Variazione degli acidi grassi ω3 ed ω6 nel plasma di bovine da latte durante il periparto

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1 L AVORO ORIGINALE BERTONI G. 1,TREVISI E. 1, RISÈ P. 2,GALLI C. 2 Variazione degli acidi grassi ω3 ed ω6 nel plasma di bovine da latte durante il periparto PROGRESS IN NUTRITION VOL. 8, N. 1, , 2006 TITLE Changes of ω3 and ω6 plasma fatty acids on periparturient dairy cows KEY WORDS ω3 fatty acids, fatty acid and metabolic profiles, peripartum, dairy cows PAROLE CHIAVE Acidi grassi ω3, profilo acidico e metabolico, periparto, bovine da latte 1 Istituto di Zootecnica, Facoltà di Agraria, Università Cattolica del Sacro Cuore, Piacenza 2 Dip. di Scienze Farmacologiche, Facoltà di Farmacia, Università degli Studi di Milano Indirizzo per la corrispondenza: Giuseppe Bertoni Istituto di Zootecnica, Fac. Agraria U.C.S.C. Via Emilia Parmense, Piacenza Tel Fax giuseppe.bertoni@unicatt.it Riassunto Gli acidi grassi ω3 intervengono nella modulazione dei processi infiammatori e questi si accentuano al parto; di qui l interesse ad approfondire le loro variazioni ematiche durante il periparto delle lattifere affette o meno da fatti infiammatori. Otto bovine Frisone, 6 trattate con olio di fegato di merluzzo rumino-protetto in asciutta (OP) e 2 di controllo (CTR), sono state sottoposte a frequenti prelievi ematici nel periparto per il controllo del Profilo Metabolico e degli acidi grassi. Oltre al controllo dell ingestione di alimenti, dello stato di salute, della produzione di latte e dello stato di ingrassamento, è stato stimato l apporto alimentare di ω3 ed ω6. Gli ω3 si riducono drasticamente in prossimità del parto per poi tornare ai valori precedenti al termine del 1 mese di lattazione. Ciò si verifica in entrambi i gruppi, anche se le bovine trattate hanno sempre mostrato valori superiori del 50% circa. Le variazioni degli apporti alimentari giustificano in minor misura quelle ematiche, cui contribuiscono maggiormente i tenori di lipoproteine. I fenomeni infiammatori seguiti si sono verificati nel periparto, per cui le forti variazioni fisiologiche degli ω3 tendono a mascherare quelle eventualmente attribuibili ai predetti fenomeni. Summary ω3 fatty acids are involved in the modulation of inflammatory processes, that are increased at calving time. Therefore, we have investigated the changes of plasma ω3 during the peripartum of dairy cows affected or not by inflammation. Height Holstein cows, 6 receiving cod-liver oil during dry-period and 2 used as control, were frequently bled during peripartum. Metabolic and fatty acid plasma profiles were determined on plasma. Dry matter intake, health status, milk yield and body condition score were also regularly measured; while the intake of ω3 and ω6 was estimated. ω3 fatty acids were markedly reduced around calving, but they recovered quite completely the pre-calving level at the end of 1 st month of lactation. Both groups showed the same pattern of change, but the treated cows maintained always the higher values (about 50% more than control). Plasma ω3 variations are not fully explained by diet changes, while it seem more related to lipoprotein modifications. The cases of inflammatory processes occurred during peripartum period, therefore the marked physiological changes of ω3 tend to mask the variations attributable to inflammation. 1

