- PROGETTO DI LABORATORIO - PCR

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1 - PROGETTO DI LABORATORIO - PCR 1

2 DIFFERENZIAMENTO DEI SUBSET CELLULARI Th1, Th2, Th17 e Treg Controllo/eradicazione di tumori e patogeni intracellulari 2

3 CITOCHINE DELLA FAMIGLIA DI IL-12 3

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6 PROGETTO DI LABORATORIO: CLONAGGIO ED ESPRESSIONE DEL COSTRUTTO GENICO A SINGOLA CATENA IL-12IgG 1. Clonaggio della citochina eterodimerica a singola catena IL-12IgG in un vettore d espressione contenente la sequenza tag IgG 3 (amplificazione delle due subunità p40 e p35, codificate da geni distinti, con inserimento del linker (G 4 S) 3 ). 2. Colture cellulari e produzione di trasfettanti esprimenti il costrutto genico clonato al punto Verifica dell espressione del costrutto genico per analisi della proteina di fusione IL-12Ig secreta nel sopranatante. 4. Verifica dell attività biologica della proteina di fusione IL-12Ig in vitro per stimolazione di spenociti attivati con Concanavalina A (test ELISA anti- IFN- ). 6

7 MODELLO DI COSTRUTTO GENICO PER CITOCHINE ETERODIMERICHE A SINGOLA CATENA CON TAG IgG 3 subunità chain comprende: - START - signal peptide - coding sequence dell intera proteina non comprende: - STOP linker (Gly 4 Ser) 3 subunità chain comprende: - coding sequence della proteina matura non comprende: - START - signal peptide - STOP Ig G 3 tag comprende: - coda dell Fc dell IgG 3 - STOP non comprende: - signal peptide START IL-12Ig:p40-L-p35-Ig STOP IL-23Ig: p40-l-p19-ig IL-27Ig: EBI3-L-p28-Ig IL-35Ig: EBI3-L-p35-Ig 7

8 Restriction map of mscil-12ig.xdna Showing restriction enzymes cutting maximum 1 time [using Serial Cloner Internal RE list as a Restriction Enzyme Library] ### NlaIII CviAII CviJI HaeIII >MnlI MscI RsaI HaeI Csp6I Hpy188I EaeI >BpmI Acc65I TseI >BseMII StyD4I NlaIII AluI NlaIV >BbvI >BspCNI PflMI ScrFI >CdiI FatI FatI CviJI KpnI BthCI DdeI CviJI >BccI PspGI >BccI CviAII <RleAI >Eco57MI BanI Fnu4HI >Hin4I >MnlI AluI BslI BstNI XcmI >BsmAI MslI XcmI <AceIII ggt acc tcg cag caa agc aag atg tgt cct cag aag cta acc atc tcc tgg ttt gcc atc gtt ttg ctg gtg tct cca ctc atg gcc atg tgg gag ctg g < 100 G T S Q Q S K M C P Q K L T I S W F A I V L L V S P L M A M W E L E cca tgg agc gtc gtt tcg ttc tac aca gga gtc ttc gat tgg tag agg acc aaa cgg tag caa aac gac cac aga ggt gag tac cgg tac acc ctc gac c UnbI Sau96I VpaK11AI AvaII StyD4I ScrFI ScrFI PspGI >Sth132I PspGI <SspD5I <PleI <BscAI >BpmI >MboII <HphI Psp03I Hpy8I <MlyI <SfaNI >Eco57MI Hpy8I <HphI Tsp45I >MboII <CjeI BstNI TaiI <MnlI HinfI <CdiI BstNI >TspRI >MnlI MaeIII >AcuI <CjePI StyD4I HpyCH4IV <CjePI >BsrI Hpy188III BsaJI HpyCH4III <SspD5I >Eco57MI >Bsp24I FmuI ag aaa gac gtt tat gtt gta gag gtg gac tgg act ccc gat gcc cct gga gaa aca gtg aac ctc acc tgt gac acg cct gaa gaa gat gac atc acc tg < 200 K D V Y V V E V D W T P D A P G E T V N L T C D T P E E D D I T W tc ttt ctg caa ata caa cat ctc cac ctg acc tga ggg cta cgg gga cct ctt tgt cac ttg gag tgg aca ctg tgc gga ctt ctt cta ctg tag tgg ac >MlyI NlaIII CviJI FatI HaeIII <Hin4I MscI Hpy188I >HaeIV <BscAI Hpy8I >BspCNI AhdI >PleI <SfaNI <BsrI >AarI >BseMII >Hin4I HpyCH4III BfaI EaeI Csp6I DdeI <BsmAI HinfI Hpy188III >TspRI Hpy188III HaeI RsaI <MnlI >MnlI BstXI CviAII CviJI <SimI >BccI XbaI Cac8I TatI >BspMI >CstMI g acc tca gac cag aga cat gga gtc ata ggc tct gga aag acc ctg acc atc act gtc aaa gag ttt cta gat gct ggc cag tac acc tgc cac aaa gga < 300 T S D Q R H G V I G S G K T L T I T V K E F L D A G Q Y T C H K G c tgg agt ctg gtc tct gta cct cag tat ccg aga cct ttc tgg gac tgg tag tga cag ttt ctc aaa gat cta cga ccg gtc atg tgg acg gtg ttt cct

