Apartire dall acido nalidixico, la classe dei

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1 Le Infezioni in Medicina, Supplemento 2, Vol. 1, Aprile Fluorochinoloni e Gram-negativi: differenze di attività e nuove evidenze sui meccanismi di resistenza Fluoroquinolones and Gram-negative bacteria: antimicrobial activity and mechanisms of resistance F. Luzzaro spedale di Circolo e Università dell Insubria, Varese, Italy Apartire dall acido nalidixico, la classe dei chinoloni è andata evolvendosi nel tempo, attraverso modificazioni strutturali che ne hanno di volta in volta variato, in qualche misura, l attività microbiologica e le caratteristiche farmacocinetiche. Su questa base, è dunque possibile distinguere: 1) chinoloni di prima generazione (ad es. acido nalidixico e acido pipemidico) attivi sui batteri Gram-negativi, con caratteristiche farmacocinetiche tali da consentirne l impiego esclusivamente per il trattamento delle infezioni del tratto urinario; 2) chinoloni di seconda generazione (ad es. ciprofloxacina e levofloxacina) attivi sui batteri Gram-negativi, incluso Pseudomonas aeruginosa, ma anche su molti batteri Gram-positivi, in grado di raggiungere livelli ematici utili a trattare anche infezioni sistemiche e con un attività, per quel che concerne levofloxacina, rivolta anche verso Streptococcus pneumoniae e Stenotrophomonas maltophilia; 3) chinoloni di terza generazione (ad es. gatifloxacina e moxifloxacina) contraddistinti da un elevata attività verso i batteri Gram-positivi (specialmente Streptococcus pneumoniae) e da una buona attività verso batteri anaerobi e patogeni atipici, ma molto meno attivi verso Pseudomonas spp. [1]. Il meccanismo d azione dei fluorochinoloni si esplica attraverso la loro interazione con le topoisomerasi di tipo II (DA girasi e topoisomerasi IV), enzimi essenziali per la replicazione del cromosoma e per la trascrizione e riparazione del DA. L inibizione dell attività delle topoisomerasi batteriche determina una frammentazione del cromosoma, ed è pertanto responsabile dell attività battericida. Rispetto a tale meccanismo d azione dei fluorochinoloni, i microrganismi hanno sviluppato meccanismi di resistenza consistenti in modificazioni mutazionali del bersaglio (GyrA/GyrB per la DA girasi e ParC/ ParE per la topoisomerasi IV) o in un ridotto accesso al bersaglio, per riduzione della permeabilità o per aumentata espressione delle pompe di efflusso tra le quali principalmente AcrAB e MexAB. Le mutazioni che intervengono a carico del bersaglio d azione possono essere singole o multiple, determinando di conseguenza livelli di MIC più o meno elevati: una singola mutazione produce un aumento moderato delle MIC mentre mutazioni multiple determinano elevati livelli di resistenza. Tali resistenze mutazionali non sono trasferibili, se non verticalmente alla progenie. Per molto tempo si è creduto che la resistenza acquisita ai fluorochinoloni fosse solo di tipo mutazionale ma questo assioma, ovvero l assenza di resistenza plasmidica ai fluorochinoloni, oggi non è più attuale. Dal punto di vista dell epidemiologia delle resistenze, ciprofloxacina e levofloxacina esplicano un attività simile sugli enterobatteri e su Pseudomonas aeruginosa (Figura 1) tanto da essere considerati fino al 2 (almeno per gli enterobatteri) uno l alternativa dell altro nel pannello di antibiotici di cui il CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) suggeriva di valutare la sensibilità. el 27, lo stesso CLSI ha invece modificato questa indicazione, suggerendo di testare 5

