Biologia e genetica di popolazioni in ambito forense, dalla traccia biologica alle ultime metodiche per lo studio dei polimorfismi STR's

Transcript

1 Biologia e genetica di popolazioni in ambito forense, dalla traccia biologica alle ultime metodiche per lo studio dei polimorfismi STR's Dott. Giorgio Portera Dip. di Biotecnologie Mediche e Medicina Traslazionale Università degli Studi di Milano

2 Laboratorio di Biologia Forense Ispezione: ricerca tracce (sangue, saliva, sperma,capelli.) Estrazione (resine magnetiche, colonnine, fenolo/cloroformio) Quantificazione (rt-pcr) Amplificazione (multiplex) Tipizzazione ( XL) 3130XL) PROFILI GENOTIPICI PER LA RICOSTRUZIONE DELLA DINAMICA DELITTUOSA

3 Tipologia di reperti Vestiti con evidenti tracce ematiche Vestiti con minime tracce ematiche

4 Ricerca di tracce ematiche da reperti ripuliti dopo il crimine

5 Indumenti usati per travisare il viso,investigati per la ricerca di saliva e residui epiteliali

6 Ricostruzioni parentali da resti cadaverici o ossei

7 TEST GENERICI E DI SPECIE Utili nell identificazione del tipo di fluido biologico TEST GENERICI combur test sangue (test colorimetrico) amilasi saliva (test colorimetrico) psa sperma (immunocromatografico) TEST DI SPECIE obti test: specifico per sangue di primate (immunocromatografico) semelogenina: specifico per sperma umano (proteina secreta in vescicole seminali, immunocromatografico)

8 COMBUR TEST - Combur 3 Test E (ROCHE) Commercializzato per la diagnosi clinica delle urine, saggio colorimetrico per il livello di glucosio, proteine e eritrociti sostanza: tetrametilbenzidina il tampone reagisce colorandosi di verde in presenza di attività perossidasica dell emoglobina emoglobina FALSI POSITIVI: perossidasi vegetali, ruggine, ossidanti vari, ecc.

9 COMBUR TEST - Combur3 Test E (ROCHE)

10 AMILASI TEST test per diagnosi clinica della pancreatite acuta sostanza: 2-cloro cloro-4-nitrofenolo legato a maltotrioso indicatore colorimetrico che reagisce con l α-amilasi l della saliva,in presenza di saliva si colora di giallo FALSI POSITIVI: sudore, urina, altri fluidi corporei

11 AMILASI TEST

12 PSA TEST test per diagnosi clinica del tumore alla prostata, dell iperplasia prostatica benigna (bph) e delle infezioni alla prostata; saggio immunologico semiquantitativo per la determinazione dell antigene specifico prostatico nel sangue, siero e plasma sostanza: anticorpi anti antigene psa coniugati a oro colloidale utilizzato per identificare tracce di sperma falsi positivi: in donne utilizzatrici di pillole anticoncezionali

13 TEST SPECIFICI OBTI TEST: anticorpi anti hb umani coniugati a particelle cromogene (blu) utilizzato per la diagnosi specie - specifico per il sangue dei primati superiori. TEST PER SEMELOGENINA: specifico per sperma umano (α- semelogenina,proteina secreta in vescicole seminali)

14 LAMPADA CRIMESCOPE lampada con luce monocromatica a lunghezza d onda variabile ( nm) Principio: differente assorbimento/emissione tra fluidi biologici e substrati

15 SLIP con tracce di sperma FODERA di una giacca con tracce di sudore

16 Esempio di un reperto con numerose aree luminescenti 22R 22 O 22Q 22N 22P 22I 22L 22M

17 Luminol reazione di chemioluminescenza: l energia l proviene dall ossidazione dell emoglobina emoglobina

18 Reazione Le reazioni di chemioluminescenza del luminolo che avvengono in una soluzione basica generano un intermedio energeticamente ricco con conseguente emissione di luce da parte dell acido 3-aminoftalico. Per ottenere chemioluminescenza dal luminolo in una soluzione acquosa serve un reagente ossidante come il perossido di idrogeno La CATALISI avviene con la presenza di ioni metallici del tipo: Fe (III) o Cu (II), o da enzimi come la perossidasi Ferro emoglobina

19 08 Agosto 1997 Omicidio di Sergio CAFASSO 19

20 Impronte di piedi rilevate con il luminol

21 Comparazione di un impronta di piede insanguinato con quella di uno dei due indagati

22 Internal part of car

23 Car trunk

24 Spare tire NEGATIVE Internal part of car trunk NEGATIVE

25 Metal area of car trunk with luminol

26

27 C.S. reconstruction ( car trunk cover was changed by coachworker!!!)

28 ESTRAZIONE DEL DNA RESINE AGLI OSSIDI DI SILICIO SU COLONNA DNA affine alla resina, rimane legato nella membrana della colonna, successivamente viene eluito RESINE AGLI OSSIDI DI SILICIO SU BIGLIE MAGNETICHE stessa chimica del precedente metodo, ma la resina è libera in soluzione. Viene poi recuperata con un magnete e il DNA eluito RESINE SINTETICHE AFFINI AL DNA PER CARICA ELETTROSTATICA: il DNA si lega alla resina al variare del ph della la soluzione

29 ESTRAZIONE CON RESINA MAGNETICA metodo di estrazione del DNA che ne sfrutta la carica negativa metodica veloce e modulabile a seconda del tipo di traccia (possibilit possibilità di aumentare il numero dei lavaggi, estrazione da diversi volumi) estrazione automatizzabile resina + DNA - DNA - resina -