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11 ScrFI BsaJI >CjePI >Hin4I <Hin4I >HaeIV <AlwI ChaI Hpy188I BstKTI Sau96I BsaWI >AlwI Psp03I Hpy188III BamHI Psp03I UnbI BstKTI BstYI UnbI FmuI MboI <AciI StyD4I Sau96I BstNI VpaK11AI HpaII TauI NlaIV >BsmAI >BspMI HpyCH4V <AlwI <Sth132I BthCI MboI AlwNI FmuI StyD4I NlaIII PstI AvaII BspEI Nli3877I <AciI DpnI >SimI PflMI AvaII PspGI CviAII SfcI NlaIV DpnI <AciI AvaI <Sth132I >EciI BstNI BslI VpaK11AI FatI SbfI >SimI ChaI <MnlI CviJI <AciI >SimI Fnu4HI PspGI <BsrI Hpy188III ScrFI ca tgt gtt ccc tgc agg gtc cga tcc gga ggc ggt ggc tcg ggc ggt ggt ggg tcg ggt ggc ggc gga tcc agg gtc att cca gtc tct gga cct gcc ag < 1100 C V P C R V R S G G G G S G G G G S G G G G S R V I P V S G P A R gt aca caa ggg acg tcc cag gct agg cct ccg cca ccg agc ccg cca cca ccc agc cca ccg ccg cct agg tcc cag taa ggt cag aga cct gga cgg tc CviJI >MboII >BbsI HaeIII >Bbr7I >SspD5I >GdiII >AcuI >CdiI >Sth132I >MboII >HphI EaeI <BtsI >Bbr7I <BsrI >AcuI XcmI CviAII >BceAI >TspRI >MboII TaqI CviJI Hpy188III >Eco57MI FatI >Bbr7I HpyCH4V >BbsI EsaBC3I DdeI <BsmFI >BspMI >BbsI NlaIII >BcefI <BsgI >Eco57MI ClaI g tgt ctt agc cag tcc cga aac ctg ctg aag acc aca gat gac atg gtg aag acg gcc aga gaa aaa ctg aaa cat tat tcc tgc act gct gaa gac atc < 1200 C L S Q S R N L L K T T D D M V K T A R E K L K H Y S C T A E D I c aca gaa tcg gtc agg gct ttg gac gac ttc tgg tgt cta ctg tac cac ttc tgc cgg tct ctt ttt gac ttt gta ata agg acg tga cga ctt ctg tag >TspDTI NlaIII UnbI CviAII FmuI FatI AvaII BspHI VpaK11AI Hpy188III Sau96I CviJI DpnI >Bbr7I Psp03I PspGI MboI >MboII >BsmFI >MboII ScrFI BstKTI NlaIV >BbsI >BsrI BstNI <MboII ChaI >BbsI <Sth132I >Bbr7I Hpy8I >TspRI StyD4I BfaI <BsmAI gat cat gaa gac atc aca cgg gac caa acc agc aca ttg aag acc tgt tta cca ctg gaa cta cac aag aac gag agt tgc ctg gct act aga gag act t < 1300 D H E D I T R D Q T S T L K T C L P L E L H K N E S C L A T R E T S cta gta ctt ctg tag tgt gcc ctg gtt tgg tcg tgt aac ttc tgg aca aat ggt gac ctt gat gtg ttc ttg ctc tca acg gac cga tga tct ctc tga a

