto atteso, assenza di contaminazioni, riproducibilità della strategia di produzione) e i COSTI DI PRODUZIONE (devono essere bassi per PI, ma possono essere molto alti per PT)
7 Alcuni obiettivi di interesse biotecnologico Riuscire a produrre nuove proteine di interesse medico o industriale Massimizzare la produzione di proteine ricombinanti (un aumentata efficienza di produzione aumenta i profitti) Facilitare i processi di purificazione delle proteine Costruire proteine diverse da quelle presenti in natura, dotate di nuove e vantaggiose proprietà
8 Esempio: Veicolazione di farmaci tramite rmab farmaco Anticorpi monoclonali Proteina della superficie cellulare Cellula bersaglio La cellula fagocita il complesso proteina-anticorpo
9 Veicolazione di farmaci tramite rmab Profarmaco Farmaco Enzima anticorpo Antigene di superficie Cellula bersaglio
10 Strategie per la produzione di proteine ricombinanti Qual è l obiettivo? Come scegliere l ospite in cui produrre la proteina? Quanta proteina serve? Come esprimere la proteina (espressione costitutiva, inducibile..)?
11 Clonaggio molecolare
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13 Vettori procariotici Vettori di clonaggio Plasmidi (da 0,1 a Kb) naturali artificiali Col E1 psc101 pbr322 puc8 pembl8 Fagi (da 8 a 22 kb) lambda M13 Cosmidi (da 32 a 45 kb) Minicromosomi artificiali (es. YAC; da 100 a 2000 kb)
14 VETTORI DI CLONAGGIO Dai plasmidi batterici naturali sono derivati i vettori di clonaggio, le cui caratteristiche essenziali sono: Origine di replicazione Marcatore selezionabile Siti di restrizione unici
15 Vettore plasmidico
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18 Clonaggio mediante PCR
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21 Sistemi di espressione per la produzione efficiente di proteine ricombinanti Batteri (E. coli ) Lieviti (S. cerevisiae ; P. pastoris) Cellule in coltura (cellule di insetti e mammiferi) Modelli animali (mucche, pecore) o vegetali La scelta deve tenere conto di diversi fattori: - modificazioni post-traduzionali delle proteine - problemi a livello di regolazione genica - costi e possibilità di scaling up
22 I microrganismi sono facilmente manipolabili, economici, modificabili in tempi rapidi. Tuttavia, le proteine prodotte nei batteri sono prive di modificazioni post-traduzionali Le cellule di lievito e di insetto consentono di ottenere glicosilazioni, ma queste sono spesso specie-specifiche Le coltivazione di cellule di mammifero è lenta, costosa e difficilmente consente l ottenimento di proteine in alta resa L uso di animali come bioreattori ha alcuni vantaggi, ma notevoli limitazioni
23 Microbial expression hosts E. coli First choice for medium-small proteins ADVANTAGES Numerous specific vectors Very high transformation efficiencies Genetics well established Very fast and cheap growth High expression levels Very well understood fermentations Simple cell recovery and lysis Easy scale up procedures DISADVANTAGES Not naturally competent Low expression yields (sometimes) No post-translational modification of rprotein (glycosylations, acetylation, phosphorylation) Often proteins are denatured (need refolding) Problems with multimeric proteins and S-S bridges proteolysis rprotein not exported
24 Microbial expression hosts Saccharomyces cerevisiae ADVANTAGES Moderate/high expression yields rprotein glycosylated Cheap and fast growth rprotein exported Very well understood fermentations Easy scale-up Simple cell recovery DISADVANTAGES Low-medium transformation efficiency Limited range of vector systems rgenes must be stably incorporated Limited post-translational modifications Cell lysis
25 Insect cell expression Specific host-vector system; Sf9 cultured insect cells and Baculovirus vectors (circular double-stranded genome ranging from kbp) Advantages Higher eukaryote-like glycosylation Protein export Scaleable to large volumes Disadvantages Highly specific transformation system (Baculovirus) Quite new expression system Fastidious culture Very slow doubling time (20h) More expensive than microorganisms Not so easy to scale up
26 Animal cell culture Advantages Exact glycosylation Can be transformed to continuous cell lines Some (e.g., CHO cells) grow in suspension culture Some carcinomaderived cells (e.g., HeLa cells) have rapid growth rates Extracellular expression Disadvantages Some grow as adherent layer (anchorage dependent) Fastidious growth requirements Very slow doubling time (15-25h) Very susceptible to contamination Very sensitive to shear stress Very expensive media Low yields
27 Plant cell culture Advantages Suspension cultures Low aeration required rprotein directed to vacuole Disadvantages Restricted range of transformation systems Agrobacterium for dicots Biolistics for monocots Specific plant viruses Very slow doubling times (15h 48h) Very sensitive to shear stress Grow heterotrophically but require light for optimum growth
28 Other expression systems Whole animal expression Transformation of unfertilized embryo Use of tissue-specific promoters (e.g., lactose-specific promoter for expression of proteins in milk) Be careful of post-translational modification identity
29 Escherichia coli è il sistema di scelta per tutte le proteine di medie dimensioni ( aminoacidi) prive di modificazioni post-traduzionali. In ogni caso è utile per valutare la funzione delle modificazioni e per la preparazione di antigeni
30 E possibile esprimere la proteina in diversi modi: a) Espressione diretta citoplasmatica (proteina solubile nel citoplasma) b) Espressione diretta periplasmatica (proteina solubile nel periplasma) c) Espressione di una fusione.
