Margini di errore e variabilità. nei test del DNA. Laboratorio di Scienze Criminalistiche. Carlo Robino. Università di Torino

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1 Margini di errore e variabilità nei test del DNA Carlo Robino Laboratorio di Scienze Criminalistiche Dipartimento di Anatomia, Farmacologia e Medicina Legale Università di Torino

2 Tutto quello che avreste voluto sapere dal test del DNA* * Ma non dovreste osare chiedere

3 apparenti incompatibilità genotipiche tra diversi campioni biologici di un medesimo individuo artefatti di PCR (LCN DNA) Perdita di un allele Perdita di un allele > cicli di PCR replica dei dati ogni genotipo omozigote potenzialmente eterozigote Sbilanciamento allelico

4 instabilità di microsatelliti (MSI) e perdita di eterozigosità (LOH) in tessuti neoplastici campione presunto padre: biopsia vescicale inclusa in paraffina (1992) con dx istologica di carcinoma transizionale papillare grado I-II di Koss, non infiltrante STR Presunto padre Figlio Madre TH TPOX FES/FPS CSF1PO D8S D13S LOH? mutazione germinale? non paternità?

5 discrepanze tra diversi kit impiegati per PCR multiplex di STR in un campione di popolazione filippina (n=140) tredici incosistenze per il locus D8S1179 tra PP16 (genotipi eterozigoti) e ProfilerPlus (genotippi omozigoti): mutazione nel binding site di ProfilerPlus con dropout allelico inclusione di un secondo reverse primer per D8S1179 in Identifiler Leibelt et al Forensic Sci Int 2003

6 nomenclatura dicano i consulenti, previo esame della documentazione in atti e acquisita eventualmente ogni altra documentazione presso enti pubblici e privati, se il DNA estratto dai reperti e analizzato nell ambito del procedimento avente ad oggetto l omicidio commesso nei confronti di xxx, risulti o meno compatibile con il profilo genetico dell indagato yyy * Urquhart et al Int J Legal Med 1994 ** Moller et al Int J Legal Med 1994 Caso A Caso B STR SGM plus Powerplex 16 D3S ;15 15;15 TH01 6;9 6;9 D21S11 59;61* 27;28** D18S51-14;20 Amel X;Y X;Y vwa 17;17 17;17 D8S ;15 12;15 FGA - 20;24 D16S539 11;12 11;12 D19S433 13;15 - D2S

7 eteroplasmia mtdna le cellule del follicolo pilifero hanno un origine pressochè clonale, perciò è possibile osservare in singoli peli di un individuo aplotipi mitocondriali diversi da quello di un campione di riferimento (sangue, saliva) per mutazioni avvenute nel follicolo o per segregazione nel pelo di una sola variante eteroplasmica la frequenza relativa di due sequenze eteroplasmiche varia all interno del fusto di uno stesso pelo Tully et al. Forensic Sci Int 2004 nomenclatura mtdna in corrispondenza di tratti di sequenza che mostrano polimorfismi di lunghezza (Bandelt et al Int J Legal Med 2007)

8 valutazione di ipotesi di consanguineità indagine genetica di paternità stragiudiziale (via internet): esclusione ripetuta in sede giudiziale: paternità praticamente provata sostituzione dolosa dei campioni al momento della raccolta/spedizione? scambio di DNA nel laboratorio analizzatore? LR Full sibs/unrelated: 4.5 (81.8%) LR 2nd degree/unrelated: 21.0 (95.5%) Presciuttini et al BMC Genetics 2002??? madre D8S ,13 13,15 D21S11 29,29 29,30.2 D7S820 11,12 11,11 CSF1PO 10,11 10,12 D3S ,16 15,16 TH01 6,8 6,9.3 D13S317 8,12 8,11 D16S539 11,11 9,11 D2S ,20 18,24 D19S433 13, ,15 vwa 18,18 17,18 TPOX 8,11 11,11 D18S51 13,17 12,15 D5S818 12,13 12,13 FGA 21,26 23,26

9 Sesso dell individuo che ha depositato la traccia biologica Possibili mutazioni nel primer binding site F M In alcune popolazioni percentuale relativamente alta di soggetti di sesso maschile il cui cromosoma Y presenta delezioni in corrispondenza del locus dell Amelogenina: nepalesi 6.5% (Cadenas et al Forensic Sci Int 2007) indiani 3.6% (Chang et al J Forensic Sci 2003) (M) F M (M) M F Scorretta identificazione del genere del soggetto che ha lasciato la traccia!