12 Cac8I TaiI <BbvI HpyCH4IV Fnu4HI BsaHI BthCI AatII CviJI >MboII AluI >BbsI StyI RsaI <AceIII >Bbr7I BsaJI >BscAI Csp6I <MnlI TseI >RleAI ZraI <SimI MwoI >SfaNI <MnlI >MboII >CjeI ct tcc aca aca aga ggg agc tgc ctg ccc cca cag aag acg tct ttg atg atg acc ctg tgc ctt ggt agc atc tat gag gac ttg aag atg tac cag ac < 1400 S T T R G S C L P P Q K T S L M M T L C L G S I Y E D L K M Y Q T ga agg tgt tgt tct ccc tcg acg gac ggg ggt gtc ttc tgc aga aac tac tac tgg gac acg gaa cca tcg tag ata ctc ctg aac ttc tac atg gtc tg >BccI MwoI CviJI MslI >CdiI HaeIII CviAII >BccI <SfaNI HaeI TfiI FatI HaeIII CviJI >BsmAI PspGI >BbvI HinfI MboI NlaIII CviJI <CdiI >Hin4I BstNI Fnu4HI Hpy188I DpnI XbaI NspI MscI TaqI AluI HpyCH4V ScrFI TseI <Eco57MI ChaI Hpy188III SphI HaeI EsaBC3I <BscAI Hpy188I StyD4I BthCI <AcuI >BccI BstKTI BfaI Cac8I EaeI ClaI <AceIII AlwNI a gag ttc cag gcc atc aac gca gca ctt cag aat cac aac cat cag cag atc att cta gac aag ggc atg ctg gtg gcc atc gat gag ctg atg cag tct < 1500 E F Q A I N A A L Q N H N H Q Q I I L D K G M L V A I D E L M Q S t ctc aag gtc cgg tag ttg cgt cgt gaa gtc tta gtg ttg gta gtc gtc tag taa gat ctg ttc ccg tac gac cac cgg tag cta ctc gac tac gtc aga <StsI <FokI HinfI <BstF5I HinfI <PleI >MnlI AluI >BscAI <Eco57MI TfiI <MlyI HinP1I BslI CviJI >SfaNI <AcuI <CjePI <BsmAI HhaI <CjeI <RleAI <SimI >TspDTI HpyCH4V >HpyAV ctg aat cat aat ggc gag act ctg cgc cag aaa cct cct gtg gga gaa gca gac cct tac aga gtg aaa atg aag ctc tgc atc ctg ctt cac gcc ttc a < 1600 L N H N G E T L R Q K P P V G E A D P Y R V K M K L C I L L H A F S gac tta gta tta ccg ctc tga gac gcg gtc ttt gga gga cac cct ctt cgt ctg gga atg tct cac ttt tac ttc gag acg tag gac gaa gtg cgg aag t CviJI AluI Bsp1286I BsiHKAI Hpy99I SacI <HgaI <Hin4I BanII Hpy188III SelI >BccI >Hin4I EcoICRI DpnI ScrFI BstUI BslI >HaeIV DdeI >AciI ChaI EsaBC3I Csp6I BstNI >AciI Tsp45I <BccI Hpy188I <EciI BstKTI TaqI <BmrI StyD4I >Sth132I MaeIII >HphI MwoI <BspCNI MboI HinfI BfaI CviJI RsaI PspGI >FauI Hpy188III >SspD5I CviJI <BseMII BclI TfiI CviJI >CjeI <BsrI BsaJI gc acc cgc gtc gtg acc atc aac agg gtg atg ggc tat ctg agc tcc gcc ttg atc aag aga atc gag cct aga ata ccc aag ccc agt acc ccc cca gg < 1700 T R V V T I N R V M G Y L S S A L I K R I E P R I P K P S T P P G cg tgg gcg cag cac tgg tag ttg tcc cac tac ccg ata gac tcg agg cgg aac tag ttc tct tag ctc gga tct tat ggg ttc ggg tca tgg ggg ggt cc

