Latte e prodotti lattiero-caseari. latte vaccino crudo utilizzato per la fabbricazione di prodotti lattiero-caseari: CBTa 30 C < /ml

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1 Latte e prodotti lattiero-caseari Criteri igienico sanitari per il latte vaccino igiene alla stalla e igiene della mungitura latte vaccino crudo utilizzato per la fabbricazione di prodotti lattiero-caseari: CBTa 30 C < /ml latte vaccino trasformato utilizzato per la fabbricazione di prodotti lattierocaseari: CBT a 30 C < /ml

2 Trattamenti termici del latte ridurre e/o eliminare agenti patogeni e responsabili di alterazioni Trattamento termico: ogni trattamento mediante calore avente come effetto, immediatamente dopo la sua applicazione, una reazione negativa al saggio della fosfatasi Termizzazione: riscaldamento del latte crudo per almeno 15 secondi a t C (reazione positiva al saggio della fosfatasi)

3 pastorizzazione risanamento da microrganismi patogeni (Mycobacterium tubercolosis, Brucella abortus): alta: almeno 72 C per 15 secondi bassa: almeno 63 C per 30 minuti termofili! qualsiasi altra combinazione tempo/temperatura che abbia effetto equivalente

4 Latte pastorizzato: fosfatasi e perossidasi negativa sieroproteine non < 11% proteine 28 g/l Latte fresco pastorizzato: fosfatasi negativa e perossidasi positiva sieroproteine non < 14% Proteine 28 g/l Latte fresco pastorizzato di alta qualità (Decr n. 185) fosfatasi negativa e perossidasi positiva confezionato entro 48 ore dalla mungitura grassi non < 3,5% proteine non < 32 g/l sieroproteine non < 15,5%

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7 Latte pastorizzato microfiltrato microfiltrazione su elementi filtranti esenti da cessioni con pori 1,4-2 µm (DECRETO 17 giugno 2002) pastorizzazione (retentato = grasso + microrganismi a 85 C) e rimiscelazione, omogeneizzazione Conservazione 11d

8 Sterilizzazione trattamento termico idoneo ad assicurare la distruzione di tutti i microrganismi presenti nel latte o che ne impedisca definitivamente la proliferazione (Legge 189/1969) eliminazione di microrganismi in forma vegetativa, patogeni e non patogeni, e delle spore: stabilità microbiologica dopo incubazione 15 gg a 30 C, o 7 gg a 55 C, in recipienti chiusi metodo UHT (almeno 135 C) metodo classico

9 Omogenizzazione a Alta Pressione (HPH) come alternativa alla pasteurizzazione - tecnologia continua o semicontinua per alimenti fluidi o fluidificabili - pressioni comprese tra 200 e 1800 bar. - ottimizzazione della microstruttura di creme, gelati, salse, emulsioni, trattamento di latte destinato alla produzione di yogurt e 2000 bar inattivazione di Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica, molti sierotipi di Salmonella, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis e lieviti - non riduce sostanzialmente carica e vitalità di batteri lattici, anche probiotici - cellule trattate incrementano l idrofobicità cellulare e la resistenza alla bile

10 Confezionamento caratteristiche organolettiche inalterate evita ricontaminazione UHT: Tetrapack sterilizzato (calore o disinfettanti), asciugatura del cartone, formatura, chiusura ermetica metodo classico: confezionamento precedente al trattamento termico

11 Latti fermentati Prodotti ottenuti per coagulazione del latte ad opera di microrganismi della fermentazione acida o acido-alcolica. Omogeneizzazione Pastorizzazione Concentrazione (fino al 14% di residuo secco) Inoculo con batteri lattici e incubazione fino a ph 4,0 Aggiunta di altri ingredienti (frutta fresca o surgelata, saccarosio)