10 Origine etnica del soggetto che ha depositato la traccia In generale, le stesse varianti alleliche di STR autosomici sono diffuse in tutte le popolazioni. Vi è una certa variabilità tra popolazioni nella distribuzione delle frequenze alleliche, tuttavia un profilo raro nella popolazione A sarà raro anche in quella B ; analogamente un profilo frequente in A lo sarà anche in B Probabilità d assegnare un profilo genetico alla corretta popolazione, in base alla variabilità interetnica di STR autosomici Chakraborty et al Electrophoresis 1999 Lowe et al Forensic Sci Int 2001

11 Una più precisa assegnazione etnica è possibile mediante marcatori a più lento tasso di mutazione (SNP) posti sul cr. Y o nel mtdna Y-SNP mtdna Joblin et al Nature Rev Genet

12 In assenza di ricombinazione, la diversità aplotipica di soggetti che condividono un medesimo aplogruppo è limitata alle mutazioni accumulatesi nel corso delle generazioni a partire dall aplotipo caratteristico del soggetto fondatore dell aplogruppo aplotipi Y-STR hanno una distribuzione sovrapponibile a quella dei rispettivi aplogruppi Aplogruppo E3b2 Aplotipo modale entro E3b2 DYS19:13; DYS389I:14; DYS389II:30; DYS390:24; DYS391:9/10; DYS392:11; DYS393:13

13 Genotipo Vs. Fenotipo Il 45% della popolazione urbana di Buenos Aires possiede un aplogruppo mitocondriale tipicamente amerindio (Martinez et al Hum Biol 2004) Il 20% della popolazione araboalgerina urbana (Orano) possiede un cromosoma Y tipicamente europeo o subsahariano

14 Caratteri antropometrici a determinazione genetica semplice capelli rossi 8 SNP di MC1R (il gene regolatore della sintesi della melanina) responsabili del colore rosso dei capelli 100% dei soggetti omozigoti per un SNP hanno capelli rossi 94% dei soggetti eterozigoti per due SNP hanno capelli rossi 12% dei soggetti eterozigoti per un SNP hanno i capelli rossi Grimes et al. Forensic Sci Int 2001

15 Epoca di deposizione di una traccia dicano i periti, esaminati gli atti e compiuto ogni accertamento che sarà ritenuto opportuno, l arco temporale entro il quale tracce biologiche aventi le caratteristiche riscontrate sui fazzolettini in sequestro possano permanere all aria aperta ed all esposizione degli agenti atmosferici e, comunque, nel luogo in cui furono rinvenuti i reperti stessi la qualità di un profilo genetico dipende dal grado di integrità delle molecole di DNA estraibili da una traccia; la degradazione del DNA non è però un fenomeno correlato al tempo, bensì alle condizioni ambientali di conservazione del reperto (temperatura, umidità, azione di microorganismi, etc ) mozzicone di sigaretta fumato 5 anni prima dell analisi mozzicone di sigaretta fumato 1 giorno prima dell analisi

16 A meno che Indagato vittima Indagato vittima Indagato #3 #3 #3 Vittima #5 #5 Vittima #5 #5 Vittima #7 #6 Vittima

17 Modo di deposizione di una traccia (Lowe et al Forensic Sci Int 2002) Tendenza a depositare il proprio DNA buoni depositatori ( BD ) cattivi depositatori ( CD ) Phipps et al (FSI 2006): impossibile distinguere BD e CD (differenze nell estrazione di DNA? nell allestimento dell esperimento?) T dopo il lavaggio delle mani 0m 15m 2h 6h Trasferimento secondario DNA dell individuo A ( BD ) Individuo B ( CD ) Oggetto