13 <StsI <FokI >BccI >CjePI >Hin4I <Hin4I >HaeIV MboI AhdI BstKTI AvaII DpnI MaeIII FmuI <BscAI FatI NlaIII ScrFI Sau96I <MboII >FokI CviAII CviAII BstNI UnbI <TspGWI >BstF5I NlaIII FatI PspGI VpaK11AI <Bbr7I StyI <SfaNI BspHI <TspDTI StyD4I Psp03I <BbsI <MboII BsaJI HpyCH4V ChaI BsaJI BsaAI <MboII SexAI Hpy8I <BstF5I <TspDTI CviJI >StsI Hpy188III StyI MaeIII t tct tca tgc cca cct ggt aac atc ttg ggt gga cca tcc gtc ttc atc ttc ccc cca aag ccc aag gat gca ctc atg atc tcc cta acc ccc aag gtt < 1800 S S C P P G N I L G G P S V F I F P P K P K D A L M I S L T P K V a aga agt acg ggt gga cca ttg tag aac cca cct ggt agg cag aag tag aag ggg ggt ttc ggg ttc cta cgt gag tac tag agg gat tgg ggg ttc caa AluI CviJI DrdI MspA1I ScrFI >BbvI >FokI PvuII RsaI PspGI BthCI TaiI >FokI >StsI FatI CviJI Csp6I BstNI TseI AflIII >BstF5I >BstF5I NlaIII Hpy8I CviJI >HgaI >Sth132I HpyCH4IV >StsI <MnlI <SimI CviAII Hpy8I TatI <CjeI StyD4I Fnu4HI acg tgt gtg gtg gtg gat gtg agc gag gat gac cca gat gtc cat gtc agc tgg ttt gtg gac aac aaa gaa gta cac aca gcc tgg acg cag ccc cgt g < 1900 T C V V V D V S E D D P D V H V S W F V D N K E V H T A W T Q P R E tgc aca cac cac cac cta cac tcg ctc cta ctg ggt cta cag gta cag tcg acc aaa cac ctg ttg ttt ctt cat gtg tgt cgg acc tgc gtc ggg gca c Csp6I DdeI BslI StyD4I >BspCNI >HpyAV >MnlI <BstF5I ScrFI >BstF5I >BseMII Csp6I Bsp1286I <StsI PspGI >FokI HincII CviJI RsaI RsaI Bme1580I <FokI BstNI >StsI Hpy8I AluI TatI HpyCH4III Hpy188I >TspRI >BccI <CjeI >BsrI <MnlI >CstMI HpyCH4V aa gct cag tac aac agt acc ttc cga gtg gtc agt gcc ctc ccc atc cag cac cag gac tgg atg agg ggc aag gag ttc aaa tgc aag gtc aac aac aa < 2000 A Q Y N S T F R V V S A L P I Q H Q D W M R G K E F K C K V N N K tt cga gtc atg ttg tca tgg aag gct cac cag tca cgg gag ggg tag gtc gtg gtc ctg acc tac tcc ccg ttc ctc aag ttt acg ttc cag ttg ttg tt CviJI Hpy188III Bsp1286I Hpy8I TaqI BanII Hpy8I Hpy188III >MnlI CviJI EsaBC3I >MboII <BpuEI <BssSI MwoI >CjePI >CdiI <SapI SmlI AccI >MnlI CviJI >BseYI >BccI >BccI <EarI >MnlI BstZ17I DraIII a gcc ctc cca gcc ccc atc gag aga acc atc tca aaa ccc aaa gga aga gcc cag aca cct caa gta tac acc ata ccc cca cct cgt gaa caa atg tcc < 2100 A L P A P I E R T I S K P K G R A Q T P Q V Y T I P P P R E Q M S t cgg gag ggt cgg ggg tag ctc tct tgg tag agt ttt ggg ttt cct tct cgg gtc tgt gga gtt cat atg tgg tat ggg ggt gga gca ctt gtt tac agg