31 Caratteristiche di un vettore di espressione
32 Manipolazione dell espressione genica nei procarioti Clonare un gene non è sempre sufficiente a garantire l espressione ad alti livelli della proteina codificata Spesso è necessario introdurre modifiche al vettore d espressione, al gene stesso o modificare l ospite.
33 Proprietà modificabili del sistema di espressione 1) Promotore 2) Sequenza di Shine Dalgarnoribosome binding site (RBS) 3) Efficienza di traduzione 4) Localizazzione della proteina (secreta?) 5) Numero di copie del plasmide Plasmide vs. cromosoma Tante vs. 1 6) Organismo ospite 7) Problemi legati alla proteina (vedi oltre)
34 Esprimere proteine in un sistema eterologo non è sempre banale! Nessuna strategia funzionerà in tutti i casi Ogni proteina è unica Può essere necessario apportare più modifiche alle strategie standard
35 Gene espresso a partire da un promotore forte e regolabile La trascrizione è spesso il punto di controllo più importante per la regolazione dell espressione genica La trascrizione è controllata dal promotore I promotori devono essere Forti Possibilmente Regolabili
36 Promotori forti e regolabili Forte Alta affinità per l RNA polimerasi Legame forte - trascritto ad alta frequenza Legame debole - RNA Pol si stacca no trascription Regolabile L espressione può essere controllata dal ricercatore, tramite induttori e repressore
37 Alcuni promotori usati frequentemente lac trp tac p L gene 10 del fago T7
38 Promotore lac Operone lac Regolazione negativa Il repressore di lac si lega alla sequenza operatore Induttore si lega al repressore, rendendolo non funzionale Induttore = analogo del lattosio, IPTG
39 Promotori Leaky Alcuni promotori (lac, ad esempio) non riescono ad essere controllati in modo molto stringente. Si ha quindi sempre un basso livello di espressione.
40 Migliorare la Traduzione I promotori forti producono grandi quantità di mrna E però necessario che la traduzione del messaggero sia efficiente DNA RNA Protein
41 La sequenza di Shine e Dalgarno mrna 5 AGGAGG AUG 3 UCCUCC 3 16S rrna 5 small ribosomal subunit
42 Migliorare la traduzione Uso dei codoni Molti codoni per lo stesso aminoacido Alcuni sono usati di rado poco trna corrispondente Differenti organismi usano il codice in modo diverso Obiettivo: ottimizzare I codoni
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44 Stabilizzare il messaggero
45 Problemi legati alla proteina 1) Incapacità della proteina di assumere la corretta struttura 3D nell ambiente batterico 2) Assenza di cofattori essenziali 3) Mancata modificazione post-traduzionale 4) Degradazione proteolitica 5) Tossicità della proteina
46 Esporto della Proteina La stabilità della proteina può aumentare (meno proteasi, differenze nella formazione dei legami disolfuro) La proteina può essere isolata più facilmente
47 Esporto della Proteina Cosa è richiesto per l esporto? Peptide segnale Questo va aggiunto all estremità NH 2 della proteina (5 del gene) NH 2 signal Proteina di interesse COOH Deve essere in frame!
48 Esporto nei batteri Gram- Membrana esterna Membrana interna Spazio periplasmatico Le proteine generalmente rimangono intrappolate nello spazio periplamatico
49 Stabilità della proteina La vita media è variabile Da pochi minuti a >24 ore Fattori che influenzano la stabilità NH 2 terminale Sequenze PEST
50 Stabilità della proteina Sequenze PEST Interne alla sequenza aminoacidica Aumentano la suscettibilità alla proteolisi P = Pro E = Glu S = Ser T = Thr
51
52 Proteine di fusione Ci sono diversi problemi con le proteine, tra cui: Degradazione Purificazione
53 Proteine di fusione La degradazione porta a bassi livelli di espressione e difficoltà nel purificare la proteina. Una soluzione frequente: Attaccare la proteina a un partner proteico stabile. Può essere utile rimuovere il Tag
54 Proteine di fusione Servono proteasi per separare le due proteine Se ne conoscono alcune che riconoscono una sequenza altamente specifica Tale sequenza va inserita tra la proteina di interesse e il partner proteico protease cleavage fusion partner gene di interesse
55 Proteine di fusione L uso primario è per la purificazione In questo caso si usano specifici tags per facilitare la purificazione, possibilmente tramite un unico passaggio cromatografico (ad es. mediante cromatografia per affinità)
56 Proteine con His-tag
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58 Ulteriori strategie per favorire il folding delle proteine Co-espressione di Chaperoni Modificazione dei ceppi batterici (knockout di geni per proteasi, etc..) Modificazioni mirate delle proteine..
59 Inclusion Bodies Gli inclusion bodies possono essere purificati facilmente Refolding in vitro, Denaturazionerinaturazione
60 Sintesi in sistemi cell-free E possibile far sintetizzare proteine in estratti cellulari di origine procariotica (E. coli) od eucariotica (germe di grano) Nei casi più favorevoli consente di ottenere un alta efficienza di produzione in un volume molto piccolo, che facilita la successiva purificazione della proteina Nessun problema di tossicità Consente l incorporazione di aminoacidi marcati per studi metabolici o strutturali Possono essere inseriti aminoacidi non naturali Più semplice controllare l azione di proteasi o modulare il folding Può essere adattato a produrre proteine con o senza modificazioni post-traduzionali
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