18 Natura della traccia biologica metodi chimico-enzimatici: di semplice esecuzione molto sensibili poco specifici Violenza sessuale su minore slip con tracce positive al test per α amilasi profilo genetico misto vittima (F) / indagato (M) saliva? urina e sudore? saliva di F o di M? Aree picchi M/F Attività α amilasi Barni et al J Forensic Sci 2006

19 Metodi immunologici Ab anti HB, PSA, α-amilasi Specie-specifici (primati) Falsi positivi (altri liquidi biologici umani) Falsi negativi (high dose hook effect) Positivi su macchie secche di antica data Possibili negativi: trattamento con SDS, detergenti ionici, candeggina Metodi biomolecolari (RT-PCR con sonde TaqMan per mrna tessutospecifici: α-hb, callicreina, mucina) (Nussbaumer et al Forensic Sci Int 2006) Stabilità mrna Specificità B B B SP SP SP V V V S S S Ciclo soglia Sangue <12h Sangue 10 gg Sperma <12h Sperma 10 gg S. vagina <12h S. vagina 10 gg Saliva <12h Saliva 10 gg mucina callicreina α Hb

20 Molto spesso non è possibile stabilire con certezza la natura del materiale cellulare dal quale si estrae il DNA, in particolar modo quando si effettuano campionature casuali da indumenti o dalla superficie di oggetti (si può ipotizzare che si tratti in genere di cellule epidermiche di sfaldamento) dica il C.T. se gli indumenti siano utilmente indagabili al fine di reperire tracce biologiche segnatamente di urina- e, in caso positivo, se le stesse siano riferibili a o ad altri soggetti non ci sono test certi per la diagnosi di natura di urina (PSA?, urobilinogeni?) la traccia gialla è della vittima? Profilo della vittima Tracce di urina secca non sono certamente campioni ideali da cui estrarre DNA!

21 Interpretazione tracce miste DNA commission of the ISFG. Recommendations on the interpretation of mixtures. Forensic Sci Int 2006 studio interlaboratorio NIST su tracce miste F/M ( ) il 69% dei laboratori estrapola correttamente il profilo maschile in una traccia M/F 3:1 (profilo F noto) il 10% estrapola correttamente il un profilo maschile ignoto da una traccia contenente tre diversi DNA, F/M1/M2 2:1:1 (profilo F e M1 noti) (Duewer et al. J Forensic Sci 2001) studio interlaboratorio NIST su profili misti F/M ( ) 94 laboratori hanno aderito 69 hanno inviato risultati 50 hanno estrapolato il profilo M (profilo F noto) 39 hanno stimato il rapporto tra DNA femminile e maschile Butler et Al 16 th ISHI, Grapevine TX 2005

22 Interpretazione DNA LCN / degradato studio interlaboratorio EDNAP su DNA degradato (0-16 settimane) Dixon et al Forensic Sci Int 2006 studio interlaboratorio EDNAP su DNA degradato (<200 bp) Schneider et al Forensic Sci Int 2004 n di cicli di PCR (28-36) input di DNA ( ng) soglia di lettura dei picchi allelici negli elettroferogrammi

23 Interpretazione mtdna studio interlaboratorio GEP su mtdna sangue / fusto di pelo Crespillo et al Forensic Sci Int 2006 solo 34 laboratori su 93 inviano risultati (anche parziali) 93-97% dei laboratori tipizzano correttamente le tracce di sangue 28 laboratori inviano risultati HV1+HV2 per pelo (23 tipizzano correttamente) studio interlaboratorio GEFI (Turchi C et al, submitted) 11 laboratori partecipanti, 9 tipizzano correttamente 2 tracce di sangue di controllo dopo cross-check 437 campioni selezionati per EMPOP 35 campioni esclusi da EMPOP per: scarsa qualità sequenze, mancanza di uno strand, ricombinazione artificiale 402 campioni superano il controllo EMPOP ma Più del 25% dei 67 clerical errors (16.6%) dati originali 27 errori di nomenclatura (6.7%) presentava degli 7 eteroplasmie non evidenziate (1.7%) errori!