12 latti acidi (Yogurt, Gioddu, Acidophylus Milk) latti acido-alcolici (Kefir, Koumys, Leben, Taryk) latti acido-viscosi (Taette, Ropy Sour Milk, Gros Lait) yogurt Streptococcus thermophilus e Lactobacillus bulgaricus acido lattico (0,8-1,3%), ph 3,9-4,2 kefir batteri lattici (Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Leuconostoc mesenteroides, Lactococcus spp., Enterococcus spp Streptococcus caucasicus) batteri acetici (Acetobacter aceti) lieviti alcolici (Saccaromyces spp., Kluyveromyces marxianus ) acido lattico (0,6-0,9%), anidride carbonica, alcool etilico (0,4-0,9%)

13 Trasformazione di latte in yogurt

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15 conservazione vitalità microrganismi: a 30 giorni a 4 C: batteri lattici intorno a 10 7 UFC/g a C rapida diminuzione della carica legislazione Italiana: totale batteri lattici alla produzione: UFC/g totale batteri lattici alla vendita: > 5x10 6 UFC/g totale di ogni specie alla vendita: > 1x10 6 UFC/g coliformi alla produzione: < 10 UFC/g patogeni e loro tossine: assenti in 25g

16 "cibo microbiologico vivente che quando ingerito in quantità sufficienti produce effetti benefici per l'organismo

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18 Principali funzioni della flora batterica Sintesi di vitamine e aminoacidi Degradazione degli amidi a zuccheri semplici Fermentazione dei polisaccaridi ad acidi grassi volatili Degradazione delle proteine ad aminoacidi, amine ed ammoniaca Idrogenazione degli acidi grassi poliinsaturi Trasformazione degli acidi biliari primari in secondari Trasformazione del colesterolo in steroli Riduzione dei nitrati in nitriti Detossificazione (es: bilirubina - - urobilina) Resistenza alla colonizzazione da batteri patogeni Stimolazione del sistema immunitario associato alla mucosa intestinale contribuisce ai processi biochimici dell organismo favorisce l'assimilazione aiutando i processi di digestione, assorbimento e peristalsi aiuta le difese dell organismo

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21 Functional claim - health claim: carboidrati (fibra) e oligosaccaridi non digeribili (prebiotici) Ceppi microbici (probiotici) Polisaccaridi di superficie dei lattobacilli antigeni Attività macrofagi e linfociti

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24 Criteri di selezione dei probiotici Origine umana. Accurata identificazione tassonomica. GRAS (Generally Recognized As Safe), non tossico, non patogeno. Assenza di resistenza agli antibiotici (QPS_EFSA 2003) Capacità di sopravvivere, proliferare e di svolgere attività metaboliche in vivo a livello del sito target. Resistenza agli acidi. Resistenza alla bile. Capacità di adesione e potenziale capacità di colonizzazione (anche transitoria).

25 Attività funzionali: Capacità di esplicare uno o più benefici sulla salute, clinicamente documentati: Prevenzione della colonizzazione da parte di batteri patogeni. Stimolazione della risposta immunitaria. Produzione di sostanze antimicrobiche (batteriocine, perossido d idrogeno, acidi organici o altri composti inibitori). Attività antimutagene e anticancerogene. Produzione di composti bioattivi (enzimi, peptidi).

26 adesione alla superficie della mucosa intestinale competizione per colonizzazione con patogeni (Guarner e Malagelada, 2003) Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) impedisce adesione di B. vulgatus alle cellule IEC-6 (Dieleman et al., 2003) stimolazione del sistema immunitario intestinale inibizione della sintesi di citochine proinfiammatorie (TNF-α e IL- 1β) e promozione di citochine antinfiammatorie (IL-10) (Dieleman et al., 2003) il trattamento con VSL#3 nei pazienti con pouchite ha determinato un aumento del numero e della diversità del microbiota intestinale, con aumento delle specie anaerobie e riduzione della la flora fungina (Kuehbacher et al., 2006).

