IL DNA fingerprinting

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1 IL DNA fingerprinting It has long been an axiom of mine that the little things are infinitely the most important Sherlock Holmes

2 IL DNA fingerprinting è attualmente la tecnica più potente per identificare un campione biologico. Viene utilizzata dal 1984 in medicina forense (medicina legale) per risolvere casi legali: attribuzione di paternità, casi di omicidi, casi di stupri, ecc. La Genetica forense, ossia l applicazione della Genetica nella risoluzione dei casi legali, si avvale della variabilità del genoma umano per identificare un individuo, o meglio per attribuire un campione biologico ad un unico individuo.

3 Quali sono i campioni biologici più frequentemente reperibili sulla scena di un crimine?

4 REPERTI DA CUI E POSSIBILE ESTRARRE IL DNA sangue liquido seminale tessuti organici saliva sudore ossa denti fibre pilifere urina feci

5 L evoluzione della Genetica forense: la storia dei marcatori genetici 1) Il sistema del gruppo sanguigno AB0, scoperto nel 1900 da Karl Landsteiner. Locus multiallelico: I A, I B, i Moglie Anna, I A i Gruppo A Figlio Conclusione: Giovanni NON è il figlio di Pasqule Marito Pasquale, I A I B Gruppo AB Giovanni, i i Gruppo 0 NON identità genetica: ESCLUSIONE

6 2) Variabilità elettroforetica delle proteine del siero Svantaggi: Le proteine si degradano facilmente Bassa variabilità, quindi poco informative 3) Variabilità del genoma umano: il DNA fingerprinting a) Minisatelliti/VNTR b) Microsatelliti/STR Vantaggi: Il DNA è pù stabile delle proteine Maggiore variabilità, quindi più informativo

7 Classificazione del DNA satellite Tipo di ripetizione Livello di ripetizione per locus N di loci Lunghezza dell unità ripetuta (bp) Satellite o 2 per chr Minisatellite Migliaia per genoma Microsatellite Fino a 10 5 per genoma 1-6

8 1984. Il Dr Alec Jeffreys i suoi collaboratori, dell Università di Leicester, in Inghilterra, mettono in evidenza l esistenza di profili individuali (il fingerprinting del DNA) e dimostrano, con le loro analisi, l esistenza di una relazione familiare cioè di una compatibilità ereditaria risolvendo una disputa in un caso di immigrazione (Jeffeys et al., 1985, Nature 314: 67-73; Jeffeys et al, 1985 Nature 316: 76-9 ; Jeffrey et al., 1985, Nature 317: 818-9)

9 I minisatelliti VNTR: Variable Number Tandem Repeat Brevi sequenze di DNA (da bp) ripetute in tandem numerose volte (centinaia o anche migliaia di volte) e in più loci cromosomici. Il numero di ripetizioni è altamente variabile nei diversi individui VNTR

10 da Brooker, Genetica, ed. Zanichelli VNTR

11 Multi-loci RFLP-VNTR Questo metodo di fingerprinting viene definito: Multilocus RFLP-VNTR RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) indica che, a causa del numero variabile di ripetizioni, vengono creati dal taglio con un enzima di restrizione, frammenti di DNA di diverse dimensioni. da Snustad-Simmons, Principi di Genetica, Edises II ed. VNTR

12 Single-locus RFLP-VNTR VNTR

13 Se si applica lo stesso protocollo sperimentale di Jeffreys et al. e si utilizza come sonda una Singlelocus VNTR verranno individuati: a) due frammenti se l individuo è eterozigote (ha ricevuto dai genitori DNA con numero diverso di ripetizioni); b) un unico frammento se l individuo è omozigote (ha ricevuto da entrambi i genitori DNA con lo stesso numero di ripetizioni) VNTR

14 Il vantaggio del singlelocus RFLP-VNTR è dovuto ad una più facile interpretazione dei risultati grazie ad un profilo con un numero limitato di bande Negli Stati Uniti viene ammessa per la prima volta in tribunale un analisi con RFLP, in un caso di stupro (Stato della Florida contro Tommy Lee Andrews). Nello stesso anno anche Colin Pitchfork viene incriminato per duplice omicidio nella regione del Leicestershire (UK) grazie ad un analisi di single-locus RFLP- VNTR VNTR

15 Single-locus RFLP-VNTR Esempio di impiego di un single-locus RFLP-VNTR per determinare l identità di uno stupratore tra due individui sospetti. D = profilo genetico della vittima A e C = profilo genetico dei due individui sospetti

16 Vantaggi: Riproducibilità Elevato potere discriminatorio Svantaggi: Richiede quantità discrete di DNA (50-500ng) e quindi il non potere essere utilizzato a partire da tracce biologiche Richiede tempi abbastanza lunghi. VNTR

