Modificazione selettiva o casuale di una proteina allo scopo di modificare la struttura o la funzione

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1 Modificazione selettiva o casuale di una proteina allo scopo di modificare la struttura o la funzione

2 PRODURRE CARATTERIZZARE MODULARE ATTIVITA O INTRODURRE NUOVE FUNZIONI Ingegneria proteica PROGETTARE

3 APPLICAZIONI INDUSTRIA BIOMEDICINA MOLECOLE STABILI ED ATTIVE IN CONDIZIONI PARTICOLARI DI PH, TEMPERATURA E CONDIZIONI DI REAZIONE MOLECOLE STABILI ED ATTIVE IN CONDIZIONI FISIOLOGICHE, IN PRESENZA DI ENZIMI ED INIBITORI, AD EMIVITA LUNGA E DA VEICOLARE EFFICACEMENTE AI BERSAGLI CELLULARI

4 IN UN ESPERIMENTO DI INGEGNERIA PROTEICA SI POSSONO MODULARE MOLTE PROPRIETA DI UNA MOLECOLA RESIDUI IDROFOBICI ESPOSTI SOLUBILITA Proprieta generali LOOPS RESISTENZA PROTEOLISI SITI DI LEGAME AFFINITA SPECIFICITA TERMINALI FUSIONI CON PEPTIDI O PEG NUCLEO STABILITA CONTROLLO CONFORMAZIONALE EPITOPI IMMUNOGENICITA ALTRI PARAMETRI BIOLOGICI E CLINICI DESIGN RAZIONALE EVOLUZIONE GUIDATA

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6 L INGEGNERIA PROTEICA RICHIEDE UN APPROCCIO MULTIDISCIPLINARE Bioinformatica Genomica strutturale Genomica funzionale Biochimica strutturale (NMR, X-ray, Massa) IDENTIFICAZIONE MOLECOLA RACCOLTA INFORMAZIONI Ingegneria genetica Ingegneria proteica Ingegneria metabolica BIOMOLECOLE ATTIVE

7 DNA RICOMBINANTE ED INGEGNERIA PROTEICA Di cosa ho bisogno per esprimere una proteina? lamb UN GENE promotore lamb terminatore UNA UNITA DI TRASCRIZIONE RBS lamb STOP UNA UNITA DI TRADUZIONE

8 Alcuni punti importanti da rispettare: Qualità del prodotto proteico e Resa del sistema di produzione. Rapporto qualità/costo vantaggioso. Assenza di agenti infettivi per l uomo. FASI SPERIMENTALI PRINCIPALI 1: Identificazione, isolamento e clonaggio gene codificante per proteina bersaglio 2: espressione in sistema eterologo 3: purificazione e caratterizzazione proteina wild type 4: progettazione, produzione e caratterizzazione versioni mutate

9 FASE 1: isolamento gene codificante - INFORMAZIONI SULLA PROTEINA DI INTERESSE -INFORMAZIONI SU PROTEINE OMOLOGHE (STRUTTURA/FUNZIONE) -ANTICORPO SPECIFICO - ISOLAMENTO (SINTESI) SEQUENZA CODIFICANTE - ANALISI DI COLLEZIONI DI MOLECOLE (GENI O PRODOTTI) - REAZIONE A CATENA DI POLIMERASI TERMOSTABILI (PCR) - SINTESI CHIMICA EX NOVO -DETERMINAZIONE SEQUENZA NUCLEOTIDICA E CLONAGGIO Alcuni casi difficili proteina e/o mrna poco abbondante proteina oligomerica cofattori e/o gruppi prostetici

10 L espressione eterologa di una proteina segue le regole della cellula ospite eucarioti procarioti Controllo trascrizionale Controllo traduzionale Controllo post-traduzionale Stabilità mrna Modificazioni Velocità di traduzione Ribosoma mrna Proteina post-traduzionali Compartimenti (periplasma procarioti) DNA RNA polimerasi

11 -Scelta coppia sistema di espressione/ospite dipende dalle caratteristiche molecolari della proteina di interesse ( importanza di qualità e resa). -Procarioti o eucarioti? Differenze (vantaggi e svantaggi): - Compartimentalizzazione - Uso del codice genetico (trna) - Stabilità cloni ricombinanti - Modificazioni post-traduzionali - Resa in biomassa - Purificazione - Crescite terreni modificati (isotopi o metalli pesanti) - Costo - fattibilità su piccola scala e larga scala

12 (a) Sistemi di espressione procariotici (Rese: µg-mg/litro coltura) -Plasmidi e virus batterici - Ospite più utilizzato: Escherichia coli