2 Levofloxacina Ciprofloxacina LVX CIP MIC5 1.5 MIC % Inhibited at MIC Pseudomonas aeruginosa MIC bpt CIP bpt LVX Figura 1 - Distribuzione MIC per gli isolati di P. aeruginosa raccolti nello studio. entrambe le molecole sia nei confronti degli enterobatteri che di Pseudomonas aeruginosa. Questa modifica trova la sua ragion d essere in una serie di evidenze riportate negli ultimi anni. La prima di queste evidenze è rappresentata dal fatto che, accanto ai meccanismi classici di resistenza cromosomici, si è di recente messa in evidenza una resistenza acquisita dovuta alla presenza di proteine di resistenza ai chinoloni (Qnr), codificate da geni trasmissibili attraverso plasmidi. Queste proteine hanno una funzione di protezione del bersaglio in quanto presentano affinità di legame per le topoisomerasi, in particolare per le DA girasi, e rendono i microrganismi che le possiedono bersaglio inaccessibile ai fluorochinoloni. L interazione tra proteine Qnr e DA girasi, tuttavia, non inibisce la funzione di questi enzimi, consentendo dunque la sopravvivenza del microrganismo pur in presenza di fluorochinoloni. Attualmente, si riconoscono tre famiglie principali di Qnr - QnrA, QnrS e QnrB - contraddistinte da una distribuzione geografica caratteristica (Figura 2). A livello nazionale, i dati relativi all incidenza e alla distribuzione dei determinanti Qnr sono ancora scarsi ma i dati di Tumbarello et al. [2] e Rossolini G.M. (comunicazione personale) indicano complessivamente una distribuzione più ampia per le proteine QnrA, accanto alla presenza di proteine QnrB a Roma, apoli e Palermo. Le specie batteriche maggiormente coinvolte da questo meccanismo di resistenza sono Enterobacter spp., Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae. Altri microrganismi, quali Proteus mirabilis e Gram-negativi non fermentanti come Acinetobacter spp. e Pseudomonas aeruginosa sono finora esclusi da questo tipo di resistenza. La protezione del bersaglio fornita dalle proteine Qnr si traduce in un moderato aumento delle MIC per i fluorochinoloni, senza modificare in genere l interpretazione dei risultati nell antibiogramma, in quanto le MIC, come riportato in Tabella 1, restano spesso al di sotto del breakpoint di sensibilità [3-5]. A questo impatto relativo sui valori di MIC corrisponde tuttavia un più rilevante impatto sulla MPC (Mutant Prevention Concentration), un nuovo parametro microbiologico che indica la più bassa concentrazione di antibiotico alla quale non si osserva la comparsa di mutanti allorquando si utilizzano elevati inoculi di batteri (all incirca ) in appropriate condizioni di incubazione. Di fatto, questo parametro misura la

3 Los Angeles Calgary Minnesota Illinois Colorado Louisiana Maine ew York Georgia Alabama Utrecht Liverpool Berlin Paris Santander Cairo Instanbul Jerusalem Seoul Anhui Province Aichi Prefecture Shanghai Hawaii Bangkok Hong Kong Coimbatore Ho Chi-Minh City QnrA QnrB QnrS QnrA and QnrB QnrA and QnrS QnrA, QnrB and QnrS Sydney Figura 2 - Emergenza, su scala mondiale, della resistenza plasmide-mediata ai chinoloni. Tabella 1 - Impatto delle proteine Qnr sulla sensibilità ai chinoloni. MIC (µg/ml) E. coli WT E. coli (QnrA) E. coli (QnrB) E. coli (QnrS) Acido nalidixico Ciprofloxacina,,12-2,25-1,12-,5 Levofloxacina,15,25-1,25-,5 D Moxifloxacina,3, ,25 capacità di un antibiotico di prevenire la resistenza. Infatti, come evidenziato in uno studio condotto nel 25 da Jacoby [], allorché si utilizza un ceppo selvaggio di E. coli, in condizioni di inoculo molto elevato, già bassissime concentrazioni di ciprofloxacina (,12 µg/ml), non consentono l isolamento di mutanti. Tuttavia, quando si prendono in considerazione ceppi con mutazione in GyrA o presenza di proteine Qnr, pur non riflettendosi le mutazioni in aumenti significativi delle MIC, tuttavia i valori di MPC risultano notevolmente incrementati, di circa volte, rispetto al ceppo selvaggio (Figura 3). Inoltre, un recentissimo studio di Rodrìguez- Martìnez et al. [7] ha dimostrato che in presenza del gene QnrA1 si selezionano facilmente mutazioni nei geni GyrA e ParC in grado di produrre elevati livelli di resistenza ai fluorochinoloni. Dunque, le proteine Qnr, pur influenzando solo minimamente la MIC, rappresentano in ogni caso segnali che possono preludere ad elevati livelli di resistenza (Figura 4). Un altro lavoro che ha evidenziato l aumento della MPC è quello condotto da Robicsek et al. [], laddove il valore della MPC passava da,2 μg/ml, nel ceppo selvaggio Escherichia coli J53, a 3,3 μg/ml in presenza di QnrA1, ma anche di aac( )-Ib-cr. AAC( )-Ib-cr è un enzima derivato da AAC( )- Ib per una lieve modificazione, che tuttavia gli 7