2 VOLUME 8 Introduzione I livelli cellulari degli acidi grassi ω3 contribuiscono significativamente alla modulazione dei processi infiammatori dei mammiferi. Rappresentano infatti i precursori degli eicosanoidi (prostaglandine, leucotrieni e trombossani) che derivano dall intermedio acido eicosapentaenoico, e che, a differenza di quelli derivanti dall acido arachidonico, presentano un azione pro-infiammatoria meno accentuata (1). In buona misura l effetto favorevole su tali processi si deve al fatto che gli acidi grassi ω3 fungono da antagonisti dell acido arachidonico (2). Inoltre, tali acidi grassi sono in grado di attenuare la risposta infiammatoria riducendo la sintesi di molecole proinfiammatorie, tra cui il TNFa, la più nota tra le citochine pro-infiammatorie (3). L integrazione della dieta con acidi grassi ω3 ha prodotto, sia nell uomo che negli animali da esperimento (2-5), indubbi miglioramenti nel trattamento di numerose patologie croniche e nei pazienti in cura intensiva, abbreviandone i tempi di recupero. Anche nella bovina da latte la somministrazione di olio di pesce ha determinato effetti favorevoli, accelerando la ripresa produttiva e la normalizzazione di alcuni parametri ematici nei soggetti interessati da eventi infiammatori (6). Tuttavia, nello stesso tempo, il maggiore apporto alimentare di ω3 ha confermato la complessità della loro modalità d azione (2, 7), come dimostrato dalla attivazione di processi infiammatori latenti in un certo numero di casi (6, 8). Durante il periparto, le bovine sono soggette ad un calo dell attività del loro sistema immunitario (9) e, forse per questo, soggette a molteplici fenomeni infiammatori le cui cause non sono sempre ben individuabili (10, 11). Ad entrambi i fenomeni, potrebbe contribuire almeno in parte una inadeguata disponibilità di tali nutrienti, di cui è buon indice il tenore nel plasma (12). Da notare infatti che nei ruminanti anche per l azione riducente che si realizza nel rumine l utilizzazione degli acidi grassi ω3 di origine alimentare e microbica appare in genere piuttosto modesta. Pertanto è parso utile approfondire l analisi delle variazioni degli acidi grassi essenziali nel plasma durante la fase più critica della bovina da latte, il periparto appunto, in soggetti ad alta produzione la cui dieta era stata supplementata o meno di ω3 nel corso dell asciutta. Materiali e Metodi Lo studio è stata condotto presso lo stabulario sperimentale della Facoltà di Agraria dell UCSC, caratterizzato da un costante monitoraggio e da una sistematica regolazione delle principali condizioni ambientali: fotoperiodo (14 ore/giorno di luce), temperatura (18-24 C), umidità relativa (50-60%). Sono state utilizzate 8 bovine Frisone a medio-alta potenzialità genetica nel loro ultimo mese di gestazione e nel primo di lattazione. Le bovine, adattate al sistema di stabulazione ed a prelievi ematici frequenti, ricevevano razioni differenti tra asciutta e lattazione, a base di fieno disidratato (medica e loietto), insilato di mais e concentrato. Trattamento La supplementazione con acidi grassi ω3 è stata effettuata con un prodotto protetto dall attacco ruminale mediante microincapsulazione (Orovital Fish, Ascor Chimici, Forlì). Il trattamento (OP) è consistito nella somministrazione di 80 g/d di olio di fegato di merluzzo (pari a 16,4 g/d di ω3), per 7 giorni consecutivi durante il periodo di asciutta. Il trattamento è stato eseguito al mattino, un ora circa dopo la somministrazione dei foraggi, ed è avvenuto tra il 40 ed il 30 giorno prima del parto. Nel complesso sono state trattate sei bovine, mentre altre due, che hanno assunto la normale dieta, sono servite da controllo (CTR). I rilievi routinari sugli animali hanno previsto: l ingestione di alimenti e lo stato di salute ogni giorno, la produzione di latte ad ogni mungitura, lo stato di ingrassamento (BCS) ed il peso vivo ogni 14 gior- 2

