TEST DI SENSIBILITA PER MICOBATTERI DEFINIZIONI. M. tuberculosis: le resistenze

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1 MYCO - 09 CORSO DI MICOBATTERIOLOA AVANZATA Firenze, 9- Gennaio 009 TEST DI SENSIBILITA PER MICOBATTERI UDIO SCARPARO S.O.C. DI MICROBIOLOA A.O.U. S. MARIA DELLA MISERICORDIA - UDINE TEST DI SENSIBILITA o AST (Antimycobacterial Susceptibility Testing) M. tuberculosis complex e MOTT differiscono tra loro per: il ruolo che assumono nelle infezioni umane; le caratteristiche biologiche e la necessità di diversi fattori di crescita; la sensibilità ai farmaci. Non esistono farmaci antimicobatterici genericamente validi in tutte le circostanze. Dovrebbe essere saggiata una batteria di farmaci per ogni specie micobatterica, scelta sulla base delle conoscenze relative all efficacia di tali farmaci in vivo e/o alla loro attività in vitro. La composizione dei terreni e le condizioni di crescita dovrebbero soddisfare le esigenze di crescita della specie micobatterica in esame essendo allo stesso tempo ottimali per l attività del farmaco. M. tuberculosis: le resistenze dovute esclusivamente a mutazioni cromosomiche mutazioni responsabili di resistenze si verificano spontaneamente con frequenza variabile, a seconda dei farmaci, fra /0 6 e /0 la resistenza è il risultato della selezione dei mutanti resistenti, a seguito di mono-terapie o per difetto di compliance l uso di almeno due farmaci abbassa la probabilità di comparsa di resistenze a livelli inferiori al numero di bacilli normalmente presenti in una singola lesione (0-0 0 UFC) una resistenza si definisce primaria quando è già presente nel ceppo responsabile dell infezione una resistenza si definisce secondaria quando insorge durante la terapia DEFINIZIONI Un ceppo di M. tuberculosis è solitamente definito resistente quando differisce significativamente dal ceppo selvaggio nel suo grado di sensibilità a causa di una aumentata proporzione di mutanti resistenti ad una concentrazione critica del farmaco, concentrazione critica che è significativamente più alta della più alta MIC evidenziata per i ceppi selvaggi. Un ceppo di M. tuberculosis viene comunemente definito multidrug-resistant (MDR) quando è resistente ad almeno isoniazide e rifampicina EXTENSIVELY DRUG-RESISTANT (XDR) TB Un ceppo di M. tuberculosis viene definito XDR quando è resistente ad isoniazide e rifampicina + un fluorochinolone ed almeno un farmaco di seconda linea iniettabile Second-Line Drug Classes for Treatment of MDR TB Aminoglycosides Polypeptides Fluoroquinolones Thioamides Serine analogues PAS Amikacin, Kanamycin Injectables Capreomycin Ciprofloxacin, Ofloxacin Ethionamide, Prothionamide Cycloserine, Terizidone Para-aminosalicylic acid XDR 00 (%)

2 TEST DI SENSIBILITA PER M. tuberculosis complex Metodo delle proporzioni: Il più largamente usato, è considerato il sistema di riferimento. Si basa sull osservazione empirica secondo la quale, se in una popolazione micobatterica è presente più del % di mutanti resistenti ad un farmaco, tale popolazione è da considerarsi resistente, in quanto la % suddetta è destinata ad aumentare rapidamente per effetto della pressione selettiva esercitata da una terapia che utilizzi il farmaco in questione. METODI QUALITATIVI Utilizzano un unica concentrazione di farmaco, definita concentrazione critica o breakpoint, e consentono di determinare solo se il micobatterio in esame è sensibile o resistente. La concentrazione critica rappresenta la più bassa concentrazione del farmaco che inibisce il 9% dei ceppi selvaggi di M. tuberculosis (che non sono mai stati esposti ai farmaci) e non inibisce i ceppi isolati da pazienti che non hanno risposto alla terapia e che sono considerati resistenti Questo approccio si è dimostrato valido per il M. tuberculosis che presenta, nei ceppi selvaggi, una notevole uniformità nel grado di sensibilità alla maggior parte dei farmaci ed una chiara distinzione dagli isolati che presentano resistenza. Antimicrobial Susceptibility Test (AST) per M. tuberculosis complex Ha 3 scopi principali: guida nella scelta iniziale dei farmaci; conferma della