Alternativamente, il gene trascritto può portare le informazioni per RNA non codificanti (es. microrna), RNA ribosomali (rrna), transfer RNA (trna).

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2 DIFFERENZE TRA PROCARIOTI ED EUCARIOTI STRUTTURA DEL PROMOTORE BATTERICO IL FATTORE SIGMA SRUTTURA DELLA RNA POLIMERASI INIZIO ALLUNGAMENTO TERMINAZIONE

3 La Trascrizione è il primo step dell espressione genica, nel quale un particolare segmento di DNA è copiato in RNA da un enzima chiamato RNA polimerasi. Se il gene trascritto codifica per una proteina, il risultato della trascrizione è l RNA messaggero (mrna), che sarà usato per creare quella proteina tramite il processo chiamato traduzione. Alternativamente, il gene trascritto può portare le informazioni per RNA non codificanti (es. microrna), RNA ribosomali (rrna), transfer RNA (trna).

4 Il Dogma Centrale della Biologia La parola gene è stata coniata nel 1909 (W. Johannsen). Il dogma centrale della biologia risale agli anni 50.

5 Nei procarioti un solo tipo di RNA polimerasi trascrive i geni codificanti per mrna, rrna e trna.

6 Differenze: Procarioti I geni sono raggruppati in operoni Eucarioti I geni non sono raggruppati in operoni L mrna può contenere trascritti di molti geni (poli-cistronico) Ogni mrna contiene solo il trascritto di un singolo gene (mono-cistronico) La trascrizione e la traduzione sono accoppiate. Il trascritto è tradotto durante la transcrizione. La trascrizione e la traduzione non sono accoppiate. La trascrizione avvine nel nucleo mentre la traduzione nel citoplasma La regolazione dell espressione genica avviene tramite la modificazione della velocità di trascrizione La regolazione dell espressione genica avviene tramite la modificazione della velocità di trascrizione, stabilità dell RNA etc. Gli mrna non sono processati Gli mrna sono processati (splicing, CAP, poly-a tail). rrna e trna sono processati sia negli eucarioti che nei procarioti

7 Il processo generale della trascrizione è simile nei procarioti e negli eucarioti La trascrizione si può dividere in tre fasi - Inizio - Allungamento - Terminazione

8 ALLUNGAMENTO TERMINAZIONE INIZI IO

9 LA TRASCRIZIONE E LA TRADUZIONE SONO ACCOPIATE NEI PROCARIOTI Appena la catena crescente di mrna si separa dal DNA, i ribosomi la attaccano ed inizia la sintesi proteica

10 L RNA ha la stessa sequenza nucleotidica (in direzione 5-3 ) del filamento senso Sense strand nontemplate strand = mrna 3 Antisense strand template strand 1 2

11 Come inizia la trascrizione? L RNA polimerasi si lega ad una regione del DNA chiamata PROMOTORE Struttura del promotore batterico I promotori batterici sono composti da sequenze consenso. Sequenze conservate: quando le sequenze del DNA hanno esattamente la stessa serie di nucleotidi in una determinata regione. Sequenze consenso : Ci sono alcune variazioni nella sequenza ma alcuni nucleotidi sono presenti con una più alta frequenza.

12 INIZIO Struttura del promotore batterico E convenzione indicare l inizio della trascrizione con il numero +1 e di usare numeri positivi per contare le basi del DNA nella direzione della trascrizione (downstream). Se la trascrizione procede verso destra allora la direzione verso sinistra sarà chiamata upstream con le basi indicate con numeri negativi. Per la maggior parte dei geni di E. coli, la sequenza consenso del promotore consiste in due sequenze esameriche. Posizionata a 10 c è la sequenza consenso TATAAT, che è anche conosciuta come TATA box. (capital letters indicate bases found in those positions in more than 50% of promoters analyzed; small letters = less than 50%).

13 INIZIO Struttura del promotore batterico Un altra regione con sequenze simili in molti promotori è posizionata a 35. La sequenza consenso a 35 è TTGACA. Lo spazio tra la sequenza 10, la 35 e il punto di inizio sono importanti per la trascrizione. Infatti delezioni o inserzioni che cambiano questi spazi sono deleteri per la trascrizione.