14 <SspD5I <HphI MaeIII Tsp45I StyD4I >BccI ScrFI >Eco57MI PspGI >AcuI BstXI >BpmI <HpyAV >BspMI BstEII Hpy188I MslI >BsrI >MboII Hpy188I BstNI <MboII CviJI >TspRI >TspGWI >Eco57MI aag aag aag gtt agt ctg acc tgc ctg gtc acc aac ttc ttc tct gaa gcc atc agt gtg gag tgg gaa agg aac gga gaa ctg gag cag gat tac aag a < 2200 K K K V S L T C L V T N F F S E A I S V E W E R N G E L E Q D Y K N ttc ttc ttc caa tca gac tgg acg gac cag tgg ttg aag aag aga ctt cgg tag tca cac ctc acc ctt tcc ttg cct ctt gac ctc gtc cta atg ttc t UnbI Sau96I Psp03I VpaK11AI FmuI AvaII BstNI EcoO109I BslI >BsmFI StyD4I PssI ScrFI >StsI PfoI >BstF5I <FokI >FokI <BstF5I HinfI PpuMI <StsI <MlyI NlaIV AluI HpyCH4III BsaJI >BccI <PleI <BccI SfcI CviJI <BciVI >CstMI Tsp509I <TspGWI <CjeI PspGI Hpy188I >MnlI Cac8I >TspRI HpyCH4III HpyCH4V ApoI >BspMI BtgI ac act cca ccc atc ctg gac tcg gat ggg acc tac ttc ctc tac agc aag ctc act gtg gat aca gac agt tgg ttg caa gga gaa att ttt acc tgc tc < 2300 T P P I L D S D G T Y F L Y S K L T V D T D S W L Q G E I F T C S tg tga ggt ggg tag gac ctg agc cta ccc tgg atg aag gag atg tcg ttc gag tga cac cta tgt ctg tca acc aac gtt cct ctt taa aaa tgg acg ag BfaI Cac8I NheI BmtI CviJI CviJI <MnlI BstNI AluI NlaIII ScrFI BthCI FatI PspGI TseI CviAII StyD4I >BbvI HpyCH4V >MboII >BsmAI BsaJI Fnu4HI c gtg gtg cat gag gct ctc cat aac cac cac aca cag aag aac ctg tct cgc tcc cct ggt aaa tga gaa cag cag cta gc < 2381 V V H E A L H N H H T Q K N L S R S P G K * E Q Q L g cac cac gta ctc cga gag gta ttg gtg gtg tgt gtc ttc ttg gac aga gcg agg gga cca ttt act ctt gtc gtc gat cg

15 22 to 1026: IL-12p40 sequence 1027 to 1071: (G4S)3 linker sequence 1072 to 1650: IL-12p35 sequence 1651 to 2364: IgG sequence Primer sequences: KpnI-p40(S): p40-(g 4S) 3-BamHI(AS): p35-bamhi(s): p35-bcli(as): cca ggt acc tcg cag caa agc aag cct gga tcc gcc gcc acc cga ccc acc acc gcc cga gcc acc gcc tcc gga tcg gac cct gca ggg aac ggc gga tcc agg gtc att cca gtc tct gga ctt gat caa ggc gga gct cag ata gcc cat p40 ampification (KpnI/BamHI): 1 st PCR primers: KpnI-p40(S) / p40-(g4s)3-bamhi(as) 1 st PCR product =1077bp P35 ampification (BamHI/BclI): 2 nd PCR primers: p35-bamhi(s) / p35-bcli(as) 2 nd PCR product =597bp 15

