CARATTERISTICHE DELLE TAG PIU USATE

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1 Proteine di fusione

2 Proteine di fusione tag proteina Aumento stabilità Purificazione per affinità Metodo di identificazione spettrofotometria Saggio di legame anticorpo Esporto in compartimenti

3 CARATTERISTICHE DELLE TAG PIU USATE TAG RESIDUI SEQUENZA DIM.(kDa) Poly-Arg 5 6 (5) RRRRR 0.80 Poly-His 2 10(6) HHHHHH 0.84 FLAG 8 DYKDDDDK 1.01 Strep-tag II 8 WSHPQFEK 1.06 c-myc 11 EQKLISEEDL 1.20 S- 15 KETAAAKFERQHMDS 1.75 Calmodulin-binding peptide 26 KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL 2.96 Cellulose-binding domains SBP 38 MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQ LRARLEHHPQGQREP 4.03 Chitin-binding domain 51 TNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYN GKTYKCLQPHTSLAGWEPSNVPALWQLQ 5.59 Glutathione S-transferase 211 Protein Maltose-binding protein 396 Protein 40.00

4 CARATTERISTICHE DELLE TAG PIU USATE TAG APPLICAZIONE PURIFICAZIONE Poly-Arg purificazione Cation exchange Poly-His purificazione Ni-NTA/Co-CMA FLAG epitopo-solubilità anticorpo Strep-tag II purificazione/ interazioni Strep-Tactin(streptavidina) c-myc rilevazione anticorpo monoclonale S-tag rilevazione S-protein (RNAsi A) Calmodulin-binding peptide purificazione(procarioti) Calmodulina Cellulose-binding domains purificazione Cellulosa SBP purificazione/immobilizzazione Streptavidina Chitin-binding domain purificazione(inteina=self-splicing) Chitina Glutathione S-transferase purificazione/solubilità(dimeri) Glutatione Maltose-binding protein purificazione/solubilità(dimeri) Amilosio Eluizione: con competitori di legame o gradienti salini

5 La presenza del tag non dovrebbe influenzare (molto) le proprietà della proteina His 6 Tag 6 His al N- o C-term Lega metalli Resine: Ni 2+ -NTA (Acido NitriloTriacetico) Co 2+ -CMA (Carbossimetilaspartato) (TALON) Resine chelanti metalli esacoordinati Di cui gener. 4 legami con resina 2 legami con proteina Eluizione: competizione con leganti di metalli (o metalli stessi) di solito con imidazolo mm

6 Isolamento della proteina

7 BamH1 EcoR1 SmaI SalI XhoI NotI... ATC GAA GGT CGT GGG ATC CCC AGG AAT TCC CGG GTC GAC TCG AGC GGC CGC TAG CTT CCA GCA CCC TAG GGG TCC TTA AGG GCC CAG CTG AGC TCG CCG GCG Ile Glu Gly Arg Gly Ile Pro Arg Asn Ser Arg Val Asp Ser Ser Gly Arg... Factor Xa Un sito di taglio per proteasi facilita il recupero della proteina

8 VETTORE cdna Enterochinasi Trombina(es.) TEV proteasi Asp Asp Asp Asp Lys * Leu Val Pro Arg *Gly* Ser Glu X X Tyr X Gln* Ser * Sito di taglio

9 TAG e METODI HTP Sistemi di espressione preferiti: E. coli Lievito (Pichia pastoris)

10 GFP: un tag un po speciale

11 GFP come folding reporter

12 Strategie di mutagenesi SELEZIONE GENETICA seleziono FENOTIPO determino GENOTIPO GENETICA INVERSA creo GENOTIPO determino FENOTIPO i.e., traduco una sequenza in una funzione Mutagenesi in vivo Phage display Mutagenesi in vitro

13 Mutagenesi In Vitro La mutagenesi in vitro permette di cambiare la sequenza nucleotidica di un frammento di DNA Le mutazioni possono essere localizzate o generali, casuali o mirate; Analisi di regioni regolative: metodi meno specifici Ingegneria proteica: Analisi del contributo di singoli aminoacidi (o gruppi di aminoacidi), alla struttura e funzione della proteina target-->metodi specifici Con entrambi i metodi si ottengono mutanti in vitro, senza selezione fenotipica

14 Mutagenesi di Sequenze codificanti

15 Principali metodi di mutagenesi MUTAGENESI SITO-DIRETTA SCANNING MUTAGENESIS MUTAGENESI A SATURAZIONE/CASUALE MUTAGENESI PER RICOMBINAZIONE

16 Mutagenesi Sito-Diretta Ruolo di particulari residui nella struttura, attività catalitica o legame Centinaia di metodi basati su un principio comune Oligo sintetico con la mutazione appaiato alla regione bersaglio gene wt primer per sintesi di DNA in vitro Estensione da parte della DNA polimerasi produce dsdna mutato Il DNA mutato viene inserito nel gene e si esprime la proteina mutante