17 Si sono quindi cercate, per l analisi del fingerprinting, nuove regioni ripetute nel DNA ma sufficientemente brevi per potere essere amplificate per PCR anche in caso di degradazione parziale del DNA: microsatelliti / STR (Short Tandem Repeat polymorphism) Vantaggi: Più rapido Più sensibile Più efficace nei casi di campioni biologici misti STR

18 Esempio di STR: HUNTH aaatccatcc aaaaaatcca agatggccag aggtccccgg ctgctgcacc cagcccccac 961 cctactccca cctgcccctg cctccctctg ccccagctgc cctagtcagc accccaacca 1021 gcctgcctgc ttggggaggc agccccaagg cccttcccag gctctagcag cagctcatgg 1081 tggggggtcc tgggcaaata gggggcaaaa ttcaaagggt atctgggctc tggggtgatt 1141 cccattggcc tgttcctccc ttatttccct cattcattca ttcattcatt cattcattca 1201 ttcattcacc atggagtctg tgttccctgt gacctgcact cggaagccct gtgtacaggg 1261 gactgtgtgg gccaggctgg ataatcggga gcttttcagc ccacaggagg ggtcttcggt 1321 gcctccttgg gcactcagaa ccttgggctc cctggcacat ttaaaatggg tttttattta 1381 tggaccttga ttgaaatgtg gtgtgagttg tagcagtgtc atttccaggt accttctcag L amplificazione di una STR darà origine a due bande se l individuo è eterozigote un'unica banda se l individuo è omozigote STR

19 Tappe dell analisi del DNA fingerprinting mediante STR Estrazione del DNA dal reperto biologico Amplificazione degli SRT Corsa elettroforetica Procedura manuale o Procedura automatizzata Validazione statistica STR

20 Gli STRs utilizzati nel DNA fingerprinting umano ENFSI CODIS (7 loci) (13 loci) TH01 TH01 D21S11 D21S11 D18S51 D18S51 vwa vwa FGA FGA D8S1179 D8S1179 TPOX CSF1PO D16S539 D7S820 D13S317 D5S818 D3S1358 D3S1358 ENFSI (European Network of Forensic Science Institutes) CODIS (Combinated DNA Index System) della FBI. Nel corso del tempo è aumentato il n di STRs analizzati per migliorare il potere di discriminazione della tecnica

21 Identificazione del sesso nell analisi degli STR L allineamento tra il gene dell amelogenina umana presente sul cromosoma X il gene dell amelogenina umana presente sul cromosoma Y ha messo in evidenza alcune differenze In particolare c e una regione lunga 106 bp sull X 112 bp sull Y L amplificazione di questa regione permette di distinguere tra (X X): se c è una unica banda da 106 bp (X Y): se ci sono due bande, una da 106 bp e una da 112 bp e

22 Amplificazione degli STRs nella procedura automatizzata Per potere distinguere i prodotti di amplificazione dei singoli STR i primers per l amplificazione sono legati a diverse molecole fluorescenti (generalmente da 3 a 5). Primers che legano una stessa molecola fluorescente amplificano regioni di diversa dimensione e quindi non confondibili.

23 Elettroferogramma di un profilo di STR autosomici

24

25 Sample injection Sample separation Ar + LASER (488 nm) Mixture of dye-labeled PCR product from Multiplex PCR reaction Fluorescence ABI Prism spectrograph Sample Detection CCD Panel Color Separation Il capillare, che contiene una soluzione polimerizzante, è dotato di una finestrella attraverso la quale il laser eccita ad una precisa lunghezza d onda il campione di DNA marcato con un determinato fluoroforo che ne permette l identificazione. Capillary

26 Le bande, la cui dimensione dipende dal numero di ripetizioni, vengono trasformate in picchi.

27 Un vantaggio introdotto negli ultimi anni nella tecnica del DNA fingerprinting è che i picchi degli elettroferogrammi vengono convertiti in un formato numerico che si presta bene alla creazione di una banca dati di profili genetici di individui già incriminati.

28 Tipi di DNA DNA nucleare DNA mitocondriale

29 MARCATORI GENETICI ATTUALMENTE UTILIZZABILI STR AUTOSOMICI STR ASSOCIATI AL CROMOSOMA Y: DYS19, DYS390, DY389 I E II DYS391, DYS392, DYS393, DYS385, DYS388 (MATERIALE MISTO MASCHILE E FEMMINILE LEGATO A VIOLENZE SESSUALI ) SNP NUCLEARI E MITOCONDRIALI

30 Human genetic markers used in forensic analysis: advantages and disadvantages Jobling and Gill, 2004 Nature Review Genetics

31 Validazione statistica degli STRs umani Se confronto profili individuali: NON identità genetica: ESCLUSIONE IDENTITA genetica: COMPATIBILITA In quest ultimo caso, viene effettuata un analisi statistica dei risultati ed infine viene fornita una percentuale di attribuzione che sarà tanto più prossima al 100% quanto maggiore sarà il numero di regioni del DNA analizzate. Numerose STR sono state validate e se ne é stabilito nelle diverse popolazioni umane la frequenza delle singole ripetizioni. Generalmente l analisi da 9 a 15 STR consente di raggiungereuna percentuale di attribuzione superiore al 99,9999%. (Hammond et al, 1994 Am J Hum Genet 55: ; Garofano et al, 1998 J Forensic Sci 43: ; Garofano et al., 1998 Forensic Science Int. 97: 53-60) Il più importante limite dell analisi del DNA in criminalistica dai gemelli monozigotici. è rappresentato