16 Site Usage for : mscil-12ig.xdna -- AarI 2 BcefI 2 BspMI 6 EagI - HpyAV 6 PleI 7 SnaBI - AatII 1 BciVI 1 BsrI 10 EarI 1 HpyCH4III 6 PmeI - SpeI - AccI 1 BclI 1 BsrBI - EciI 2 HpyCH4IV 4 PmlI 1 SphI 1 Acc65I 1 BfaI 5 BsrDI - EcoHI - HpyCH4V 14 PpiI - SrfI - AceIII 3 BfrBI - BsrFI - EcoICRI 1 KasI - Ppu10I - Sse232I - AciI 8 BglI - BsrGI - Eco57MI 11 KpnI 1 PpuMI 1 Sse8647I - AclI - BglII - BssHII - EcoNI - LpnI - PshAI - SspI - AcuI 7 BlpI - BssSI 2 EcoO109I 1 MaeIII 9 PsiI - SspD5I 6 AfeI - Bme1580I 1 BstAPI - EcoRI - MboI 7 Psp03I 8 Sth132I 10 AflII - BmgBI - BstBI 1 EcoRV - MboII 20 PspGI 16 StsI 10 AflIII 2 BmrI 1 BstEII 1 EsaBC3I 5 MfeI - PspOMI - StuI - AgeI - BmtI 1 BstF5I 10 FalI - MluI - PsrI - StyI 3 AhdI 2 BpmI 4 BstKTI 7 FatI 14 MlyI 7 PssI 1 StyD4I 16 AleI - Bpu10I 1 BstNI 16 FauI 3 MmeI 1 PstI 2 SwaI - AlfI - BpuEI 2 BstUI 1 FmuI 8 MnlI 26 PvuI - TaiI 4 AloI 1 BsaI 1 BstXI 3 Fnu4HI 9 MscI 3 PvuII 2 TaqI 5 AluI 13 BsaAI 2 BstYI 1 FokI 10 MseI 1 RleAI 3 TaqII - AlwI 4 BsaBI - BstZ17I 1 FseI - MslI 3 RsaI 8 TatI 3 AlwNI 2 BsaHI 2 Bsu36I - FspI - MspA1I 2 RsrII - TauI 1 ApaI - BsaJI 9 BtgI 1 FspAI - MwoI 6 SacI 1 TfiI 4 ApaBI - BsaWI 2 BtgZI - GdiII 1 NaeI - SacII - TseI 8 ApaLI - BscAI 6 BthCI 9 HaeI 4 NarI - SalI - Tsp45I 6 ApoI 4 BseMII 6 BtsI 2 HaeII - NciI - SanDI - Tsp509I 6 AscI - BseRI 2 Cac8I 7 HaeIII 5 NcoI - SapI 1 TspDTI 7 AseI - BseYI 2 CdiI 6 HaeIV 4 NdeI - Sau96I 8 TspGWI 3 AsiSI - BsgI 2 ChaI 7 HgaI 3 NgoMIV - SbfI 1 TspRI 11 AvaI 2 BsiEI - CjeI 8 HhaI 2 NheI 1 ScaI - Tth111I - AvaII 8 BsiHKAI 3 CjePI 8 Hin4I 11 NlaIII 14 SciI - Tth111II - AvrII - BsiWI - ClaI 2 HinP1I 2 NlaIV 5 ScrFI 16 UnbI 8 BamHI 1 BslI 7 Csp6I 8 HincII 1 Nli3877I 2 SelI 1 UthSI - BanI 1 BsmI - CstMI 4 HindIII - NotI - SexAI 1 VpaK11AI 8 BanII 2 BsmAI 11 CviAII 14 HinfI 11 NruI - SfaNI 6 XbaI 2 BbeI - BsmBI 1 CviJI 36 HpaI - NsiI - SfcI 4 XcmI 3 Bbr7I 8 BsmFI 5 DdeI 7 HpaII 2 NspI 3 SfiI - XhoI - BbsI 8 Bsp24I 1 DpnI 7 HphI 6 PacI - SfoI - XmaI - BbvI 8 Bsp1286I 5 DraI 1 Hpy8I 12 PasI - SgrAI - XmnI - BbvCI - BspCNI 6 DraIII 1 Hpy99I 1 PciI 1 SimI 9 ZraI 1 BccI 15 BspEI 2 DrdI 1 Hpy188I 11 PflMI 2 SmaI - BceAI 2 BspHI 2 EaeI 4 Hpy188III 17 PfoI 2 SmlI 2 16

17 The following sites are unique in : mscil-12ig.xdna -- AatII 1338 BclI 1652 #Bsp24I 190 DraI 369 HincII 1990 PmlI 432 SexAI 1713 AccI 2065 Bme1580I 1934 BstBI 836 DraIII 2081 Hpy99I 1608 PpuMI 2227 SphI 1466 Acc65I 1 #BmrI <1684 BstEII 2127 DrdI 1831 KpnI 1 PssI 2227 TauI 1061 #AloI <462 BmtI 2376 BstUI 1606 #EarI <2045 #MmeI <648 SacI 1641 ZraI 1338 BamHI 1066 #Bpu10I <961 BstYI 1066 EcoICRI 1641 MseI 370 #SapI <2045 BanI 1 #BsaI <625 BstZ17I 2065 EcoO109I 2227 NheI 2376 SbfI 1010 #BciVI <2259 #BsmBI 530 BtgI 2300 #GdiII 1154 PciI 517 SelI 1606 The following sites are absent in : mscil-12ig.xdna -- AclI #BbvCI BssHII HindIII NsiI SanDI SwaI AfeI BfrBI BstAPI HpaI PacI ScaI #TaqII AflII BglI Bsu36I KasI PasI SciI Tth111I AgeI BglII #BtgZI LpnI PmeI SfiI #Tth111II AleI BlpI EagI MfeI #PpiI SfoI UthSI #AlfI #BmgBI EcoHI MluI Ppu10I SgrAI XhoI ApaI BsaBI EcoNI NaeI PshAI SmaI XmaI ApaBI BsiEI EcoRI NarI PsiI SnaBI XmnI ApaLI BsiWI EcoRV NciI PspOMI SpeI AscI #BsmI #FalI NcoI #PsrI SrfI AseI #BsrBI FseI NdeI PvuI Sse232I AsiSI #BsrDI FspI NgoMIV RsrII Sse8647I AvrII BsrFI FspAI NotI SacII SspI BbeI BsrGI HaeII NruI SalI StuI 17