27 Proprietà tecnologiche: Compatibilità con le tecnologie di produzione, di stoccaggio e di distribuzione. Stabilità delle caratteristiche desiderate nel corso della preparazione delle colture e dello stoccaggio. Caratteristiche di interesse tecnologico in riferimento allo specifico prodotto alimentare (o l assenza di caratteristiche non desiderabili).

28 linee guida FAO/WHO: criteri e le metodologie per la valutazione dei probiotici (informazioni necessarie per dimostrare funzione salutistica) saggiati almeno per: resistenza agli antibiotici; attività metaboliche (produzione di D-lattato; deconiugazione dei sali biliari); effetti collaterali negli studi su umani; produzione di tossine (ceppi appartenenti a specie conosciute come produttrici di tossine); attività emolitica (per ceppi appartenenti a specie conosciute come emolitiche). Necessità di sorveglianza per stabilità prodotto ed epidemiologica dopo la commercializzazione

29 Microorganismi utilizzati negli alimenti probiotici: Lactobacillus acidophilus Lactobacillus casei Lactobacillus plantarum Lactobacillus salivarius Lactobacillus bulgaricus Streptococcus thermophilus Lactococcus lactis Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Leuconostoc mesenteroides Bifidobacterium spp. Pediococcus acidilactici Sporolactobacillus inulinus Propionibacterium freudenreichii Saccharomyces cerevisae Saccharomyces boulardii Ceppi commerciali: Lb. acidophilus La5, Lb. acidophilus NCFB1748 Lb. plantarum 299v Lb. casei Shirota, Lb. casei Immunitass Lb. rhamnosus GG Lb. fermentum KLD Lb. paracasei F19 Lb. reuteri SD2112 Lb. johnsonii La1 Lb. salivarius UCC118 Bf. lactis (bifidum) Bb12 Bf. longum, BB536 Bf. Bifidum Bf. Infantis Bf. Breve Bf. Adolescentis

30 Lactobacillus Specie con 32-53% G+C Divise in 3 gruppi in base a metabolismo carboidrati (presenza/assenza fruttosio-1,6- difosfato aldolasi e fosfoketolasi) Bifidobacterium 32 specie, Correlato ad attinomiceti (alto G+C) Fermentano substrati diversi (B. bifidum anche saccarosio e melibiosio) con produzione di acido acetico oltre che lattico Mancano di aldolasi e glucosio-6-fosfato Deidrogenasi via del fruttosio 6 fosfato mediante fosfoketolasi

31 Enterococchi esclusi in alimenti probiotici resistenza vancomicina trasferibile?? Vancomycin resistance expressed by the probiotic strain L. rhamnosus GG has been studied in detail (Tynkkynen et al., 1998). Strain GG was not observed to transfer vancomycin resistance or receive other resistance elements from enterococci, nor were any genes resembling enterococcal vancomycin resistance genes found in Lactobacillus GG (Tynkkynen et al., 1998). Similarly, Klein et al. (2000) reported no indications for the presence of the vana gene cluster, the vanb gene or the vanc gene from five L. reuteri strains or L. rhamnosus GG, suggesting that the vancomycin resistance of the strains studied is unrelated to the acquired resistance in the Enterococcus species.

32 Prebiotici Ingredienti alimentari non digeribili, in grado di esercitare un effetto positivo sulla salute dell ospite attraverso la stimolazione selettiva della crescita e/o dell attività di un limitato numero di batteri nel colon, in particular modo di lattobacilli e/o bifidobatteri. Azione prebiotica : Inulina fruttosil-oligosaccaridi (FOS) trans-galattosil-oligosaccaridi (TOS) Taurina Colina Inositolo Terpeni Carotenoidi Polifenoli Antocianine flavonoidi

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34 Alimenti simbiotici L alimento simbiotico è costituito dall associazione di un alimento probiotico con alimenti prebiotici in rapporti tali da rispondere al razionale di alimento funzionale. Attualmente sono prodotti diversi alimenti simbiotici. In particolare yogurt e altri derivati del latte e le formule lattee di proseguimento, arricchite di Bifidobatteri e lattobacilli probiotici e FOS.