4 GyrA Qnr Viable count, log cfu/plate 4 E. coli J53 E. coli J53 gyra mutant Viable count, log cfu/plate 4 E. coli J53 E. coli J53 gyra mutant Ciprofloxacin concentration, µg/ml Ciprofloxacin concentration, µg/ml Figura 3 - Meccanismo di resistenza ai chinoloni. Aumento della MPC in presenza di mutanti GyrA o Qnr (da: Jacoby G.A., modificato []). 12 Effect of qnra1 o the MPC of CIP 4 Ciprofloxacin 42 µm Kanamycin 42 µm Viable count, log cfu/plate 4 2 MIC MPC MIC MPG nmol Ciprofloxacin (µg/ml) E. coli DHB E. coli DHB pacyc14 E. coli DHB pacyc14+qnra Time (min) Figura 4 - Elevato aumento della MPC in presenza del gene QnrA1 (da: Rodrìguez-Martìnez J.M. et al., modificato [7]). Figura 5 - Inattivazione per acetilazione: un nuovo meccanismo di resistenza ai fluorochinoloni) da: Robicsek A. et al., modificato [9]). conferisce peculiari caratteristiche che lo rendono unico. Isolato casualmente nell ambito di studi rivolti ai meccanismi di resistenza batterica verso gli aminoglicosidi, questo enzima si è poi rivelato in grado di inattivare, mediante acetilazione, non solo gli aminoglicosidi, ma anche la ciprofloxacina, rappresentando dunque il primo esempio di un enzima che ha subito delle variazioni che lo rendono in grado di inattivare antibiotici appartenenti a due diverse classi di farmaci (Figura 5) [9]. Tuttavia, non tutti i fluorochinoloni possiedono nella propria struttura chimica il sito disponibile all acetilazione, ovvero l azoto amminico dell anello piperazinico, e infatti sono sensibili all azione di questo enzima la ciprofloxacina e la norfloxacina ma non la levofloxacina (Figura ); in ogni caso, l inattivazione mediante acetilazione ha un impatto modesto sulle MIC (Tabella 2) ma notevole, come precedentemente mostrato, sulla MPC. Per quel che concerne l epidemiologia, dati statunitensi indicano, in

5 Levofloxacina on tutti i chinoloni hanno un anello piperazinico con un azoto aminico acetilabile F H H 3 C CH 3 4 Levofloxacina 2 µm Ciprofloxacina 2 µm 3 Ciprofloxacina nmol 2 F H H Tempo (min) Figura - Cinetica enzimatica di AAC(')-Ib-cr; confronto del tasso di acetilazione di Levoxacina e Ciprofloxacina. Escherichia coli, una netta prevalenza di questo nuovo enzima rispetto alle proteine Qnr []. È dunque evidente, alla luce di queste nuove ac- Tabella 2 - Impatto di AAC( )-Ib-cr sulla sensibilità ai chinoloni (da: Robicsek A. et al., modificato [9]). MIC (µg/ml) E. coli WT E. coli AAC( )-IB-CR orfloxacina.15.2 Ciprofloxacina.2. Levofloxacina.. Gemifloxacina.5.5 Tabella 3 - Resistenza trasferibile agli aminoglicosidi per metilazione di G145 in 1S rra e ai fluorochinoloni idrofili per pompa di efflusso mediata da QepA in Escherichia coli (da: Pèrichon B. et al., modificato [11]). MIC (µg/ml) E. coli C C/QepA Acido nalidixico 2 2 orfloxacina. 1.5 Ciprofloxacina.2.25 Levofloxacina.3.3 Moxifloxacina..9 quisizioni, che in termini di resistenza batterica non è più possibile equiparare un fluorochinolone ad un altro, in quanto ciascuna molecola è sensibile, in maniera diversa, a meccanismi di resistenza differenti. Inoltre, nel panorama di nuovi meccanismi di resistenza, un lavoro di Périchon et al. [11] segnala l esistenza di un ulteriore meccanismo tramite una pompa di efflusso che, diversamente da quelle già note, è plasmide-mediata, è codificata da un gene denominato QepA e agisce tramite un meccanismo di tipo selettivo. Sono infatti sensibili all azione di questa pompa di efflusso solo i fluorochinoloni idrofilici, quali norfloxacina e ciprofloxacina ma non tutti gli altri, quali levofloxacina, moxifloxacina, ecc. (Tabella 3). In conclusione, si può affermare che la rilevazione di