30 QUANTIFICAZIONE fase fondamentale per la traccia forense (spesso priva di storia) COSA SI È ESTRATTO e QUANTO DNA USARE per amplificare; anche test per la DIAGNOSI DI SPECIE, viene amplificata una sonda specifica umana, come alfa-satellite del chr. 17 per metodo QUANTIBLOT o h-tert transcrittasi inversa per QUANTIFILER Human in real-time. DNA batterico non determina errori di valutazione perché non viene rilevato QUANTIFICAZIONE CON REAL TIME valutazione di una eventuale inibizione attraverso l amplificazione contemporanea di 2 DNA: templato (FAM) dell estratto e IPC (internal pcr control, VIC); possibilità di quantificare usando una sonda genomica umana (h-tert, human telomerase reverse transcriptase su chr. 5) ed una sonda umana maschile (SRY, sex reversal, utile per violenze sessuali)

31 I campioni vengono quantificati con STANDARD con DNA noto e privo di inibizione importanza dell IPC nella lettura della quantificazione dei campioni per valutare la qualità del DNA estratto (eventuale PURIFICAZIONE) INIBIZIONE: non è possibile valutare la presenza o assenza di DNA. PURIFICAZIONE

32 Real -Time IPC dei campioni e standard, curva molto simile IPC inibito

33 Amplificare e tipizzare l intero l genoma sarebbe improponibile per costi e tempo Studi di popolazioni hanno permesso di individuare marcatori con le seguenti caratteristiche: 1. POLIMORFICI anche in popolazioni isolate (lo stesso marcatore deve presentare diverse varianti nella popolazione) 2. STABILI alle mutazioni (importanza della scelta dei primers) 3. EQUILIBRIO con la legge di Hardy-Weinberg 4. INDIPENDENTI AMPLIFICAZIONE caratteristiche di un marcatore forense Microsatelliti STR (Short Tandem Repeat)

34 STRUTTURA DI UN STR GATA...ACAGATGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATATGT.. GATA è la sequenza del core-repeat Il microsatellite in questione è un tetranucleotidico Le varianti (alleli alleli) hanno un numero diverso di repeat 8 ripetizioni...acagat GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TGT... 9 ripetizioni...acagat GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TGT ripetizioni...acagat GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TGT...

35 Per convenzione gli alleli degli STR vengono chiamati in base al numero di repeat NOME DEL MARCATORE POTENZIALI ALLELI; IDENTIFICATI CON IL NUMERO DI RIPETIZIONI DEL CORE REPEAT

36 SCELTA DEGLI STR Studi di genetica di popolazione hanno permesso di isolare 13 specifici marcatori STR, denominati Loci Codis TPOX D3S1358 D5S818 FGA CSF1PO D8S1179 D7S820 TH01 VWA AMEL D13S317 D16S539 D18S51 D21S11 AMEL

37 Studi di popolazione 13 Loci Codis

38 MULTIPLEX I 13 loci Codis vengono amplificati in un unica reazione di PCR, spesso con aggiunta di altri loci per aumentarne il potere discriminante gli attuali kit di amplificazione caratterizzano contemporaneamente 15 loci STR (Multiplex) le attuali multiplex permettono di amplificare concentrazioni di estratto inferiori ai 50 pg/µl DNA nucleare cellula diploide ~ 6 pg, 50/6= 8 cellule/µl 20 cellule x reazione!!!

39 TIPIZZAZIONE I frammenti vengono separati e caratterizzati tramite elettroforesi capillare utilizzando un sequenziatore automatico (310, 3100, 3130XL), leggendo i segnali dei diversi DYE che discriminano i frammenti overlappanti RAW DATA DATO GREZZO

40 PROFILO GENETICO ELABORATO

41 DIMOSTRAZIONE D IDENTITA un profilo secondo gli standard FBI (codis) e formato da 13 marcatori poniamo che ogni marcatore presenti alleli la cui frequenza e pari a 0,1 nella popolazione di riferimento poniamo che ogni marcatore presenti lo stesso allele su entrambi i cromosomi (omozigosi) la probabilita di ottenere la combinazione data per ogni marcatore e pari a 0,1*0,1=0,01 la probabilita di ottenere la combinazione data per tutto il profilo e 0,01*0,01* 0,01 (13 volte) ovvero 10-26, 1 su miliardi di miliardi di individui.. IL PROFILO PUO ESSERE RITENUTO UNICO

42 indiziato tampone vaginale vittima sperma vestaglia

43 indiziato tampone vaginale vittima vestaglia

44 indiziato tampone vaginale vittima vestaglia

45 indiziato tampone vaginale vittima vestaglia

46 INTERPRETAZIONE DI UN PROFILO MISTO CON CONTRIBUTO DI TRE SOGGETTI

47 VITTIMA

48 PRIMO INDIVIDUO

49 SECONDO INDIVIDUO

50 Test di Paternità L.R.= 99,9999%

51 Test di paternità= storie di vita! - richieste test paternità da padri, che a seguito di tradimento scoperto o crisi famigliare mettono in dubbio propria paternità - richieste test paternità da madri con dubbio partner - richieste test paternità da figli.

52 Compatibilità parziale tra profilo tracce e proprietario appartamento

53 Compatibilità parziale tra profilo tracce e proprietario appartamento

54 Compatibilità parziale tra profilo tracce e proprietario appartamento

55 LABORATORIO DI DATTILOSCOPIA FORENSE

56 IDENTITA CON 18 PUNTI CONFRONTO IN B/N

57

58 BPA : Bloodstain Pattern Analysis STUDIO DELLE TRACCE EMATICHE -morfologia -quantità -posizione -direzione ricostruzione della scena del crimine -distribuzione

59 Studio delle quantita e delle direzioni d impatto

60 ANALISI DI LABORATORIO DEI DATI RACCOLTI Punto di convergenza Punto d origine

61 Dott. Giorgio Portera