18 RILEVANZA TERAPEUTICA DELLA PROTEINA DI FUSIONE IL-12IgG Importante potenziale di IL-12 nell immunoterapia dei tumori. (Th1, produzione di IFN-, attivazione di CTL e macrofagi) ESIGENZA CHE IL-12 RAGGIUNGA LA SEDE DEL TUMORE. Effetti collaterali: grave tossicità con rischio di morte (colite emorragica, sepsi) Per ridurre gli effetti tossici sistemici dell IL-12 ricombinante, è stata generata una proteina di fusione composta da una singola catena di IL-12 murina e da un anticorpo monoclonale umanizzato (IgG3) specifico per Her/neu, un prodotto derivante da un oncogene overespresso in una percentuale significativa di cancri umani ovarici con prognosi nefasta. Pur non avendo ancora raggiunto la fase clinica, questo e simili costrutti genici rappresentano il primo passo per l impiego terapeutico di una citochina potente come IL-12. Cellule T CD8 + T infiltranti il tumore geneticamente modificate per over-produrre quantità sovrafisiologiche di IL-12 a singola catena sono risultate altamente efficaci in topi portatori di tumore e depletati dei linfociti. Il rilascio localizzato di IL-4 e IL-12 sulla base del riconoscimento anticorpale eradica il tumore in tre diversi modelli sperimentali murine. 18

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20 20

21 Paclitaxel: un inibitore della mitosi usato in chemioterapia antitumorale 21

22 PCR - Polymerase Chain Reaction La PCR è una tecnica in vitro per l amplificazione di una regione di DNA compresa tra due regioni di una sequenza nota. L amplificazione via PCR si ottiene per mezzo di primers oligonucleotidici caratterizzati dall essere corti, a singola catena, e complementari alle regioni estreme della sequenza nota da amplificare. Gli oligonucleotide funzionano da primers per la DNA polimerasi e le catene denaturate del grande frammento di DNA funzionano da stampo (template) Il risultato è la sintesi di nuove catene di DNA complementari alle catene dello stampo originale. Queste nuove catene hanno estremità 5' definite (l estremità 5' dei primers oligonucleotidici), mentre le estremità 3' ends sono potentialmente ambigue in lunghezza 22

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26 DNA stampo primers DNA DNA genomico 5 PRIMER SENSO 3 mrna mrna mrna mrna INSERT + VECTOR cdna derivante dalla retrotrascrizione di un mrna cdna clonato in un vettore plasmidico PRIMER ANTISENSO All estremità 3 è essenziale un buon match con lo stampo All estremità 5 non è essenziale un buon match con lo stampo: possibilità di incorporare sequenze utili! 26

27 DISEGNO DEI PRIMERS 1. La scelta dei primers comprende degli aspetti empirici, ma esistono comunque alcune linee guida di supporto per il disegno di una coppia ottimale di primers 2. Lunghezza ottimale: basi Concentrazione ottimale: da 0,05 a 0,5mM 3. DISTRIBUZIONE CASUALE DELLE BASI quantità di GC = quantità di AT evitare sequenze di polipurine GA o polipirimidine TC 27

28 DISEGNO DEI PRIMERS 4. Evitare sequenze contenenti significative strutture secondarie, in particolare al terminale 3 del primer. 5 a g c t t c a g t c g t a c g g t a c 3 5 a g c t t c a g t c 3 g 5. Controllare che i primers non abbiano porzioni di complementarietà l uno con l altro. 5 a g c t t c a g t c g t a c 3 3 g c a t g a t t c a a g c a 5 DIMERIZZAZIONE DEI PRIMERS 5 a g c t t c a g t c g t a c 3 3 g c a t g a t t c a a g c a 5 28

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30 PARAMETRI DI CICLIZZAZIONE Ogni ciclo di PCR è composto da tre step a differente temperatura STEP1: Denaturatione del DNA a doppia catena (T = C) Un riscaldamento insufficiente può provocare una insufficiente separazione delle eliche. STEP2: Appaiamento (annealing) dei primers (T = C) La temperatura di annealing dipende dalla lunghezza del primer e dal contenuto in A/T e in C/G; Per un primer di 20 basi (10 A/T + 10 C/G) la temperatura di dissociazione (T melting) è di 60 C (2 C per A/T e 4 C per C/G), mentre la temperatura di annealing è di circa 55 C. per aumentare la specificità dei primers può rendersi necessario un aumento della T di annealing. STEP3: Sintesi della catena di DNA (elongation) (T = C) Il tempo di elongation può variare a seconda della lunghezza della sequenza target da amplificare. In genere, si prevede 1 min ogni 1000 basi da copiare. 30