13 Parametri principali nei procarioti DNA RNA Proteina 1. Caratteristiche vettore 2. Efficienza trascrizionale 2. Efficienza traduzionale 3. Stabilità della proteina

14 VETTORE DI ESPRESSIONE PROCARIOTICO NUMERO DI COPIE PER CELLULA: -Derivati di pbr322: copie per cellula - Derivati di puc: copie per cellula Il numero di copie influenza: - positivamente la stabilità del plasmide, cioè la sua presenza nelle generazioni successive. -negativamente la velocità di crescita del ceppo ospite: crescono meglio le cellule con meno copie. I PLASMIDI AD ALTO NUMERO DI COPIE NON SEMBRANO CONFERIRE UN VANTAGGIO PER LA PRODUZIONE DELLA PROTEINA SELEZIONE: Ampicillina, tetraciclina, kanamicina Sconsigliata ampicillina perché: - perdita di resistenza - potenzialmente allergenica

15 Fase stazionaria Morte cellulare Densità cellulare Fase logaritmica Fase lag Tempo di crescita PROMOTORE: COSTITUTIVO O INDUCIBILE??

16 PROMOTORE (costitutivo o inducibile): -costo dell induttore -efficacia dell induzione e della repressione in condizioni di noninduzione per bilanciare produzione di biomassa e resa in proteina -forza del promotore e resa in proteina (solubile) Promotore Induzione altro lac IPTG lattosio tac IPTG trc IPTG T7 IPTG trp arabad Trp mancanza L-Arabinose Analogo acido indolacetico PL(l) termica Espr.basale/induzione di hsp PR(l) termica lac(ts) termica P SPA Costitutivo

17 Il sistema di espressione pet E.coli lambda lisogeno (λde3)

18 SEGNALI RELATIVI ALLA TRADUZIONE: -SEQUENZA SHINE-DALGARNO OTTIMALE 5 -UAAGGAGG-3 - POSIZIONE: 4-8 NUCLEOTIDI DA AUG (rimozione N- terminale?) - SECONDO CODONE: di solito ricco in A nei geni molto espressi. AAA(lys) è frequente (13%). - 5 RICCO IN GC DIMINUISCE EFFICIENZA TRADUZIONE

19 CODON USAGE USO DI CODONI RARI PUO PORTARE A PROBLEMI: STABILITA mrna DIMINUITA TERMINAZIONE PREMATURA DI TRASCRIZIONE/TRADUZIONE FRAMESHIFT, DELEZIONI, INCORPORAZIONI ERRATE INIBIZIONE DELLA CRESCITA CELLULARE CODONI USATI CON FREQUENZA BASSA NELLE VARIE SPECIE (trna meno abbondanti)

20 FREQUENZA DI USO DEI CODONI RARI DI E.coli IN ALTRE SPECIE ESPRIMERE IN E.COLI UN GENE RICCO IN CODONI RARI ABBASSA LA EFFICIENZA DI TRADUZIONE

21 QUALI SOLUZIONI? -Geni mutati o costruiti (sintetici) BL21 (DE3) CodonPlus-RIL BL21 (DE3) CodonPlus-RP Rosetta or Rosetta (DE3) AGG/AGA (arginine), AUA (isoleucine) and CUA (leucine) AGG/AGA (arginine) and CCC (proline) AGG/AGA (arginine), CGG (arginine), AUA (isoleucine) CUA (leucine), CCC (proline), and GGA (glycine) Stratagene Stratagene Novagen CEPPI DI E.COLI CHE ESPRIMONO trna RARI CEPPI CHE ESPRIMONO MENO PROTEASI

22 MANCATA O BASSA ESPRESSIONE LA PROTEINA VIENE ESPRESSA IN CONDIZIONI NON DI INDUZIONE * ESPRESSIONE COSTITUIVA DI UN REPRESSORE lac repressor(the laci or laciq) PER PROMOTORE LAC * USARE UN PROMOTORE STRINGENTE, e.g. the arabinose promoter (PBAD). * USARE PLASMIDE A BASSO NUMERO DI COPIE * VETTORI PET: USARE CEPPI CON T7 Lisozima from a compatible plyss or plyse plasmid (Novagen). IL LISOZIMA SI LEGA ALLA POLIMERASI ED INATTIVA L ENZIMA IN ASSENZA DI INDUTTORE AGGIUNGERE 1% glucosio PER REPRIMERE IL PROMOTORE lac INDOTTO DA LATTOSIO PRESENTE NEI MEZZI DI COLTURA MASSIMI ( LB, 2xYT). LA STABILITA DEL PLASMIDE E BASSA *AUMENTARE LA CONCENTRAZIONE DELL ANTIBIOTICO DI SELEZIONE LA PROTEINA E TOSSICA *ESPRESSIONE NEL PERIPLASMA O IN CORPI INCLUSI