comparsa di farmacoresistenza e/o del fallimento terapeutico quando persiste una positività microbiologica, e quindi guida nella scelta dei farmaci per un nuovo approccio terapeutico; stima della prevalenza della farmacoresistenza primaria o acquisita nella comunità. I principali farmaci antitubercolari AMPICINA: AMPICINA battericida; attività sia sui batteri in rapida moltiplicazione che su quelli intracellulari a crescita rallentata; inibisce la sintesi proteica ISONIAZIDE: ISONIAZIDE battericida; attività sui batteri in rapida moltiplicazione; inibisce la sintesi degli acidi micolici ETAMBUTOLO: ETAMBUTOLO batteriostatico; attività sui batteri in rapida moltiplicazione; inibisce la sintesi della parete EPTOMICINA: EPTOMICINA battericida; attività solo sui batteri extracellulari in rapida moltiplicazione; blocca la sintesi proteica PIRAZINDE: PIRAZINDE battericida a ph acido (in associazione con l isoniazide) sui batteri intracellulari; meccanismo di azione sconosciuto

3 AST per M. tuberculosis complex I Centers for Disease Control and Prevention (CDC) raccomandano: l esecuzione del test di sensibilità per i cinque farmaci primari (, SM, RMP, e ) su tutti i ceppi di M. tuberculosis di primo isolamento, utilizzando il sistema radiometrico Bactec o sistemi similari che utilizzino un terreno liquido; NCCLS (000): due concentrazioni, critica ed alta concentrazione. Streptomicina farmaco di a scelta la comunicazione del risultato del test al clinico il più rapidamente possibile e comunque entro -30 giorni dal ricevimento del campione; l esecuzione di un successivo test di sensibilità sul ceppo isolato da colture che non si negativizzano entro 3 mesi dall inizio della terapia, o se esiste evidenza clinica di un fallimento terapeutico. CONCENTRAZIONI DEI FARMACI PER MTC Farmaco Solvente Concentr. ug/ml nei vari terreni Bactec B ESP L.J. 7H0 7H Isoniazide acqua distillata 0. a 0. a 0. b a 0. a.0 b.0.0 metanolo.0 a a 0 b.0.0 acqua distillata. a a.0 b b 0 - Pirazinamide acqua distillata 00 a,c - -0 b,d 0 b,d - a Concentrazione raccomandata NCCLS M-A Gennaio 003; b NON Raccomandato; c ph = 6; d ph =.. AST per M. tuberculosis complex Farmaco Isoniazide Solvente BACTEC 60TB 0, MT 960 0, Concentrazione nei vari terreni/sistemi (µg/ml)( VersaTREK 0, BacT ALERT 3D 0, L-J 0, 7H0 0, 7H 0, 0, 0, 0,,0,0,0 DMSO,0,0,0,0 0,0,0 MTC, 7,,0 7,,0,0,0,0 6,0,0 0 7, 0 Pirazinamide ISONIAZIDE 0, ug/ml Bactec 60 TB ISONIAZIDE 0, ug/ml Streptomicina Capreomicina,0 6,0,,0,0,,0,0 0,0 0,0,0 0 0 Etionamide DMSO,,0 0,0 0 RESISTENTE SENSIBILE Protionamide Kanamicina Amikacina DMSO,,0,0,,0 0 0,0,0 6,0 Commento nel referto: i risultati di questo test indicano un basso-livello di resistenza all Isoniazide Ofloxacina Ciprofloxacina Moxifloxacina Levofloxacina PAS NaOH 0,N NaOH 0,N NaOH 0,N NaOH 0,N,0,0 0,,0,0,0 0,,0 0,,0,0 0,,0,0,0,0 Clofazimina DMSO 0, 0 Rifabutina Metanolo 0, 0, 0, 0, Linezolid,0,0 METODO DELLE PROPORZIONI IN AGAR I farmaci di seconda linea dovrebbero essere testati solo in presenza di resistenze accertate a quelli di prima linea e solo in Laboratori di Riferimento. Non esistono kit commerciali pronti all uso per questi farmaci. Rappresenta lo standard (NCCLS) contro il quale i nuovi sistemi devono essere valutati Utilizzato per confermare i risultati ottenuti con i sistemi commerciali in brodo Utilizzato per testare farmaci addizionali o concentrazioni di farmaci che non sono disponibili come test commerciali. Raccomandato il Middlebrook 7H0 agar; il 7H agar può favorire la crescita dei ceppi MTC resistenti all isoniazide. 3