35 Iter scientifico per arrivare all attribuzione di proprietà salustiche agli alimenti Primo livello: ricerca di base e sperimentazione; identificazione e comprensione dei meccanismi di interazione tra alimento e modulazione dell espressione genica e di funzioni biochimiche cellulari, al fine di dimostrare i potenziali effetti fisiologici Secondo livello: sviluppo di modello e metodologie per dimostrare, attraverso studi di nutrizione umana, questi effetti e le loro conseguenze Terzo livello: disegno di adeguati studi di nutrizione umana per dimostrare, al di là degli effetti funzionali, un beneficio sulla salute, compresa la prevenzione di malattie, così da autorizzare l uso di health claim

36 ALIMENTI INNOVATIVI NOVEL FOOD Regolamento del Parlamento europeo (n.258/97):denominazione di novel food è attribuita a prodotti o ingredienti alimentari che rientrano in una delle seguenti categorie: 1. Alimenti e ingredienti di alimenti contenenti o costituiti da organismi geneticamente modificati 2. Alimenti e ingredienti di alimenti prodotti da, ma non contenenti, organismi geneticamente odificati 3. Alimenti e ingredienti di alimenti con struttura molecolare primaria nuova o intenzionalmente modificata

37 Produzione di formaggi

38 Biotecnologie innovative applicate alla produzione lattiero-casearia Caglio o presame Contiene prevalentemente rennina o chimosina; produzione di chimosina da cellule di pancreas bovino: 1) isolamento mrna codificante per prochimosina e retrotrascrizione a cdna oppure isolamento prochimosina, determinazione sequenza aminoacidica sequenza nucleotidica sintetica 2) inserto (cdna specifico) in vettore espressione (plasmide o fago) 3) trasformazione microrganismo ospite 4) produzione ed escrezione di prochimosina nel mezzo di coltura 5) conversione della prochimosina in chimosina attiva;

39 Plug-in microbici durante la produzione di formaggi fermentazione del latte ad opera dei batteri lattici formazione della cagliata per coagulazione acida maturazione o stagionatura della cagliata Fermentazioni guidate mediante colture starter Batteri propionici/streptococchi (occhiatura dei formaggi tipo emmenthal) Muffe/lieviti (erborinatura del gorgonzola)

40 biotecnologie per la produzione di formaggi Fermentazioni/maturazioni guidate mediante colture starter

41 Colture starter Definizione preparazioni che contengono microrganismi vivi utilizzazione del metabolismo microbico per il raggiungimento di obiettivi tecnologici Classificazione Colture starter con ceppi misti: colture a composizione indefinita fermentati risultanti da lavorazioni precedenti) Colture starter a singolo ceppo Colture starter a ceppi multipli, di una o più specie (substrati

42 Colture protettive Coltura starter o non in grado di esercitare azioni antimicrobiche nei confronti di microrganismi indesiderati batteriocine Proteine biologicamente attive o complessi proteici in grado di esercitare attività battericida nei confronti di altre specie batteriche, ma non sul microrganismo produttore Es. Nisina: peptide contenente 34 aminoacidi (3354 Da), prodotta da ceppi di Lactococcus lactis subsp. lactis. Attiva contro altri batteri lattici e patogeni (Listeria monocytogenes e Clostridium botulinum) uso consentito per aumentare i tempi di conservazione di latte e derivati, conserve vegetali, prodotti carnei freschi e fermentati e prodotti ittici

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46 Colture starter: perchè si usano? garantiscono decorsi fermentativi più regolari determinano più efficacemente la riduzione e la progressiva scomparsa dei microrganismi indesiderati possono ridurre i tempi di stagionatura consentono produzioni qualitativamente più costanti