23 LA PROTEINA RICOMBINANTE DEVE ESSERE SOLUBILE SPESSO SI HA LA FORMAZIONE DI CORPI INCLUSI (aggregati proteici insolubili in acqua)

24 STRATEGIE PER AUMENTARE LA SOLUBILITA RIDURRE LA VELOCITA DI TRADUZIONE * ABBASSARE LA TEMPERATURA DI CRESCITA * USARE UN PROMOTORE PIU DEBOLE * USARE UN PLASMIDE A BASSO NUMERO DI COPIE * ABBASSARE LA CONCENTRAZIONE DI INDUTTORE CAMBIARE LE CONDIZIONI DI CRESCITA * AGGIUNGERE COFATTORI NECESSARI PER FOLDING * CONTROLLARE LE VARIAZIONI DI PH * AGGIUNGERE GLUCOSIO 1% PER REPRIMERE LA ESPRESSIONE DEL PROMOTORE LAC INDOTTO DA LATTOSIO PRESENTE NEI TERRENI MASSIMI ( LB, 2xYT). * AGGIUNGERE ETANOLO, TIOLI A BASSO PESO MOLECOLARE, NaCl.

25 CO- ESPRIMERE CON IL GENE DI INTERESSE CON: ALTRE SUBUNITA DELL OLIGOMERO CHAPERONES MOLECOLARI * GroES-GroEL * DnaK-DnaJ-GrpE * ClpB FOLDASI PEPTIDIL -PROLIL CIS/TRANS ISOMERASI (PPI's) DISULFURO-OSSIDOREDUTTASI (DsbA) DISULFURO ISOMERASI (DsbC) PROTEINA DISOLFURO ISOMERASI (PDI) EUCARIOTICA- CATALIZZA SIA OSSIDAZIONE DELLE CISTEINE CHE DSI: HA ANCHE ATTIVITA CHAPERONE.

26 ESPRIMERE LA PROTEINA NEL PERIPLASMA MEDIANTE AGGIUNTA DI UNA SEQUENZA SEGNALE (pelb/ompt) L AMBIENTE E PIU OSSIDANTE CHE NEL CITOPLASMA SONO PRESENTI DsbA E DsbC ATTIVITA PROTEOLITICA RIDOTTA PERMETTE ACCUMULO DI PROTEINE TOSSICHE NEL CITOPLASMA N-TERMINALE VERO Svantaggi: livelli di espressioni minori USARE CELLULE OSPITI SPECIALI CON CITOPLASMA OSSIDANTE CEPPI COMMERCIALI * AD494, mutato nella tioredossina reduttasi (trxb). * Origami, mutato nella tioredossina reduttasi (trxb) e glutatione reduttasi (gor).

27 PRODURRE UNA PROTEINA DI FUSIONE CON PROTEINA SOLUBILE MALTOSE-BINDING PROTEIN UBIQUITIN DsbA TIOREDOSSINA IgG-BINDING DOMAIN SVANTAGGI: RECUPERO DELLA PROTEINA MEDIANTE PROTEOLISI ESPRIMERE FRAMMENTI SOLUBILI DELLA PROTEINA

28 IN ALCUNI CASI LA ESPRESSIONE NEI CORPI INCLUSI PUO ESSERE UN VANTAGGIO: LA PROTEINA RICOMBINANTE E FINO AL 50% DELLE PROTEINE TOTALI E PROTETTA DALLA DEGRADAZIONE NON PUO ESSERE TOSSICA PER LA CELLULA LA PROTEINA NATIVA DEVE ESSERE RECUPERATA MEDIANTE DENATURAZIONE IN VITRO E REFOLDING *ISOLAMENTO DEI CORPI INCLUSI. SHOCK OSMOTICO E CENTRIFUGAZIONE *DENATURAZIONE IN PRESENZA DI AGENTI DENATURANTI COME GUANIDINA O UREA O CONDIZIONI RIDUCENTI (e.g. DTT). *REFOLDING DELLA PROTEINA MEDIANTE LENTA RIMOZIONE DEL DENATURANTE CON DIALISI, DILUIZIONE O CROMATOGRAFIA (IN PRESENZA DI AGENTI RIDUCENTI )