4 METODO DELLE PROPORZIONI IN AGAR Piastre di Petri divise in quadranti Farmaci in polvere (METODO DI DILUIZIONE IN AGAR) Dischetti impregnati di farmaco (METODO DI ELUIZIONE DA DISCO) Terreno 7H0 + AODC mantenuto liquido a - 0 C Distribuire ml di terreno nel quadrante di controllo senza farmaco. Distribuire ml di terreno addizionato del corrispondente farmaco (polvere o dischetto) nei rimanenti quadranti Solidificare a T. ambiente e stoccare in buste di plastica per non oltre un mese a C al buio. Se si utilizzano dischetti, incubare una notte a 37 C per favorire diffusione del farmaco. AST SU TERRENI AGARIZZATI Piastra Quadrante Farmaco Concentr. del farmaco (ug/ml) nel dischetto nel terreno I II III IV Controllo Isoniazide Isoniazide I II III IV Controllo Streptomicina Streptomicina METODO DELLE PROPORZIONI IN AGAR Standard (CLSI) NO SAGO DIRETTO SU TERRENI SOLIDI Oltre che con la metodica indiretta (da coltura), il Test di Sensibilità di MTC può essere eseguito direttamente, previa decontaminazione, sui campioni positivi all esame microscopico, preferibilmente su terreni agarizzati (ma anche su quelli all uovo) Diluizione del campione per il test di sensibilità di MTC con il metodo diretto Mc Farland Diluizione 0 - Cont. Cont. S S R Incubazione 37 C per 3 settimane CO % Diluizione 0 - Numero di micobatteri per campo microscopico Colorazione con fucsina basica (obbiettivo 00 x) < -0 >0 Colorazione con fluorocromi (obbiettivo 0 x) < -0 >0 Diluizioni finali del campione non diluita 0 -, 0-0 -, 0-3 Diluting fluid BACTEC 60 TB and SIRE Susceptibility 0. McFarland 0-0. ml CONT ml 0. ml 0. ml 0. ml + SM + + RMP + - days qualitative test ph 6 Growth Control BACTEC 60 TB and Susceptibility FROM POSITIVE B VIAL with Diluting volume (B) ml B ml B ml B ml B ml B Add 0. ml from positive B vial Add 0. ml of RF farmaco attivo a ph.7-.. Tali valori di ph inibiscono la crescita di molti ceppi di MTC rendendo problematico il test di sensibilità per con metodi convenzionali. Reconstituting Fluid Add 00 µl of drug ph CONTROL RESISTANCE SUSCEPTIBILITY CONTROL RESISTANCE SUSCEPTIBILITY - days qualitative test

5 BACTEC MT 960 AST Fiale liofilizzate dei farmaci ricostituite con ml acqua distillata sterile. Metodo delle proporzioni modificato (GC :00) Concentrazione antibiotici critica (bassa) ed alta Monitoraggio strumentale continuo Il software guida nell interpretazione dei risultati Il risultato è interpretato quando il GC è positivo Tests in - 3 giorni Streptomicina.0 ug/ml Isoniazide 0. ug/ml.0 ug/ml.0 ug/ml Concentrazioni Critiche Tubo MT - 7 ml Non invasivo (no aghi), completamente automatico e gestione dati computerizzata Fiale liofilizzate dei farmaci ricostituite con ml acqua distillata sterile. Streptomicina.0 ug/ml Isoniazide 0. ug/ml 7. ug/ml Alte Concentrazioni Supplemento SIRE SUSPENSION FOR INOCULUM FROM POSITIVE MT TUBE BACTEC MT 960 and SIRE Susceptibility Day 0 Incubation for one day again Add 0. ml of SIRE Supplement Add 00 ul of drug PIRAZINDE Bactec MT 960 terreno ( provette) 3 Day and No dilution Day 3 to Dilution : sterile saline S I R E 3 Add 0. ml from Pos. MT tube antibiotico (0 Tests) fiale 6 fiale supplemento DILUTION :00 0. ml + 0 ml sterile saline 0. ml - days qualitative test C S I R E Insert into the BACTET MT 960 MT 00 ug/ml BACTEC MT 960 and Susceptibility SUSPENSION FOR INOCULUM FROM POSITIVE MT TUBE Day 0 Incubation for one day again Add 0. ml of Supplement ph.9 AST by BACTEC MT 960 Inoculo set SIRE (CC,, ISH, e ) Inserimento nello strumento e lettura codice a barre Add 00 µl of drug 3 Day and No dilution Day 3 to Dilution : sterile saline 3 Add 0. ml from positive MT tube Dilution : 0. ml +. ml sterile saline Add 0. ml Growth Control - days qualitative test Insert into the BACTET MT 960

6 AST by BACTEC MT 960 Rimozione del SET Stampa dell interpretazione AST by ESP Colture System II - VERSATREK Supplemento di Crescita Myco: OADC- Acido Oleico, Albumina, Destrosio e Catalasi ml ISO ETB ETB: i flaconi liofilizzati vanno reidratati con ml di acqua distillata sterile ug/ml Isoniazide 0. ug/ml Isoniazide 0. ug/ml - ml farmaco + ml H O ug/ml ug/ml - 0 ml farmaco + 6 ml H O ml : il flacone liofilizzato va reidratato con ml di acqua distillata sterile Pirazinamide 300 ug//ml 0. ml < 7 h VERSATREK 0. ml < 7 h POS McFarland Diluizione :0 Inoculo 0. ml FDA Approved POS McFarland Diluizione :0 Inoculo 0. ml NO FDA Approved CONT ISO 0. ISO 0. ETB ETB CONT. Il flacone di CONT deve risultare POS > 3 giorni ma < 0 giorni. Registrare il tempo di rivelazione. SENSIBILITA : Flacone con farmaco NEG o POS dopo 3 giorni dalla positività del CONT 3. RESISTENZA: Flacone con farmaco POS contemporaneamente o