14 INIZIO Struttura del promotore batterico Pribnow box (TATA box) Startpoint in molti geni di E. coli è una A (la distanza dello startpoint dalla TATA box può variare da 5 a 9 nucleotidi). D. Pribnow (1975) P.N.A.S. -10 sequence separazione del DNA a doppio filamento. -35 sequence legame iniziale dell RNA polimerasi. -spacer region (16-19 bp) è importante per mantenere le posizioni appropiate degli elementi -10 e -35.

15 INIZIO Struttura del promotore batterico La sequenza del Promotore ha una forte influenza sul livello di espressione. Sopra sono mostrati alcuni esempi di promotore s 70 (in rosso sono indicate le posizioni conservate). Il promotore lacz ha circa l 1% di efficienza nell inizio comparato con un promotore ideale. Il promotore di laci è ancora meno efficiente (Il repressore LacI è presente solo in poche copie per cellula). T T G A C A T A T A A T Promoter consensus sequences

16 INIZIO Struttura del promotore batterico

17 INIZIO Struttura dell RNA polimerasi batterica L RNA polimerasi batterica è costituita da un core enzyme più un fattore della trascrizione chiamato sigma factor ( ). Insieme formano il complesso enzimatico funzionale chiamato holoenzyme.

18 INIZIO Struttura dell RNA polimerasi batterica La velocità di reazione è di ~40 nucleotidi/secondo a 37 C; questa velocità è approssimativamente la stessa della traduzione (15 amino acids/sec). Circa 7000 molecole di RNA polimerasi sono presenti nella cellula di E. coli. Molte di queste molecole sono impegnate contemporaneamente nella trascrizione (probabilmente ). Il core enzyme è il componente del holoenzyme che catalizza la polimerizazione. Ha un peso di circa 400 kd ed è composto da 5 subunità: due copie della subunità α (αi, αii), e una copia delle subunità β, β, e ω.

19 INIZIO Struttura dell RNA polimerasi batterica La subunità a (36.5 kda, rpoa gene) è organizzata in 2 domini, con l N-terminale (1-235) che prende contatto con la subunità b o b '. Un linker flessibile connette il dominio N con il dominio C-terminale ( , a -CTD) che si trova fuori dal core della polimerasi ed è il responsabile dell interazione con i fattori di attivazione (es. Catabolite Activator Protein (CAP)) e gli elementi UP. Linker La subunità b (150 kda, rpob gene) e la subunità b ' (155 kda, rpoc gene) FORMANO IL SITO CATALITICO Il rudder (timone) è un loop della subunità b il quale si pensa che funzioni da separatore tra la molecola di RNA neosintetizzata ed il DNA stampo.

20 INIZIO Struttura dell RNA polimerasi batterica La struttura realizzata tramite la cristallografia ai raggi X ha rivelato una struttura a forma di chela di granchio. Le subunità α I, α II, e ω formano la base della chela, mentre le subunità β e β formano le pinze. Queste pinze formano un canale interno (largo circa 2.7 nm). Il sito attivo dell enzima è localizzato in questo canale dove è legato un essenziale ione di Mg 2+. Il core enzyme ha una alta affinità per il DNA in generale. In assenza del fattore σ, il core enzyme può iniziare la sintesi in ogni punto del DNA stampo (in vitro). Il fattore σ è responsabile della diminuzione dell affinità non specifica dell RNA polimerasi per il DNA. La sequenza, la struttura e la funzione sono conservate dai batteri agli umani.