32 Testi consigliati John M. Butler "Forensic DNA typing: biology and technology behind STR markers". 1a ed ACADEMIC PRESS 2001 N. Rudin and K. Inman, An introduction to Forensic DNA analysis Second edition CRC Press 2002

33 Indirizzi web utili ENSFI CODIS DNA e crimine ources_index.html sources.html htm

34 Condizioni di PCR per amplificare gli STR Name Chr position amplification primers PCR product size PCR conditions TPOX 2 F: CACTAGCACCCAGAACCGTC 126 bp ( ) R: CCTTGTCAGCGTTTATTTGCC D3S F: ACTGCAGTCCAATCTGGGT 127 bp (99-147) R: ATGAAATCAACAGAGGCTTGC FGA 4 F: GCCCCATAGGTTTTGAACTCA 192 bp ( ) R: TGATTTGTCTGTAATTGCCAGC D5S818 5 F: GGGTGATTTTCCTCTTTGGT 157 bp ( ) R: TGATTCCAATCATAGCCACA CSF1-PO 5 F: AACCTGAGTCTGCCAAGGACTAGC 200 bp R: CATTTCCTGTGTCAGACCCTGTTC D7S820 7 F: TGTCATAGTTTAGAACGAACTAACG 222 bp ( ) R: CTGAGGTATCAAAAACTCAGAGG D8S F: TTTTTGTATTTCATGTGTACATTCG 177 bp ( ) R: CGTAGCTATAATTAGTTCATTTTCA HUMTH01 11 F: GTGGGCTGAAAAGCTCCCGATTAT 170 bp ( ) R: GTGATTCCCATTGGCCTGTTCCTC HUMvWA 12 F: CCCTAGTGGATGATAAGAATAATCAGTATG 154 bp R: GGACAGATGATAAATACATAGGATGGATGG D13S F: ACAGAAGTCTGGGATGTGGA 170 bp ( ) R: GCCCAAAAAGACAGACAGAA D16S F: GATCCCAAGCTCTTCCTCTT 157 bp ( ) R: ACGTTTGTGTGTGCATCTGT D21S11 21 F: ATATGTGAGTCAATTCCCCAAG 205 bp ( ) R: TGTATTAGTCAATGTTCTCCAG Amelogenin X, Y F: CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTG 106/112 / R: ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG 55 C T annealing e 1.5 mm MgCl 2 Perizia SMCV Gennaio 2007

35 - Controllo - Cristina - Fratello Cristina - Laurentium - Laurentium padre - Controllo - Cristina - Fratello Cristina - Laurentium - Laurentium padre - Controllo - Cristina - Fratello Cristina - Laurentium - Laurentium padre GEL 1 8% TPOX Chr 2 D3S1358 Chr 3 Amelogenina Chr X e Y Perizia SMCV Gennaio 2007

36 - Controllo - Cristina - Fratello Cristina - Laurentium - Laurentium padre - Controllo - Cristina - Fratello Cristina - Laurentium - Laurentium padre - Controllo - Cristina - Fratello Cristina - Laurentium - Laurentium padre GEL 2 6% D5S818 Chr 5 HUMVWa Chr 12 D16S539 Chr 16 Perizia SMCV Gennaio 2007

37 - Controllo - Cristina - Fratello Cristina - Laurentium - Laurentium padre - Controllo - Cristina - Fratello Cristina - Laurentium - Laurentium padre - Controllo - Cristina - Fratello Cristina - Laurentium - Laurentium padre GEL 3 6% D8S1179 Chr 8 HUMTH01 Chr 11 D13S317 Chr 13 Perizia SMCV Gennaio 2007

38 - Controllo - Cristina - Fratello Cristina - Laurentium - Laurentium padre - Controllo - Cristina - Fratello Cristina - Laurentium - Laurentium padre GEL 4 6% FGA Chr 4 CSF1-PO Chr 5 Perizia SMCV Gennaio 2007

39 - Controllo - Cristina - Fratello Cristina - Laurentium - Laurentium padre - Controllo - Cristina - Fratello Cristina - Laurentium - Laurentium padre GEL 5 6% D7S820 Chr 7 D21S11 Chr 21 Perizia SMCV Gennaio 2007

40 Microsatellite Cristina Fratello Cristina Laurentium Padre Laurentium Controllo TPOX D3S FGA D5S CSF D7S D8S HUMTH HUMv D13S D16S D21S , Amelogenin X - X X - Y X - Y X - Y X - X Perizia SMCV Gennaio 2007