entro 3 giorni dalla positività del CONT. Il flacone di CONT deve risultare POS > 3 giorni ma < 0 giorni. Registrare il tempo di rivelazione. SENSIBILITA : Flacone con farmaco NEG o POS dopo 3 giorni dalla positività del CONT 3. RESISTENZA: Flacone con farmaco POS contemporaneamente o entro 3 giorni dalla positività del CONT Principle: :00 Dilution 0, ml suspension in 9,9 ml sterile distilled water 0, ml AST by MB/BacT - Protocollo 3- days qualitative test Positive MB/BacT bottle < h No Dilution 0, ml Restoring Fluid 0, ml NO FDA approved 0. ml.0 McFarland 0, ml 0, ml 0, ml 0, ml Principle: :0 Dilution 0, ml suspension in 0,9 ml sterile distilled water 0, ml AST by MB/BacT - Protocollo 0, ml Positive MB/BacT bottle - h No Dilution Growth Control 0, ml 0. ml.0 McFarland 00 ug/ml Proportional Control Growth Control RMP SM.0 µg/ml 0. µg/ml.0 µg/ml.0 ug/ml Sensibilità: Flacone con farmaco negativo o positivo dopo C. Diretto e Proporzionale Resistenza: Flacone con farmaco positivo contemporaneamente o dopo il C. Diretto ma contemporaneamente o prima del C. Proporzionale. Proportional Control Reconstitution Fluid 0, ml Acidifying reagent 0. ml + 3- days qualitative test NO FDA approved Sensibilità: Flacone con farmaco negativo o positivo dopo CP :0 Resistenza: Flacone con farmaco positivo prima o contemporaneamente al CP :0 o Positivo prima del C. Diretto (entro ore). 6

7 Ricostituire il flacone di antibiotico con ml di acqua deionizzata sterile. Aggiungere 0. ml del farmaco al flacone MB/BacT Process. Nota : il flacone MB/BacT deve essere supplementato con 0. ml di Restoring Fluid Inoculare poi il flacone MB/BacT Process con 0. ml della brodocoltura positiva per MTC. 7

8 BACTEC MT 960 System - Susceptibility Testing problemi devono essere necessariamente presi in considerazione perché in grado di influenzare l accuratezza dei risultati:. Purezza della cultura. Omogeneità della sospensione micobatterica 3. La dimensione dell inoculo. La contaminazione ambientale dei tubi durante le procedure di inoculo (possono interessare anche un solo tubo) Un alta percentuale di contaminazione in comparazione con il Bactec 60 TB è stata riportata da alcuni autori (Johansen I.S., Scarparo C., Tortoli E.) secondo i quali i principali responsabili sono il terreno di coltura liquido particolarmente ricco e la sostituzione del setto di gomma con il tappo a vite. MB/BacT BacT System - Susceptibility Testing VersaTREK System - Susceptibility Testing Limitazioni nella valutazione delle performance di questo Sistema:. Poche pubblicazioni peer-reviewed. No licenza FDA 3. Differenti protocolli utilizzati Concentrazioni SM (0., 0.9,, ug/ml) Concentrazioni (.0, 3., 7.0 ug/ml) Concentrazioni RMP (0.9,.0 ug/ml) Concentrazioni (0.09, 0., 0. ug/ml) Concentrazioni (0, 00 ug/ml) Diluizioni di SIRE e nei controlli di crescita Acidificazione del terreno liquido per Risoluzione dei risultati discrepanti in solo studi Utilizzo di differenti metodi di riferimento Lettura ed interpretazione dei risultati dei test Limitazioni nella valutazione delle performance di questo Sistema:. Poche pubblicazioni peer-reviewed. No licenza FDA per e SM 3. Alta frequenza di contaminazioni per test

9 METODI QUANTITATIVI Consentono di misurare il grado di sensibilità degli isolati clinici determinando la Minima Concentrazione Inibente (MIC), che corrisponde alla più bassa concentrazione del farmaco capace di inibire in vitro più del 99% della popolazione micobatterica in esame. La determinazione della MIC può essere importante per quelle specie micobatteriche caratterizzate da un ristretto intervallo tra sensibilità e resistenza ad un determinato farmaco. Le MIC dovrebbero essere determinate in un terreno liquido privo di componenti in grado di inibire in modo significativo il farmaco o di alterare la naturale permeabilità ai farmaci della parete del micobatterio. Test in Microdiluizione (MIC) Brodo + Inoculo + Antibiotico Nessuna crescita 6 Concentrazione antibiotico (µg/ml) 3 6 MIC Break-point Crescita Controllo (brodo + inoculo senza antibiotico) COLORIMETRIC RE INDICATOR Ninety-six-well microtitre plate for