47 Caratteri di colture starter e/o protettive gli organismi usati non devono essere dotati di attività patogena o tossica devono essere in grado di competere con la microflora autoctona e di svolgere le attività metaboliche per le quali sono stati selezionati nelle condizioni di processo la propagazione degli organismi starter deve essere economicamente conveniente la coltura starter deve poter essere conservata allo stato congelato o liofilizzato senza perdita delle peculiarità metaboliche le proprietà metaboliche devono essere stabili per molti mesi nelle condizioni di stoccaggio manipolazione e impiego devono essere semplici

48 Tipologie di starter naturali: Latto-innesti Siero-innesti selezionati: Liquidi In polvere (liofilizzati o essiccati) Congelati

49 La scotta-innesto coltura naturale di batteri lattici in scotta (siero residuo dalla preparazione della ricotta) microflora dominante: Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus thermophilus Lactobacillus helveticus Variabile rapporto tra forme bacillari e cocciche Variabile acidità assicura mantenimento di caratteri tipici dati da microflora proveniente dall'ambiente di

50 Le confezioni degli starters devono riportare le seguenti indicazioni: Specie microbiche contenute Titolo di microrganismi viventi Denominazione degli eccipienti Periodo di validità Modalità di corretto impiego tecnologico Nome e sede stabilimento di produzione

51 maturazione o stagionatura della cagliata metabolizzazione dell acido lattico da parte di lieviti, muffe e batteri propionici; idrolisi dei trigliceridi in acidi grassi liberi; idrolisi delle caseine in peptidi, aminoacidi e composti aromatici; modificazioni del ph e dell attività dell acqua; ammorbidimento della pasta; formazione della crosta; modifica dell aspetto; sviluppo dell aroma e del sapore del formaggio; colonizzazione microbica della crosta. Batteri: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc ed Enterococcus, micrococchi e stafilococchi, propionibatteri, corinebatteri. batteri alterativi (clostridi, bacilli, coliformi) e patogeni (L. monocytogenes, Salmonella e altri) Lieviti: Debaryomyces hansenii, Kluyveromyces marxianus, Yarrowia lipolytica (metabolismo lattato e lipolisi) Muffe: in formaggi a crosta fiorita (Penicillium candidum) ed erborinati (Penicillium

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53 Per la produzione del Pecorino Toscano vengono impiegati colture di fermenti lattici autoctoni, naturali o selezionati, mesofili e termofili, singolarmente o in combinazione: Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, Streptococcus termophilus, Lactobacillus bulgaricus

54 Lc1 Lc2 Lc3 Lc4 Lc5 Lc6 Lc7 Lc8 Ent1 Ent2 Ent3 Ent4 Ent5 Ent6 Ent7 Ent8 Ent9 Ent10 Ent11 Ent12 Ent13 Ent14 Ent15 Lb1 Lb20 Lb21 Lb22 Lb27 Lb28 Lb29 Lb30 Lb31 Lb32 Attività aminopeptidasica (%) su H-Lys- bna Aminopeptidase activity (%) on H-Lys- b Na Selezione di starter con caratteristiche enzimatiche peculiari Lactococcus lactis subsp. lactis Lactococcus lactis subsp. Cremoris Lactobacillus plantarum Lactobacillus casei Lactobacillus brevis Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Ceppi Strains

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60 Difetti della pasta Gonfiore precoce: formaggi freschi e a pasta molle. occhiature entro 24 ore dalla produzione. dovute a batteri coliformi, lieviti e batteri lattici eterofermentanti. CAUSE: latte con antibiotici elevato contenuto microbico batteriofagi su starter Gonfiore tardivo: formaggi a lunga stagionatura (>3 mesi). occhiature causate da batteri anaerobi (clostridi e propionici - lattato acido butirrico/propionico + CO 2 + H 2 ) CAUSE: clostridi e propionici contaminanti stagionatura a t troppo elevate insufficiente acidificazione o salatura