17 Progettazione degli Oligonucleotidi Mutagenici Passaggio critico. La sequenza contiene (almeno) 1 mutazione Può contenere inserzioni, delezioni e sostituzioni con nucleotidi alterati Lunghezza minima dell oligo: dipende dai casi Mutazioni semplici di una base ~25 nt Mutazioni complesse possono richiedere oligo >80 nts

18 Si possono progettare varie caratteristiche per ottimizzare la mutazione: Sequenza e composizione in basi Basi appaiate/non appaiate Percentuale in GC in varie zone (estremità) Temperatura di fusione Propensità a formare strutture secondarie Specificità di appaiamento Nel templato Tra primer (diminuisce la concentrazione critica)

19 Mutagenesi sito-diretta classica Protocollo comprende: Progettazione e sintesi degli oligo mutagenici Ibridazione degli oligo mutagenici a ssdna bersaglio (M13) elimina competizione tra oligo mutagenico e filamento di DNA complementare Estensione dalla DNA polimerasi in presenza di 4 dntps Formazione di DNA circolare con DNA ligasi Trasformazione di batteri Screening dei cloni mutati per ibridazione (e.g., oligo) sequenza Recupero del frammento di DNA mutato Sostituzione del frammento mutato nel gene wt

20 1. Clonaggio dell inserto nel vettore 2. Denaturazione ed appaiamento 3. Estensione con T4 DNA polimerasi; Ligazione con T4 DNA ligasi 4. Selezione filamento mutante Trasformazione

21 wild-type sequence Ile CAA GCG CCC ATT GGC AAA CAA GTT CGC GGG GAA CCG TTT GTT mutant oligo Leu

22 Mutagenesi sito-diretta classica Percentuale di cloni mutati 0.1% - 50% a seconda della efficienza dell oligo mutagenico Sviluppo di metodi di selezione negativa del DNA wt; KUNKEL: Digestione selettiva del filamento stampo con enzimi di restrizione o esonucleasi USE (Unique Site Elimination) Eliminazione di un sito unico di restrizione Associazione con recupero di resistenza o capacità di replicazione

23 Mutagenesi con Metodo Kunkel Selezione negativa di DNA con uracile in ceppi di E. coli che esprimono la uracil-dna glicosidasi Stampo ssdna ottenuto preparando M13 in dut- ung- F E. coli dut- - =difettivi = dutpasi ; ung- - = difettivi uracil-n- -N-glicosidasi

24 La mutagenesi genera un heteroduplex in cui stampo con uracile ma filamento neosintetizzato con timidina Questo heteroduplex DNA si trasforma in ceppo ung+ + E. coli selezione contro il filamento wt Fino ad 80% sono mutanti

25 Mutagenesi con metodo USE Elimina sito di restrizione unico Usa 2 primers un primer ( (primer mutagenico) ) introduce la mutazione, il secondo elimina il sito unico nel plasmide Heteroduplex: : lo stampo ha il sito di restrizione, mentre il filamento nuovo ha la mutazione,, ma non il sito di restrizione Incubazione con enzima si linearizza wt ma non heteroduplex Transformazione in ceppo di E. coli che non ripara (BMH71-18 muts) (DNA lineare transforma volte meno del circolare) si replica heteroduplex Seconda digestione e transformazione in ceppo di E. coli normale (5-50% mutanti)

26 Mutagenesi a cassetta Sostituzione di un frammento di DNA tra due siti di restrizione Possibilità di ottenere mutanti multipli Semplice ed efficiente Problema: necessità di siti unici (geni sintetici OK)

27 PCR

28 Mutagenesi per PCR Vantaggi rispetto ai metodi classici; Alta percentuale mutanti selezione non richiesta Stampi a dsdna, mutazioni quasi ovunque Alta temperatura--> meno strutture secondarie veloce -non richiede clonaggio in vettori particolari Svantaggi potenziali: Frequenza di errori elevata si usa polimerasi alta fedeltà (e.g., VENT or PFU) Ridotta efficienza di applicazione per frammenti > 2-3 kb

29 Possibilità con la mutagenesi per PCR Sostituzione di base Overlap extension Megaprimer extension Quik change Delezioni Mismatched primers PCR-fusion Inverted PCR Inserzioni Overlap extension

30 Overlap Extension PCR Mutagenesis DNA stampo PCR con primers mutagenici Purifica ed unisci PCR con primers terminali DNA mutato

31 Megaprimer Extension PCR Mutagenesis DNA PCR con primer mutagenico stampo Purifica megaprimer PCR con megaprimer+primer terminale Mutated DNA

32 QuikChange (80%) PCR Proofreading Polymerase Amplifica tutto il plasmide DpnI degrada templato wt metilato Non usare con DNA da ceppi dam - Rapido

33 Deletion PCR Mutagenesis

34 Deletion PCR Mutagenesis

35 Insertion PCR Mutagenesis

37 Scanning Mutagenesis (1) Cambia residui di superficie, conservando la struttura 3D I residui carichi di superficie non sono di solito cruciali per la integrità strutturale: importanti per legame, oligomeri e catalisi ALANINE SCANNING MUTAGENESIS Sostituzione sistematica di residui carichi con alanina: Elimina la catena laterale dopo il carbonio beta Elimina interazioni funzionali tra aminoacidi Non altera la conformazione della proteina Molto efficace per assegnare funzioni di superficie