3 PROGRESS IN NUTRITION 1/2006 ni, la raccolta di campioni di sangue, dalla vena giugulare, il mattino prima del pasto di foraggi, due volte la settimana e quotidianamente nel periparto. Su tutti i campioni ematici si è proceduto al controllo del Profilo Metabolico, secondo le indicazioni e le metodiche riportate da Bertoni et al. (13), mentre sui campioni prelevati a -28, -14, -7, - 2, 2, 7, 14 e 28 DIM si è proceduto anche alle determinazioni del profilo in acidi grassi dei lipidi plasmatici, secondo il metodo descritto da Visioli et al. (14). Infine si è proceduto alla raccolta di campioni rappresentativi di ciascuna partita dei vari alimenti per l analisi dei principi immediati. Sulla base delle razioni realmente ingerite sono poi state eseguite alcune valutazioni per meglio definire il contributo alimentare degli acidi grassi ω3 ed ω6, utilizzando i contenuti tratti da dati bibliografici (15, 16). Con la medesima finalità e sempre utilizzando dati dalla bibliografia (15) è stato anche stimato il contributo di batteri e protozoi del rumine, alla predetta disponibilità. L elaborazione statistica è stata eseguita con un modello per osservazioni ripetute (procedura Mixed del software SAS Institute, versione 8), suddividendo le bovine sia in relazione al trattamento ricevuto che, retrospettivamente, in base alla presenza di eventi infiammatori nel periparto, rilevati mediante taluni indicatori ematici (aptoglobina in particolare). Inoltre sono state calcolate le correlazioni semplici di Pearson. Risultati e Discussione Le bovine oggetto della prova hanno evidenziato un buon livello produttivo, sfiorando i 45 kg/capo/d al 30 DIM, ed una soddisfacente ingestione di alimenti, mostrando l usuale andamento nel periparto (livello prossimo ai 12,5 kg/capo/d in asciutta, graduale calo nella settimana precedente il parto, seguito da un progressivo innalzamento per raggiungere i 20 kg/capo/d al 30 DIM). Dal punto di vista sanitario, sono stati rilevati alcuni problemi nel periparto: 2 bovine in asciutta (un caso di diarrea ed una dislocazione dell abomaso) e 5 in lattazione (un collasso puerperale seguito da mastite, una ritenzione di placenta, una dislocazione dell abomaso, una chetosi, una lacerazione della vulva durante il parto). Va tuttavia sottolineato che tali problemi non sono risultati particolarmente gravi e si sono risolti in un breve periodo, come dimostrato dalle buone performance produttive. Effetto della fase fisiologica e della supplementazione alimentare con ω3. L integrazione alimentare con olio di pesce ha comportato significative variazioni del contenuto di acidi grassi poliinsaturi (PUFA) a livello ematico. Come si osserva dalla figura 1 (sinistra), i valori medi durante l ultimo mese di asciutta degli acidi grassi ω3 (84,9±7,5 vs 51,3±27,7 mg/ml rispettivamente per OP e CTR, P<0,05), ma anche degli ω6, sono risultati mediamente più elevati rispetto al controllo. Tuttavia, entrambi i gruppi hanno mostrato un progressivo calo degli acidi grassi ω6 e, soprattutto, ω3 nel sangue durante l ultimo mese di gravidanza, più accentuato fra il 15 ed il 10 giorno pre-parto. In particolare al 2 giorno di lattazione, gli ω3 hanno mostrato una riduzione nei confronti del livello iniziale del 50% e del 39% (P<0,01), rispettivamente per OP e CTR. Durante la fase di asciutta e come si può rilevare dalla figura 1 (destra), tale calo è risultato correlato con quello del colesterolo totale utilizzato quale indice delle lipoproteine (r=0,70, P<0,001 nel complesso delle bovine controllate); in modo negativo, sono anche apparsi correlati con gli acidi grassi non esterificati (NEFA), benché il valore di r (-0,54, P<0,01) sia meno rilevante. Tuttavia il calo del colesterolo e quindi delle lipoproteine non sembra spiegare totalmente la marcata riduzione pre-parto degli ω3, specialmente in prossimità del parto e negli animali trattati. Gli acidi grassi ω6 plasmatici si sono invece ridotti meno, anche se il calo è risultato più accentuato in OP (-43% vs -20% di CTR) e correlato solo 3