susceptibility of M. tuberculosis isolate using different redox-indicators (Alamar blue, resazurin or MTT). MIC is defined as the lowest drug concentration that prevents the change of colour. RMP KAN CAP OFX NO standard method A B C D E F G H Low MIC ug/ml Hight Growth Control, Isoniazid;, Streptomycin;, Ethambutol; RMP, Rifampicin;, Ethionamide; KAN, Kanamycin CAP, Capreomycin; OFX, Ofloxacin 7 days 37 C Broth Control A B C D E F G H A B C D E F G H Addition of the indicator Alamar blue or resazurin MTT (tetrazolium salt) Overnight 37 C A B C D E F G H A B C D E F G H Change of colour Blue to pink Yellow to violet , MICRODILUIZIONE IN BRODO MICOBATTERI A LENTA CRESCITA MOX 0, / /76 /3 /9 0./9. 0./.7 0./ , , POS POS ANTCROBICS Ciprofloxacin Moxifloxacin Linezolid Rifampin Trimet / sulfamet. Clarithromycin Amikacin Doxycycline Rifabutin Ethionamide Isoniazid 009 Ethambutol Streptomycin Positive Control Plate code MAISLOW SENSITITRE CUSTOM PLATE FORMAT VERSATREK DIAGNOSTIC Rivenditore per Italia: BIOMEDICAL SERVICE CONTROLLO DI QUALITA CLSI: ceppo MTB H37Rv (ATCC 79) sensibile a tutti i farmaci di d prima linea Utilizzo ceppi ATCC di MTB resistenti a Isoniazide,, e Pirazinamide non è una scelta ideale perché questi ceppi sono caratterizzati da una resistenza alle alte concentrazioni dei rispettivi farmaci. Il ceppo ideale per il CQ dei test che saggiano sia la concentrazione critica (bassa) che quella alta dovrebbe essere resistente alla prima e sensibile alla seconda. Un ceppo di riferimento con tali caratteristiche non è attualmente disponibile in commercio. Qualora disponibile utilizzare un ceppo isolato nella routine di laboratorio. orio. Sconsigliato l utilizzo l di ceppi MDR per motivi di sicurezza. Eseguire CQ per ogni nuovo lotto di terreno o farmaco. Una volta/settimana per laboratori che eseguono test giornalmente e o settimanalmente In parallelo a ciascun test di sensibilità quando eseguiti raramente CONTROLLO DI QUALITA ESTERNO I laboratori che eseguono la diagnostica dei micobatteri sono tenuti a partecipare ad una valutazione esterna di qualità per ogni aspetto della diagnostica erogata. Per quanto concerne i Test di sensibilità: INSTAND (Dusseldorf( Germania) Institute for Standardization and Documentation in the Medical Laboratory: 0 ceppi di MTC all anno anno in invii per esecuzione test di sensibilità farmaci prima scelta. Risposta entro mese. LABORATORIO SOPRANAZIONALE DI ERIMENTO O.M.S. per la sorveglianza dei ceppi tubercolari farmaco-resistenti resistenti ISS Roma. 0 ceppi di MTC ogni -3 3 anni per esecuzione test di sensibilità farmaci prima scelta. Risposta entro mesi. Partecipazione gratuita. 9

10 TEST DI SENSIBILITÀ PER MICOBATTERI NON TUBERCOLARI A CRESCITA LENTA Attualmente prevale la tendenza a considerare l esecuzione del test di sensibilità sui micobatteri non tubercolari a crescita lenta di scarsa utilità clinica per una serie di motivi: la maggioranza degli isolamenti sono clinicamente non significativi non esistono metodiche standardizzate per l'esecuzione dell'antibiogramma nella maggior parte dei casi non esiste alcuna correlazione fra i risultati ottenuti in vitro e la risposta del paziente al trattamento esistono per le specie di più frequente isolamento protocolli terapeutici dimostratisi efficaci in vivo in molti studi controllati. Secondo le indicazioni del CLSI, per un ristrettissimo numero di specie, l antibiogramma può essere eseguito, sia pur limitatamente ad uno o pochissimi farmaci ed utilizzando tecniche non standardizzate, nel caso in cui il paziente abbia dimostrato di non rispondere alla terapia praticata secondo i protocolli internazionali. Le specie a cui si riferiscono le raccomandazioni CLSI includono: M. avium complex, M. kansasii e M. marinum. ATS (American Thoracic Society) IDSA (Infectious Disease Society of America) Criteri diagnostici per le malattie polmonari da micobatteri non tubercolari I seguenti criteri sono applicabili a pazienti sintomatici con patologie infiltrative, nodulari o cavitarie, o con presenza ad una TAC ad alta risoluzione di bronchiectasie multifocali e/o piccoli noduli