38 Alanine scanning mutagenesis gggcccttttaaagggaattaattcccccaaatttggggggtttaaatttgggcccccacacatacatatctaccta HFKRVVSPWNACSPCYYTQDEED AFKRVVSPWNACSPCYYTQDEED HAKRVVSPWNACSPCYYTQDEED HFARVVSPWNACSPCYYTQDEED HFKAVVSPWNACSPCYYTQDEED HFKRAVSPWNACSPCYYTQDEED HFKRVASPWNACSPCYYTQDEED HFKRVVAPWNACSPCYYTQDEED HFKRVVSAWNACSPCYYTQDEED HFKRVVSPANACSPCYYTQDEED DNA Protein

39 Scanning Mutagenesis (2) CYSTEINE SCANNING MUTAGENESIS Residui di cisteina non appaiati sostituiscono specifici aminoacidi Residui di cisteina: dimensioni medie, non carichi e idrofobici Reagiscono bene con agenti chimici modificanti tipo N-ethylmaleimide Si usa per; Marcare la proteina per studi di topologia Misurare la sensibilità a reagenti in acqua o lipidi

41 STRATEGIA GENERALE DI EVOLUZIONE DIRETTA Complessità Espressione Identificazione Fitness landscape (scenario del successo evolutivo): possibilità che si presentano ad una data proteina in termini di fitness. Per esplorare queste possibilità la sequenza della proteina deve variare all interno di uno spazio di sequenza (complessità della diversità dei sistemi proteici=20 n )

42 Mutagenesi a Saturazione/Casuale GENERA MUTAZIONI SU TUTTA LA SEQUENZA Casuale: trascura le informazioni sul ruolo dei singoli aminoacidi Fornisce informazioni su tutto lo sequence space i.e., relazioni tra sequenza aa, struttura 3D e funzione Se utilizzata su piccoli frammenti della proteina Si può costruire un catalogo di aminocidi permessi o deleteri MUTAGENESI CHIMICA/RADIAZIONI MUTAGENESI A CASSETTA MUTAGENESI PER INCORPORAZIONE ERRATA MUTAGENESI CON SET DI OLIGONUCLEOTIDI PARTICOLARI

43 MUTAGENESI CASUALE CON OLIGO DEGENERATI OLIGO CON ANALOGHI DI BASI 5-BROMOURIDINA 2-AMINOPURINA

44 Error-prone PCR con Taq-polimerasi Nella PCR aumento concentrazione MgCl 2 # cicli - concentrazione polimerasi

45 Mutagenesi per ricombinazione UTILIZZA LA VARIABILITA GIA PRESENTE IN REGIONI SEPARATE DI UNA SEQUENZA O PIU SEQUENZE DNA shuffling: frammentazione + PCR StEP (Staggered Extension Process): estensione corta + PCR Random-priming: primers casuali + PCR

46 DNA SHUFFLING SU GENI DA FAMIGLIE PROTEICHE Incroci di molecole

47 DNA SHUFFLING. DNAsi e PCR senza primers DNAse I 5 5 * * * * 5 5 DNAse I 5 * * * Denature & anneal fill in & amplify 5 * * * * 5

48 DNA shuffling (= Molecular Breeding) Homo-duplex formation PCR Resembles synthesis of synthetic gene (Directed Mutagenesis) Hetero-duplex formation PCR Resembles synthesis of gene fusions (Directed Mutagenesis)

49 StEP recombination Staggered Extension Process NB I geni devono presentare un grado di omologia di sequenza elevato StEP recombination. Only one primer and single strands from two parent genes (templates) are shown. (A) Denatured template genes are primed with one defined primer. (B) Short fragments are produced by brief Polymerasecatalyzed primer extension. (C) Through another cycle of StEP, fragments randomly prime the templates (template switching) and extend further. (D) This process is repeated until full-length genes are produced resulting in a genepool of recombined parent genes (E).

50 Staggered Extension Process (StEP) Denaturation Annealing, Extension Denaturation Annealing, Extension

51 SCOPE (Structure based Protein engineering) Beta-lattamasi SCHEMA (algoritmo per predire quali frammenti possono essere ricombinati senza disturbare la struttura)

52 ALCUNI KIT DI MUTAGENESI COMMERCIALI Amersham-Pharmacia Sculptor IVM mutagenesis kit Biotech USE mutagenesis kit Bio-Rad Muta-gene in vitro mutagenesis kit Clontech Transformer site-directed mutagenesis kit Life Technologies CFLP Powerscan mutation detection system PanVera Mutan-Express Km kit Promega Altered Sites II in vitro mutagenesis systems Gene Editor System Interchange in vitro mutagenesis system Stratagene Quik-change site-directed mutagenesis kit ExSite PCR-based mutagenesis kit Chameleon ds site-directed mutagenesis kit NEB Code20 kit