4 VOLUME 8 Figura 1 Andamento degli acidi grassi ω3 ed ω6 (mg/ml; sinistra), colesterolo e NEFA (mmol/l; destra) nel plasma di bovine da latte durante il periparto che hanno ricevuto (OP) o meno (CTR) una supplementazione di olio di pesce in asciutta. (Le differenze tra i gruppi sono indicate da: * P<0,05; ** P<0,01) con il colesterolo (-0,76, P<0,001). Per effetto di tali variazioni, il rapporto tra ω6 ed ω3 è aumentato con l approssimarsi del parto, passando da valori di 3,5:1 (30 DIM) ad oltre 4:1 in OP e 7:1 in CTR (-2 DIM). La correlazione negativa tra ω3 (ma anche ω6) e NEFA indica una diminuzione nel sangue dei PUFA quando si avvia il processo di lipomobilizzazione ed è una conferma indiretta della loro modestissima presenza nel grasso di deposito. Invece, la buona correlazione positiva con il colesterolo indica come gran parte di tali acidi circolanti nel sangue sia inclusa nelle lipoproteine. Nel 1 mese di lattazione sono aumentati nel sangue tanto gli ω3 che gli ω6, tuttavia l incremento di questi ultimi è risultato più marcato superando di molto i livelli riscontrati in asciutta, mentre gli ω3 hanno raggiunto livelli simili a quelli massimi mostrati prima del parto. Tali variazioni hanno determinato un innalzamento del rapporto ω6:ω3 in entrambi i gruppi, ma in modo più marcato in OP (che al parto era di 4:1 vs 7:1 di CTR) tanto che al 30 DIM il rapporto tra le due forme ha raggiunto il valore di 8:1 sia in OP che in CTR. Va anche sottolineato come la differenza del livello di ω3 nel plasma sia rimasta praticamente invariata tra controllo e trattato nel periodo considerato, suggerendo che l integrazione degli acidi grassi ricevuta in asciutta abbia un efficacia duratura. A spiegare le variazioni ematiche in relazione al parto, potrebbe contribuire la disponibilità dei rispettivi nutrienti nella dieta. In particolare, il contenuto nella razione (circa 12,5 e 22,5 g/capo/d rispettivamente per ω3 ed ω6) ha iniziato a ridursi 10 giorni circa prima del parto (meno fieno e più concentrati), tornando ad aumentare con l avvio della lattazione. Questo comportamento è simile a quello dei tenori ematici, tuttavia il calo degli acidi grassi ω3 nel sangue è iniziato prima della ridotta disponibilità alimentare; inoltre, l aumentato apporto degli ω3 è risultato decisamente più modesto di quello degli ω6, forse perché questi ultimi sono assai rappresentati nel mais (farina ed insilato). A causa di ciò il rapporto ω6:ω3 nella dieta è progressivamente aumentato, passando dal 2:1 dell asciutta al 5:1 del 30 DIM. Un ulteriore fonte di acidi grassi ω3 ed ω6 è costituita dall apporto di batteri e protozoi del rumine anche se il contributo dei protozoi appare nel complesso trascurabile poichè sfuggono al rumine in una proporzione assai limitata. Al contrario, il 4

5 PROGRESS IN NUTRITION 1/2006 tenore degli acidi grassi ω3 nei batteri ruminali è piuttosto modesto (al massimo intorno all 1% dei lipidi totali batterici) e in relazione alle fonti alimentari. Tuttavia, in ragione del loro contributo alla dieta della bovina, 1-3 kg/giorno di sostanza secca microbica in relazione al livello d ingestione di alimenti, con un tenore lipidico del 10-30% (17) nonché dell alta efficienza con cui l apparato digestivo utilizza i lipidi microbici (17), si può stimare che l apporto duodenale di ω3 con i batteri ruminali oscilli intorno a 0,5-1,5 g/kg di sostanza secca microbica. Pertanto il loro contributo potrebbe essere ben superiore a quello fornito dalla dieta, la cui quota di ω3, non essendo protetta dall ambiente fortemente riducente del rumine, verrebbe in gran parte bioidrogenata (17). Poiché i batteri rappresentano un quantitativo ridotto in asciutta e crescente con la lattazione, anche il loro diverso apporto può contribuire a spiegare le variazioni ematiche di ω3. Tuttavia tale contributo non può essere sufficiente, anche