31 PLATEAU DI AMPLIFICAZIONE La reazione di amplificazione non è infinita. Essa è costituita da due stadi: 1 STADIO: amplificazione esponenziale (vedi schema successivo) 2 STADIO: plateau di amplificazione Cause normali: esaurimento dei primers e dei dntps, inattivazione della polimerasi. Cause particolari: eccesso di substrato, competizione per prodotti non specifici, riassociazione del prodotto. 31

32 1 STADIO: amplificazione esponenziale 32

33 1 STADIO: amplificazione esponenziale 33

34 1 STADIO: amplificazione esponenziale 34

35 APPLICAZIONI DELLA PCR 1) PCR E TOSSICOLOGIA MOLECOLARE Agenti tossici o loro metaboliti causano alterazioni o mutazioni a carico della doppia elica del DNA. Utilizzo della PCR: individuazione di alterazioni genetiche precoci in individui a rischio di cancro. (Es: alterazioni dei geni p53, c-erbb2 o ras nelle cellule raccolte dall escreato o dall urina di soggetti esposti a sostanze cancerogene). amplificazione in breve tempo di frammenti specifici di DNA disponibilità di numerose sonde fluorescenti utili a mappare porzioni di cromosomi 35

36 APPLICAZIONI DELLA PCR 2) UTILIZZO DELLA PCR PER INGEGNERIZZARE IL DNA Principio dell add-on: introduzione di alterazioni del DNA attraverso primers Marcatura del prodotto di PCR ( tag fluoresceti, radioattivi, o di biotina) aggiunta di siti di restrizione Alterazione di sequenze di DNA in qualunque posizione ADD-ON:

37 SEQUENZIAMENTO CON IL METODO DI SANGER 37

38 3) PCR IN DIAGNOSTICA DIAGNOSTICA DEI TUMORI APPLICAZIONI DELLA PCR L'analisi consiste nell'individuazione, mediante amplificazione genica (PCR), dell'mrna dell'antigene Prostatico Specifico (PSA) di eventuali micrometastasi (cellule tumorali, i piccoli "cluster" di tali cellule) presenti nel circolo sanguigno. Il parametro è molto importante nella diagnosi precoce dei tumori alla prostata, nella scelta della terapia e nel follow up del paziente dopo prostatectomia. L'analisi quantitativa permette la valutazione numerica delle cellule prostatiche rilevate nel campione in esame. L analisi dell mrna per il proto-oncogene RAS mutato può avere valore diagnostico in certi tumori. Durante il trattamento di molte neoplasie, le cellule tumorali diventano resistenti alla chemioterapia. L amplificazione di geni responsabili della resistenza ai farmaci è rivelatrice di tale fenomeno. DIAGNOSTICA DELLE INFEZIONI VIRALI L amplificazione di specifici RNA virali è un buon indicatore di infezioni virali in corso; ad esempio: identificazione di una infezione da HIV esguendo una PCR specifica su cellule del sangue. DIAGNOSTICA DELLE INFEZIONI BATTERICHE Amplificazione di genispecifici altamente conservati di Mycobacterium tuberculosis. Sensibilità: 10 microorganismi / 10 6 cellule eucariotiche. 38

39 APPLICAZIONI DELLA PCR 4) STUDIO VIA PCR DELLA MODULAZIONE DELL ESPRESSIONE GENICA Una parte delle proteine del patrimonio genetico sono espresse ubiquitariamente, altre lo sono solo in un determinato tessuto; per altre ancora, la modulazione (positiva o negativa) dell espressione dipende da stimoli extracellulari. (MODULAZIONE ENDOGENA DELL ESPRESSIONE GENICA) il complesso processo della trascrizione offre numerose possibilità di intervento farmacologico, con il fine di aumentare o diminuire l espressione di determinati geni coinvolti in processi patologici. (MODULAZIONE ESOGENA DELL ESPRESSIONE GENICA) mrna mrna mrna mrna Reverse Transcription cdna STAMPO PER ANALIZZARE L ESPRESSIONE GENICA VIA PCR 39

40 40

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42 1,5 1 Fold change = 1,5 : 1 = 1, ,5 : 3 = 0,5 Fold change = 0,5 : 0,2 = 2,5 1 : 5 = 0,2?? 42