07/01/2015. Induzione di un promotore: un modo di superare problemi di tossicità. Plac, il promotore inducibile per eccellenza
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1 Induzione di un promotore: un modo di superare problemi di tossicità Induzione Crescita non inibita Crescita rallentata Crescita bloccata e/o lisi cellulare Crescita di un ceppo che esprime una proteina tossica da un promotore costitutivo Plac, il promotore inducibile per eccellenza A B (LacI) (LacI) (naturale: allolattosio; sintetico: IPTG) IPTG P lac LacI P tac P trc Derivati di P lac * più forti *) sostituzioni nella seq. -10 o promotori ibridi 1
2 Phage T7 Promotore dipendente da RNA polimerasi di batteriofago T7 (T7-RNA pol) T7-RNA pol: singolo polipeptide estremamente efficiente (molto più dell RNA polimerasi batterica) 2
3 Un esempio di livelli di espressione e stringenza di induzione con il sistema pt7 IPTG - + (0.5mM) Ara C AraC -Ara +Ara represses PBAD induces PBAD P BAD AraC RNA pol P BAD 3
4 I promotori inducibili sono un metodo di espressione dotato di estrema flessibilità Sistemi altamente utilizzati: plac e derivati, T7RNA pol, promotore pbad Promotori attivati da particolari condizioni ambientali: Temperatura Assenza di ossigeno (anaerobiosi)... L uso di promotori inducibili può utilizzare i fattori sigma alternativi della RNApol Fattore s Gene Funzione s D (s 70 ) rpod Fattore s principale (housekeeping) s S rpos Adattamento a fase stazionaria s N (s 54 ) rpon Metabolismo/carenza di azoto/carbonio s H rpoh Shock termico s E rpoe Shock termico estremo s F flai Flagello e strutture extracellulari FecI (s I ) feci Assimilazione ferro Tre criteri fondamentali per la produzione di proteine eterologhe Espressione ad alto livello, affidabile e stabile del gene di interesse (livello DNA/RNA) La proteina prodotta deve mantenere la propria attività biologica in E. coli (livello struttura/ conformazione della proteina) La proteina deve essere facilmente re-isolata dal rimanente materiale cellulare 4
5 Fattori post-trascrizionali che possono influenzare l espressione Stabilità del mrna: l utilizzo di alcuni mutanti in alcune RNasi (ad es. le esonucleasi RNasi II, PNPasi o la endonucleasi RNasiE) può far aumentare la stabilità dei trascritti Differenze nell uso dei codoni tra procarioti ed eucarioti può avere un impatto sulla produzione di proteine eterologhe in E. coli (ad es. i codoni arginina AGA e AGG sono molto rari in E. coli, ma molto comuni negli eucarioti). Possibile soluzione: cambiare questi codoni nel codone CGC, preferito da E. coli, oppure co-esprimere il gene per il trna Arg(AGG/AGA) Stabilità delle proteine: uso di mutanti defettivi per proteasi Codon usage in Escherichia coli UUU 22.3 (89985) UCU 10.8( 43728) UAU 18.0( 72440) UGU 5.3( 21431) UUC 15.8 (63684) UCC 9.4( 37738) UAC 12.1( 48758) UGC 6.0( 24208) UUA 14.5 (58346) UCA 9.7( 38904) UAA 2.0( 7907) UGA 1.0( 4206) UUG 12.7 (51140) UCG 8.5( 34448) UAG 0.3( 1149) UGG 13.9( 55921) CUU 12.3 (49607) CCU 7.8( 31303) CAU 12.5( 50496) CGU 19.3( 77801) CUC 10.1 (40777) CCC 5.5( 22191) CAC 9.0( 36460) CGC 18.8( 75701) CUA 4.4 (17639)* CCA 8.6( 34744) CAA 14.3( 57536) CGA 4.0( 16167) CUG 46.9 (189204)* CCG 19.8( 79918) CAG 28.4(114518) CGG 6.4( 25766) AUU 29.5 (118960) ACU 10.9( 43846) AAU 21.8( 87884) AGU 10.5( 42329) AUC 23.0 (92826) ACC 21.7( 87349) AAC 21.4( 86073) AGC 15.0( 60556) AUA 7.8 (31326) ACA 10.3( 41555) AAA 35.1(141491) AGA 4.2( 16943) AUG 26.0 (104652) ACG 13.8( 55504) AAG 12.9( 51895) AGG 2.5( 10033) GUU 20.0 (80574) GCU 17.4( 70044) GAU 32.8(132131) GGU 25.2(101534) GUC 14.2 (57354) GCC 24.0( 96703) GAC 19.1( 76987) GGC 26.2(105620) GUA 11.8 (47387) GCA 21.5( 86585) GAA 38.1(153370) GGA 10.4( 41743) GUG 23.7 (95503) GCG 28.6(115274) GAG 18.8( 75654) GGG 11.6( 46760) *)= Entrambi i codoni corrispondono alla leucina Una possibile alternativa: la sintesi di geni su ordinazione Costo: /bp 5
6 Step 2: dalla trascrizione alla proteina Gli enzimi sono attivi solo se ripiegati nella conformazione corretta (folding) Nel processo di folding hanno luogo modificazioni post-traduzionali: es. Folding ossidativo 6
7 Soltanto il corretto appaiamento di residui di cisteina porta alla conformazione biologicamente attiva Nel processo di folding hanno luogo modificazioni post-traduzionali: es. Glicosilazione E. coli: nel citoplasma la formazione di ponti disolfuro è estremamente sfavorita Il citoplasma ha un potenziale redox molto basso (ambiente riducente) Nel citoplasma non ci sono enzimi che sono in grado di ossidare i tioli (-SH) 7
8 Foldasi e chaperonine Foldasi: 1) prolil cis-trans isomerasi (es. ppia) 2) disolfuro isomerasi (eucariotiche) Chaperonine Gene name Gene length SWISS- PROT Locatio n (kb) Description dnaj 1131 P dnak 1917 P Chaperone with DnaK; DNA chain elongation; stress-related DNA biosynthesis, responsive to heat shock HSP-70-type molecular chaperone, with DnaJ; stress-related heat-shock DNA biosynthesis, ATP-regulated binding and release of polypeptide substrates ecpd 741 P Possible pilin chaperone fimc 726 P Biosynthesis of fimbriae; periplasmic chaperone for type 1 fimbriae grol 1647 P Chaperone for assembly of enzyme complexes; phage morphogenesis; GroESL large subunit gros 294 P Chaperone for assembly of enzyme complexes; phage morphogenesis; GroESL small subunit htpg 1875 P Heat shock protein C62.5; chaperone ibpa 414 P Chaperone, heat-inducible protein of HSP20 family ibpb 429 P Chaperone, heat-inducible protein of HSP20 family narj 711 P Nitrate reductase delta-subunit; chaperone secb 468 P Protein export; chaperone SecB tig 1299 P Trigger factor; chaperone 8
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