perché si sono mantenute le differenze tra animali che avevano ricevuto l integrazione ed il controllo. A quest ultimo riguardo, il trattamento a base di olio di pesce protetto dal rumine ha apportato complessivamente, nei 7 giorni di supplementazione, 114,8 g di acidi grassi ω3 (rapporto EPA/DHA= 0,8/1,0) e 16,7 g di ω6. Di essi, una quota è certamente stata modificata durante il transito ruminale; infatti è stata accertata una scomparsa del 16,6% del prodotto dopo 8 ore di sosta in rumine (6). Comunque l integrazione ha rappresentato un aumento considerevole, circa il 30% dell apporto di ω3 garantito dai soli alimenti nel corso degli ultimi 30 giorni di gravidanza (nel complesso circa 375 g). Se questo spiega i valori di ω3 più elevati prima e dopo il parto, lascia aperto il problema del calo pre-parto e dell aumento dopo di esso. Su tale variazione, come precedentemente indicato, sembrano esercitare un notevole effetto le lipoproteine (da noi stimate valutando il colesterolo totale) alle quali infatti sono ben correlati ω3 ed ω6. In ogni caso, l aumentato livello di ω3 ematici nel post parto, in assenza di un marcato incremento della loro disponibilità alimentare, potrebbe derivare da una loro mobilizzazione. E infatti verosimile che, in condizioni di abbondanza alimentare, gli ω3 ed in parte gli ω6 si vadano ad accumulare nelle membrane cellulari dei tessuti, per poi essere mobilizzati quando l aumentata sintesi di lipoproteine nel post parto (e quindi di fosfolipidi plasmatici; 18) richiede la disponibilità di PUFA. Effetto della presenza di stati infiammatori Per indagare la relazione tra i livelli plasmatici di tali acidi grassi e la presenza di stati infiammatori, sono state selezionate le bovine che hanno mostrato eventi infiammatori nel corso dello studio, indipendentemente dai sintomi clinici osservati, pertanto individuati sulla base dell aumento dell aptoglobina. Complessivamente sono stati individuati 7 casi (6 bovine), 2 in asciutta avanzata e 5 in avvio di lattazione, che sono stati allineati in corrispondenza del valore massimo di aptoglobina; ne consegue un elevata sovrapposizione del processo infiammatorio con gli eventi tipici del parto, complicando l interpretazione dei risultati. Va anche sottolineato come i problemi riscontrati non siano stati particolarmente gravi, come confermato dai buoni livelli produttivi e di ingestione di alimenti di tutte le bovine. Le bovine interessate da stati infiammatori hanno evidenziato un calo sia degli ω3 che degli ω6 in corrispondenza del picco di aptoglobina (presumibilmente successivo di 1-2 giorni all effettiva comparsa dell evento patologico). La riduzione dei PUFA è proseguita anche nei giorni immediatamente successivi in 3 casi (tra cui le 2 bovine con problemi in asciutta) su 7, anche quando il livello di aptoglobina era già in calo. In coincidenza dell evento infiammatorio sono avvenute anche altre importanti e note variazioni ematiche come il calo del colesterolo e l aumento della ceruloplasmina (tipiche proteine di 5

6 VOLUME 8 fase acuta, rispettivamente negativa e positiva), nonché il calo di calcio e zinco, e l aumento di NEFA, BOHB, GOT e bilirubina totale. Da notare sono pure le correlazioni tra gli acidi grassi ω3 ed alcuni parametri (colesterolo, bilirubina totale e NEFA) che, al pari delle variazioni, non paiono diverse da quelle precedentemente illustrate ed attribuite alle fasi fisiologiche che caratterizzano il periparto. Si può quindi osservare che problemi infiammatori si sono avuti tanto nelle bovine trattate, quanto in quelle di controllo; tuttavia non è possibile stabilire se la risposta sia stata diversa, a causa delle ampie variazioni, attribuibili al parto. Conclusioni Non ci risulta che precedenti lavori abbiano studiato l evoluzione degli acidi