multipli Criteri Clinici (entrambi necessari). Sintomatologia polmonare, pneumopatia di tipo cavitario o non cavitario (lesioni nodulari o bronchiectasie multifocali). Esclusione di ogni altra possibile causa infettiva Criteri Microbiologici (solo uno necessario). Coltura positiva da almeno due differenti campioni di escreato. Coltura positiva da almeno un campione di broncoaspirato o di BAL 3. Una biopsia transbronchiale o polmonare che evidenzi caratteristiche istopatologiche patognomoniche (granulomi e/o bacilli alcol-acido resistenti) e che risulti positiva alla coltura per MNT, oppure una biopsia transbronchiale o polmonare che evidenzi caratteristiche istopatologiche patognomoniche associata ad uno o più escreati, o a lavaggio bronco-alveolare, positivi in coltura per MNT. Per una diagnosi di malattia polmonare tutti i 3 criteri, clinico, radiologico e microbiologico devono essere soddisfatti AST per Mycobacterium avium complex (MAC) Indicazioni non concordanti sulla necessità del test di sensibilità Raccomandazioni sull esecuzione del test nelle seguenti situazioni: Isolati clinicamente significativi da pazienti con precedente terapia con macrolidi Isolati da pazienti che sviluppano batteriemia mentre sono in profilassi con macrolidi Isolati da pazienti con ricadute mentre sono in terapia con macrolidi Isolati per la a volta da sangue o tessuti (pazienti con malattia disseminata) o da campioni respiratori clinicamente significativi (BAL o escreato). Ripetizione del test dopo 3 mesi (forma disseminata) e 6 mesi (malattia polmonare cronica) quando la sintomatologia non migliora e la coltura è ancora positiva. AST per Mycobacterium avium complex (MAC) I soli farmaci per i quali esiste una correlazione tra il test di sensibilità in vitro e la risposta clinica sono i macrolidi: Claritromicina ed Azitromicina Il test di sensibilità dovrebbe essere eseguito utilizzando un metodo a base di brodo: macro o microdiluizione. Il metodo della macrodiluizione in brodo con il sistema radiometrico Bactec incontra i favori della letteratura internazionale; esso consente di assicurare una certa affidabilità e riproducibilità dei risultati ed una risposta rapida. AST per Mycobacterium avium complex (MAC) Per l azitromicina la macrodiluizione è preferibile poiché la solubilità risulta meno problematica con grandi volumi di brodo. L attività dei macrolidi in vitro è migliore ad un ph E tuttavia accettabile anche un ph 6. (brodo BACTEC 60) E possibile alcalinizzare il terreno radiometrico del BACTEC 60 aggiungendo 0.3 ml di una soluzione al 3% di fostato tripotassico ai.0 ml del flacone B. Nella microdiluizione in brodo si possono utilizzare sia il brodo 7H9 sia il brodo Mueller Hinton addizionato di OADC o OAD. Incubazione a 37 C e lettura dal 7 al giorno. CONCENTRAZIONI DI FARMACI per MAC con BACTEC 60 TB Farmaco Sol. madre Solvente/Diluente Soluzione di Concentrazione (mg/ml) lavoro (ug/ml) finale (ug/ml) Claritromicina (ph 6.) Claritromicina (ph ) Azitromicina (ph 6.) Metanolo Metanolo Etanolo Interpretazione MIC Sensibile Intermedio Resistente (ph 6.) 6 ug/ml 3 ug/ml 6 ug/ml (ph ) ug/ml -6 ug/ml 3 ug/ml AZT (ph 6.) ug/ml 6 ug/ml ug/ml 0

11 Amikacina Ciprofloxacina Clofazimina Rifabutina Streptomicina CONCENTRAZIONI DI FARMACI per MAC con BACTEC 60 TB Farmaco Sol. madre Solvente/Diluente Soluzione di Concentrazione (mg/ml) lavoro (ug/ml) finale (ug/ml) distillata distillata Dimetil-sulfossido distillata Metanolo Metanolo distillata Analisi retrospettive non hanno evidenziato correlazioni tra i risultati dei test in vitro ed outcome clinico Diluting Fluid McFarland C 0. ml 999 AST per MAC con BACTEC 60 TB ml 0. ml C C 0. ml C ug/ml 0 0. ml 0. ml 0. ml + 6 ug/ml + 6 ug/ml CONTROLLO RESISTENZA SENSIBILITA 0 CONTROLLO DI QUALITA M. aviun ATCC 7009 ceppo raccomandato Metodo radiometrico Le concentrazioni di Claritromicina ed Azitromicina da utilizzare per il CQ sono diverse da quelle utilizzate per gli isolati clinici. Claritromicina ph 6,: Claritromicina ph 7,3 7,: Azitromicina ph 6,: Range di accettabilità dei risultati: Claritromicina ph 6,: Claritromicina ph 7,3 7,: Azitromicina ph 6,:,, ug/ml 0,,, ug/ml, 6, 3 ug/ml - ug/ml 0,- ug/ml -3 ug/ml AST per Mycobacterium kansasii I farmaci clinicamente attivi contro il M. kansasii sono: Isoniazide Rifabutina usata nei pazienti HIV in terapia (inibitori proteasi) Test di sensibilità solitamente NON NECESSSARIO per impostare terapia se si tratta di prima infezione (ceppo selvaggio) Test di sensibilità indicato nei pazienti con fallimento terapeutico o risposta non soddisfacente alla terapia iniziale Metodi da utilizzare: Sistema BACTEC 60 Metodo delle proporzioni in Middlebrook 7H0 agar Microdiluizione in brodo (7H9 o Mueller Hinton + cationi + OAD) AST per Mycobacterium kansasii Le concentrazioni critiche per MTC di ( ug/ml) ed ( ug/ml) inibiscono entrambe i ceppi selvaggi di M. kansasii, con buone correlazioni tra i sistemi in brodo e quello in Middlebrook 7H0 agar. Al contrario, le MIC dei ceppi selvaggi di M. kansasii per Isoniazide variano in un range da 0. a.0 ug/ml. Per tale ragione la concentrazione critica standard per MTC di 0. ug/ml in Middlebrook 7H0 agar invariabilmente evidenzia resistenza e la concentrazione.0 ug/ml da risultati variabili anche con colture multiple dello stesso isolato. Pertanto, il test per l Isoniazide non è raccomandato con queste concentrazioni. Poiché il fallimento terapeutico è associato alla comparsa di resistenza alla, questo è correntemente il solo farmaco raccomandato in un primo test di sensibilità Per gli isolati resistenti alla, altri farmaci possono essere testati, anche se le esperienze sono limitate. Farmaco Rifabutina Isoniazide Trimetoprim - sulfametossazolo Sulfametossazolo AST per Mycobacterium kansasii Concentrazione critica (µg/ml) per ciascun metodo Agar 7H0 a Streptomicina Claritromicina b Amikacina 3 Ciprofloxacina c BACTEC 60 TB Microdiluizione in brodo a: può essere impiegato anche il metodo di agar eluizione da disco; b: la claritromicina può essere utilizzata come rappresentante di classe dei nuovi macrolidi (claritromicina e azitromicina) c: la ciprofloxacina può essere utilizzata come rappresentante di classe dei vecchi fluorochinoloni, ma non è rappresentativa dei nuovi (gatifloxacina, moxifloxacina) /3 3

12 CONTROLLO DI QUALITA Ceppi ATCC raccomandati per il CQ dei test di sensibilità di M. kansasii alla rifampicina e relativi range di accettabilità dei risultati: M. kansasii ATCC 7 M. marinum ATCC 97 Enterococcus faecalis ATCC 9 range: ug/ml range 0,- ug/ml range: 0,- ug/ml AST per Mycobacterium marinum Farmaci usati con successo nel trattamento monoterapico di infezioni da M. marinum: Doxiciclina Trimetoprim-Sulfametossazolo Minociclina Claritromicina Il test di sensibilità per M. marinum può essere considerato solo per pazienti con fallimento terapeutico che dopo diversi mesi presentano ancora colture positive. Metodi da utilizzare: delle proporzioni in Middlebrook 7H0 agar Agar disk elution Microdiluizione in brodo ( Mueller Hinton + cationi + OAD) Metodo radiometrico, valutato solo su un piccolo numero di isolati Farmaco Doxiciclina/minociclina Claritromicina a Amikacina Sulfametossazolo AST per Mycobacterium marinum Trimetoprim - sulfametossazolo Concentrazione critica (mg/ml) per ciascun metodo Agar 7H0 Temperatura ottimale di incubazione -30 C. Periodo incubazione 7 giorni. Disco eluizione 6 0 Microdiluizione in brodo a: la claritromicina può essere utilizzata come rappresentante di classe dei nuovi macrolidi (claritromicina e azitromicina) 6 3 /3 3 Farmaco Isoniazide Amikacina Ciprofloxacina Doxiciclina Minociclina AST mediante AGAR ELUIZIONE DA DISCO PER MNT A LENTA CRESCITA Trimetoprimsulfametossazolo Concentrazi one critica (µg/ml) Streptomicina 0 0 Claritromicina a 30 3,7/, No. di dischetti in ml di terreno a: la claritromicina può essere utilizzata come rappresentante di classe dei nuovi macrolidi (claritromicina e azitromicina) Concentrazione finale nel pozzetto (µg/ml) 9,/0, 6 6 AST per MICOBATTERI NON TUBERCOLARI A LENTA CRESCITA Numerosi altri micobatteri non tubercolari a lenta crescita possono causare patologie nell uomo. M. terrae/nonchromogenicum M. xenopi M. malmoense M. simiae Il test