21 INIZIO Struttura dell RNA polimerasi batterica: il fattore σ Nei batteri ci sono molti fattori σ differenti. In E. coli il più abbondante fattore è il 70. Ha la più alta affinità per l RNA polimerasi rispetto a tutti gli altri fattori σ. La maggior parte dei fattori σ hanno in comune 4 regioni aminoacidiche omologhe che svolgono un ruolo nel riconoscimento del promotore Queste quattro regioni sono ulteriormente suddivise in subdomini con funzioni specifiche

22 INIZIO Struttura dell RNA polimerasi batterica: il fattore σ Il fattore σ 70 può essere suddiviso in quattro regioni denominate regioni σ che vanno da 1 a 4 Il fattore σ 70 è necessario per il binding specifico dell RNA polimerasi al promotore della maggior parte dei geni di E. coli. Le sequenze 35 e 10 sono necessarie per il riconoscimento di σ 70.

23 INIZIO Struttura dell RNA polimerasi batterica: il fattore σ Il fattore sigma σ 70 (MW = 72000) I frammenti 2.1 e 2.2 di σ 70 legano la subunità b'. I frammenti 2.3 e 2.4 sono coinvolti nel riconoscimento della regione -10 del promotore. Il frammento 2.3 è necessario per l apertura del DNA. Inoltre, regioni vicine al dominio N-terminale (1.1 e 1.2) di σ 70 hanno attività inibitoria nel legame al DNA. L aggiunta di σ all RNA polimerasi core da la possibilità all RNA polimerasi holoenzyme di riconoscere il sito -10 e di formare il complesso chiuso. Nell holoenzyme, un altro dominio di legame al DNA di, la regione 4.2, viene esposto, e questo riconosce il sito -35, approsimativamente distante 2 giri di elica. Se la -35 è riconosciuta, l holoenzyme apre la regione del DNA che va da -11 a +3, formando il complesso aperto, e la bolla è stabilizzata dal ssdna binding domain di nella regione 2.3. La regione 2.5 interagisce con il dsdna da -11 a 17 (spacer region).

24 INIZIO Struttura dell RNA polimerasi batterica: il fattore σ Alternative sigma factors respond to general environmental changes E. Coli sigma factors recognize promoters with different consensus sequences Sigma70 (rpod) (-35)TTGACA (-10)TATAAT Primary sigma factor, or housekeeping sigma factor. Sigma54 (rpon) (-35)CTGGCAC (-10)TTGCA Alternative sigma factor involved in transcribing nitrogen-regulated genes (among others). Sigma32 (rpoh) (-35)TNNCNCCCTTGAA (-10)CCCATNT Heat shock factor involved in activation of genes after heat shock. SigmaS (rpos) intrinsic curvature (-10)TGNCCATA(C/A)T Alternative sigma factor transcribing genes of stationary phase of growth. Note the extended -10 element. The use of different sigma factors gives E. coli flexibility in responding to different conditions.

25 Il processo della trascrizione è suddiviso in tre fasi: INIZIO ALLUNGAMENTO TERMINAZIONE

26 INIZIO

27 INIZIO L RNA polimerasi oloenzima lega inizialmente le regioni 35 e 10 del promotore e forma un complesso chiuso con il promotore. Il termine chiuso indica che il DNA rimane a doppio filamento. Il complesso è reversibile.

28 INIZIO Cambiamenti strutturali che avvengono nella RNA polimerasi durante l isomerizzazione (transizione complesso chiuso-complesso aperto) - Le pinze (pincers) bloccano il DNA nel complesso aperto. - Cambiamento di posizione della regione 1.1 del fattore sigma. Quando l oloenzima non è legato ad un promotore la regione 1.1 impegna il sito attivo bloccando l accesso al DNA. Quando si forma il complesso aperto la regione 1.1 è spostata 50 A fuori dall enzima permettendo l ingresso del DNA nel sito attivo. La regione 1.1 mima il DNA in quanto è carica negativamente. Il sito attivo sull enzima che interagisce alternativamente con il DNA o con 1.1, è carico positivamente.

29 INIZIO Dopo questi cambiamenti strutturali, il complesso passa alla forma aperta nella quale approssimativamente 18 bp intorno al sito d inizio della trascrizione sono aperti esponendo così il filamento di DNA stampo. La formazione del complesso aperto è generalmente irreversible e la trascrizione viene avviata in presenza di NTPs. No primer is required for initiation by RNA polymerase.