grassi ω3 ed ω6 nel sangue delle bovine ed in una fase critica quale il periparto. Le importanti variazioni osservate al termine della gravidanza (calo) e nelle fasi iniziali della lattazione (ripristino dei valori precedenti), non paiono giustificate unicamente dalla disponibilità alimentare. Tuttavia l integrazione di questi acidi con olio di pesce protetto dal rumine aumenta sensibilmente ed a lungo i livelli ematici. Eventuali rapporti fra le variazioni ematiche di ω3 ed i fatti infiammatori non sono accertabili nella nostra esperienza a causa della concomitanza con il parto e le variazioni ad esso connesse. Pertanto sono necessarie ulteriori indagini per meglio comprendere le variazioni ematiche nel periparto che parrebbe utile riferire al livello ematico di lipoproteine totali - ed altresì per chiarire se una diversa disponibilità di ω3 possa modificare la risposta animale ai processi infiammatori. Bibliografia 1. Calder PC, Grimble RF. Polyunsaturated fatty acids, inflammation and immunity. European Journal of Clinical Nutrition (2002); 56(3): S14-S Calder PC. Dietary modification of inflammation with lipids. Proceedings of the Nutrition Society 2002; 61: Grimble RF, Howell WM, O Reilly G, et al. The ability of fish oil to suppress tumor necrosis factor alpha production by peripheral blood mononuclear cells in healthy men is associated with polymorphisms in genes that influence tumor necrosis factor alpha production. Am J Clin Nutr 2002; 76 (2): Gil A. Polyunsaturated fatty acids and inflammatory diseases. Biomedical Pharmacotherapy 2002; 56 (8): Grimble RF. Immunonutrition. Current Opinion in Gastroenterology 2005; 21: Trevisi E, Piccioli-Cappelli F, Bertoni G. Ricerche preliminari sugli effetti di olio di fegato di merluzzo rumine-protetto in bovine affette da problemi infiammatori diversi. Progress in Nutrition 2001; 4 (1): Harbige LS. Fatty acids, the immune response, and autoimmunity: a question of n-6 essentiality and the balance between n-6 and n-3. Lipids 2003; 38 (4): Trevisi E, Piccioli-Cappelli F, Bertoni G. Effetti metabolici della somministrazione a bovine in asciutta di acidi grassi ω3 protetti associati ad acido acetilsalicilico. Progress in Nutrition 2003; 5 (4): Goff JP, Horst RL. Physiological changes at parturition and their relationship to metabolic disorders. J Dairy Sci 1997; 80 (7): Cappa V, Trevisi E, Bertoni G. Variazioni ematiche e produttive nel 1 mese di lattazione in bovine di allevamenti con o senza problemi post-partum. Zoot Nutr Anim 1989; 15: Trevisi E, Han XT, Piccioli-Cappelli F, Bertoni G. Intake reduction before calving affects milk yield and metabolism in dairy cows. Book of Abstracts of the 53 rd Annual Meeting EAAP, Cairo, Egypt September , 2002: Cantwell MM. Assessment of individual fatty acid intake. Proc Nutr Soc 2000; 59: Bertoni G, Trevisi E, Calamari L, Lombardelli R. Additional energy and protein supplementation of dairy cows in early lactation: milk yield, metabolic-endocrine status and reproductive performances. Zoot Nutr Anim 1998; 24: Visioli F, Risè P. Barassi MC, Marangoni F, Galli C. Dietary intake of fish versus formulations leads to higher plasma concentrations of n-3 fatty acids. Lipids 2003; 38: Christie W. Lipid Metabolism in Ruminant Animals. Ed. Pergamon Press, Oxford, Sauvant D, Perez J-M, Tran G. Tables de composition et de valeur nutritive des matières premières destinèes aux animaux d èlevage (porcs, volailles, bovins, ovins, caprins, lapins, chevaux, poissons) 2 a èdition, Ed. INRA, Pari, Sauvant D, Bas P. La digestion des lipids chez le ruminant. INRA Production Animales 2001; 14 (5): Bionaz M. Studi sui rapporti fra funzionalità epatica e fenomeni infiammatori al parto. Conseguenze sulle performance produttive e riproduttive. Tesi di Dottorato. UCSC. Milano,