di sensibilità dovrebbe includere gli stessi farmaci di prima e seconda scelta indicati per il M. kansasii e gli stessi criteri interpretativi. Per diverse specie di micobatteri a lenta crescita fastidious associate a patologie umane, sono stati eseguiti test di sensibilità. M. haemophilum (richiede citrato di ammonio ferrico per la crescita) M. genavense (richiede incubazione > 6 sett. con il sistema Bactec 60 TB) M. ulcerans (richiede incubazione da a 6 settimane) Troppo poco è conosciuto su queste specie per raccomandare un metodo standard per ATS. AST per MICOBATTERI A RAPIDA CRESCITA Test di sensibilità e interpretazione dei risultati più simili a quelli relativi ad altri batteri aerobi che non ai micobatteri a lenta crescita. Questi micobatteri sono resistenti alla maggior parte dei farmaci antitubercolari, ma possono essere sensibili ad alcuni farmaci comunemente usati nelle infezioni batteriche. METODO STANDARD (CLSI): MICRODILUIZIONE IN BRODO

13 AST per MICOBATTERI A RAPIDA CRESCITA Eseguire AST su tutti i primi isolamenti da sangue, tessuti, cute. Quando isolati da escreato è necessario valutarne accuratamente il significato clinico escludendo una possibile contaminazione o colonizzazione. Fattori da considerare nella valutazione dell importanza clinica del ceppo isolato dall'escreato sono: isolamento da campioni multipli isolamento da un campione con esame microscopico positivo presenza di un elevato numero di colonie su terreno solido Se una sola coltura positiva, è estremamente improbabile che l isolato abbia significato clinico e pertanto non esiste indicazione all esecuzione del test di sensibilità. La mancata eradicazione, dopo sei mesi di appropriata terapia, di un micobatterio a rapida crescita da un sito corporeo diverso da quello respiratorio richiede la conferma dell identificazione a livello di specie e la ripetizione del test di sensibilità. CONCENTRAZIONI DI FARMACI PER MICOBATTERI A RAPIDA CRESCITA Farmaco Amikacina Cefoxitina Ciprofloxacina a 0,-6 Claritromicina b 0,06-6 Doxiciclina Imipenem Linezolid Sulfametossazolo Trimetoprim-sulfametossazolo Tobramicina Range di concentrazione (µg/ml) - 0, ,6/-/6-3 Interpretazione delle MIC (µg/ml) Sensibile 6 3 /3 Intermedio 3-6 Resistente /6 a: rappresentante della classe dei vecchi fluorochinoloni, ma meno attivo di gatifloxacina e moxifloxacina; b: rappresentante della classe dei nuovi macrolidi (claritromicina e azitromicina) 6 0./ / AST MICRODILUIZIONE IN BRODO MICOBATTERI A RAPIDA CRESCITA / /3 3 / / AXO MIN AUG / TOB AXO MIN AUG 6/ 6 TOB AXO 6 MIN AUG 3/ TOB AXO 3 MIN AUG 6/ TOB 6 6 AXO 6 NEG POS AXO MIN AUG TOB NEG POS ANTCROBICS Trimet / sulfamet Ciprofloxacin Cefoxitin Doxycycline Tigecycline Amikacin Cefotaxime Gentamicin Linezolid Imipenem Cefepime Clarithromycin Ceftriaxone Minocycline Amoxicillin / clav.. acid Tobramycin Negative Control Positive Control Plate code RGMYCO SENSITITRE CUSTOM PLATE FORMAT VERSATREK DIAGNOSTIC Rivenditore per Italia: BIOMEDICAL SERVICE 009 CONTROLLO DI QUALITA Il ceppo di riferimento ideale per il controllo di qualità del test di microdiluizione in brodo dovrebbe presentare MIC intermedie per tutti i farmaci Farmaci e valori di MIC (µg/ml) accettabili per i ceppi di controllo relativi al metodo di microdiluizione in brodo per RGM Farmaco Amikacina Cefoxitina Ciprofloxacina Claritromicina Doxiciclina Imipenem Linezolid Sulfametossazolo Trimetoprim-sulfametossazolo Tobramicina a: dati non disponibili Range di MIC (µg/ml) per M. peregrinum ATCC ,-0, 0,06-0, 0,-0, 0,-0, - - /6-/6 - Range di MIC (µg/ml) per S. aureus ATCC ,-0, 0,-0, 0,-0, ND a - 3- /3-/ 0,- E test per MICOBATTERI A RAPIDA CRESCITA E un metodo quantitativo per la determinazione della sensibilità ai farmaci. Consiste in una sottile striscia di plastica inerte e porosa che presenta su una faccia una scala di lettura graduata mentre sull altra è immobilizzato, in un gradiente esponenziale predefinito, il farmaco essiccato e stabilizzato. Sensibile o Resistente? PIAA DI MUELLER HINTON AGAR + OADC 0. Mc Farland 0. CL AK Incubazione a 37 C Lettura dopo 3 giorni Grazie per l attenzione 3