30 INIZIO Durante l inizio della trascrizione, l RNA polimerasi produce e rilascia corti trascritti di RNA generalmente mano di 10 ribonucleotidi (abortive synthesis) prima di lasciare il promotore (promotor clearance). Non è chiaro il motivo per cui l RNA polimerasi va incontro a questo periodi di trascrizione abortiva prima di riuscire a lasciare il promotore, ma sicuramente una regione del fattore σ è coinvolta in questo processo. Infatti, durante questo passaggio avviene uno spostamento di alcuni domini di σ che altrimenti fungerebbero da barriera nel canale di uscita del neosintetizzato RNA.

31 INIZIO La transizione verso il complesso di allungamento porta alla parziale dissociazione del holoenzyme. Il fattore sigma viene rilasciato, e il core dell RNA polimerasi procede downstream. I cambiamenti conformazionali nelle subunità β intorno al DNA, così che la polimerasi non lascia mai completamente lo stampo. Questo meccanismo è critico per la processività della trascrizione, infatti l RNA polimerasi non è in grado di riprendere la sintesi di un gene trascritto in maniera incompleta.

32 ALLUNGAMENTO

33 Elongation After about 9-12 nt of RNA have been synthesized, the initiation complex enters the elongation stage. As RNA polymerase moves during elongation, it holds the DNA strands apart, forming a transcription bubble. The moving polymerase protects a footprint of ~30 bp along the DNA against nuclease digestion. Within the transcription bubble, one strand of DNA acts as the template for RNA synthesis by complementary base pairing. Transcription always proceeds in the 5 3 direction.

34 Elongation 1) The antisense strand of DNA is used as template. 2) Transcription proceeds in direction. 3) The double stranded RNA-DNA hybrid is very transient. At any given time during transcription, the number of nucleotides of RNA that remain paired with the DNA template may vary between 8 and 10. Several proteins can affect the rate of elongation. NusA slows elongation when RNA polymerase encounters certain sequences keeping the rate of transcription similar to the rate of translation so that the ribosomes are able to follow on RNA molecule right behind the RNA polymerase.

35 Proofreading E. coli RNA polymerase synthesizes RNA with remarkable fidelity in vivo. Its low error rate may be achieved by two proofreading mechanisms. ). One mistake occurs every nucleotides added. Pyrophosphorolytic editing The RNA polymerase use its active site in a simple back-reaction, to catalyze the removal of an incorrectly inserted ribonucleotide by reincorporation of Ppi. Hydrolytic editing The polymerase backtracks by one or more nucleotides and cleaves the RNA product, removing the error-containing sequence. Hydrolytic editing is stimulated by Gre factors, which both enhance hydrolytic function and serve as elongation stimulating factor. Gre factors ensure that polymerase elongates efficiently and help overcome arrest in presence of a mismatch.

36 TERMINAZIONE

37 Termination of transcription The RNA polymerase core enzyme moves down the DNA until a stop signal or terminator sequence is reached by the RNA polymerase. There are two types of terminators recognized, Rho-dependent Rho-independent terminators E. coli uses both kinds of transcript terminators.

38 Termination of transcription Rho-independent termination Also called intrinsic terminators because they cause termination of transcription in the absence of any external factors. Terminator is characterized by a consensus sequence that is an inverted repeat. Stem-loop structures can form within the mrna just before the last base transcribed, by the pairing of complementary bases within the inverted repeat. The inverted repeat sequence in the mrna is followed by seven to eight uracilcontaining nucleotides. A hybrid helix of U in the RNA base paired with A in the DNA is less stable than other complementary base pairs. This property, combined with formation of the stem loop in the exit channel of RNA polymerase, is sufficient to cause the enzyme to pause, resulting in transcript release.

39 Termination in prokaryotes 1) Core enzyme can terminate in vitro at certain sites in the absence of any other factor. These sites are called intrinsic terminators. 2) Rho-dependent terminators are defined by the need for addition of rho factor in vitro transcription assay. 1) Intrinsic terminator loop Stem (CG rich) The importance of the run of U bases is confirmed by making deletions that shorten this stretch; although the polymerase still pauses at the hairpin, it no longer terminates.

40 Termination of transcription Rho-dependent termination Rho-dependent termination is controlled by the ability of the Rho protein to gain access to the mrna. Terminator is an inverted repeat with no simple consensus sequence and no string of Ts in the nontemplate strand. Rho is a ring-shaped, hexameric helicase protein with a distinct RNAbinding domain and an ATP-binding domain. Rho binds specifically to a C-rich site called a Rho utilization (or rut site) at the 5 end of the newly formed RNA, as it emerges from the exit site of RNA polymerase. Temporary release of one subunit of the hexamer allows the 3 segment of the nascent transcript to enter the central channel of the Rho ring.

41 Termination of transcription Rho-dependent termination In an ATP-dependent process, Rho travels along the RNA, chasing the RNA polymerase. When the polymerase stalls at the terminator stemloop structure, Rho catches up and unwinds the weak DNA RNA hybrid. This causes termination of RNA synthesis and release of all the components.

42 2) Rho dependent termination. -rho factor is an essential protein in E. coli (~275 kd) hexamer of identical subunits). -Mutations in rpob gene (b subunit of RNA polymerase) can reduce termination at a rho-dependent site. A consensus sequence for rho-dependent terminators cannot be defined (high C and low G content). - E. coli has relatively few rhodependent terminators; most of the known rho-dependent terminators are found in phage genomes. - rho has a 5-3 helicase action that can cause an RNA-DNA hybrid to separate; hydrolysis of ATP is used to provide energy for the reaction. - The idea that rho moves along RNA leads to an important prediction about the relationship between transcription and translation. The RNA polymerase pauses when it reaches a terminator, and termination Stop codon

43 In some cases, a nonsense mutation in one gene of a transcription unit prevents the expression of subsequent genes in the unit. This effect is called polarity. Rho and NusA create a link between transcription and translation. UAA UGA UAG

44 TECNICHE USATE PER LO STUDIO DELL INTERAZIONE RNA pol/dna E PER INDIVIDUARE IL SITO D INIZIO DELLA TRASCRIZIONE

45 DNAse I Footprinting 1. Prepare end-labeled DNA. 2. Bind protein. 3. Mild digestion with DNAse I (randomly cleaves ds DNA on each strand) 4. Separate DNA fragments on denaturing acrylamide gels.

46 DNase I footprint performed on an end-labeled DNA fragment FIS Footprint Samples in lanes 2-4 had increasing amounts of the DNA-binding protein (lambda protein cii); lane 1 had no protein.

47 DNA-protein complex Partially DNase I digested DNA is subjected to linear PCR DNase I Products of DNase I digestion are primer extended by linear PCR using a 5 end-labeled oligonucleotide Sequencing gel

48 Gel retardation assay Gel Shift Electro Mobility Shift Assay (EMSA) Band Shift Incubating a purified protein, or a complex mixture of proteins e.g. nuclear or cell extract, with a 32 P end-labelled DNA fragment containing the putative protein binding site (from promoter region). Reaction products are then analysed on a nondenaturing polyacrylamide gel. The specificity of the DNA-binding protein for the putative binding site is established by competition experiments using DNA fragments or oligonucleotides containing a binding site for the protein of interest, or other unrelated DNA sequences. No protein add protein Non-denaturing PAGE * * Free DNA probe Retarded mobility due to protein binding

49 virb virf virg Bound DNA EMSA Free DNA Evaluating the Binding Affinity

50 Primer extension mrna 5 3 annealing primer- 32 P G A T C Early-log Mid-log Late-log 37 C 10 C 37 C 10 C 37 C 10 C mrna 5 primer - 32 P 3 reverse transcriptase mrna 5 3 primer - 32 P cdna run on denaturating gel +77 cspa mrna

51 S1 Mapping [#] La nucleasi S1 digerisce DNA o RNA a singolo filamento [*] Il sito d inizio della trascrizione si trova a 300 basi dall estremità 5 marcata del frammento di DNA usato come sonda [#] [*]