questi nuovi meccanismi di resistenza plasmide-mediati rappresenta sicuramente una importante novità che può aiutare a comprendere meglio l epidemiologia delle resistenze batteriche. Sicuramente l impatto sulla MIC risulta modesto mentre un impatto molto maggiore può essere messo in evidenza in vitro valutando la MPC. Il monitoraggio di questi nuovi meccanismi è imprescindibile, perché rappresenta l unico modo attraverso cui comprendere meglio l evoluzione delle resistenze batteriche e mettere in atto terapie appropriate. Key words: fluoroquinolones, Gram-negatives, mechanism of resistance. 9

6 RIASSUT Il meccanismo d azione dei fluorochinoloni si esplica attraverso l interazione con le topoisomerasi di tipo II (DA girasi e topoisomerasi IV). Rispetto a tale meccanismo, i microrganismi hanno sviluppato meccanismi di resistenza consistenti in modificazioni mutazionali del bersaglio (GyrA/GyrB per la DA girasi e ParC/ParE per la topoisomerasi IV) o in un ridotto accesso al bersaglio stesso, per riduzione della permeabilità o per aumentata espressione delle pompe di efflusso tra le quali AcrAB e MexAB. Accanto a questi meccanismi classici di resistenza cromosomica, è stata di recente messa in evidenza la presenza di proteine di resistenza ai chinoloni (Qnr), codificate da geni trasmissibili attraverso plasmidi, soprattutto in Enterobacter spp., Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae, mentre Proteus mirabilis e Gram-negativi non fermentanti come Acinetobacter spp. e Pseudomonas aeruginosa sono rimasti finora esclusi da questo tipo di resistenza. Le proteine Qnr determinano un moderato aumento della MIC che resta spesso al di sotto del breakpoint di sensibilità, mentre più rilevante è l impatto sulla MPC. uovi meccanismi specifici di resistenza sono stati inoltre descritti. AAC( )-Ib-cr è il primo esempio di enzima in grado di inattivare, mediante acetilazione, antibiotici appartenenti a due diverse classi di farmaci, aminoglicosidi e fluorochinoloni. ell ambito di questi ultimi, tuttavia, sono sensibili all azione di questo enzima la ciprofloxacina e la norfloxacina ma non la levofloxacina. È stata infine segnalata l esistenza di un ulteriore meccanismo di resistenza, una pompa di efflusso plasmide-mediata, codificata da un gene denominato QepA, che agisce tramite un meccanismo di tipo selettivo. Sono sensibili all azione di questa pompa di efflusso solo i fluorochinoloni idrofilici, quali norfloxacina e ciprofloxacina, ma non tutti gli altri, quali levofloxacina, moxifloxacina, ecc. Alla luce di queste nuove acquisizioni, appare evidente che, in termini di resistenza batterica, non è più possibile equiparare un fluorochinolone ad un altro, in quanto molecole differenti possono risultare diversamente attive, in rapporto allo specifico meccanismo di resistenza. SUMMARY Fluoroquinolones acts by interacting with type II topoisomerases (DA gyrase and topoisomerases IV). Related to this mechanism of action, bacteria have developed resistance mechanisms consisting in some target mutations (GyrA/GyrB for DA gyrase and ParC/ParE for topoisomerase IV) or in a reduced access to the target itself, by either decreased permeability or augmented expression of efflux pumps, such as AcrAB and MexAB. Along with these classical mechanisms of chromosomal resistance, the presence of fluoroquinolones resistant proteins (Qnr) has been recently evidenced, codified by transmissible genes by means of plasmids, especially in Enterobacter spp., Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae, whereas Proteus mirabilis and non fermenter Gram-negative, like Acinetobacter spp. and Pseudomonas aeruginosa, are not involved in such a kind of resistance. Qnr proteins determine a slight increase in MIC values, which often remains below the susceptibility breakpoint. More relevant is their impact on MPC values. Additionally, new specific resistance mechanisms have been described. AAC( )-Ib-cr represents the first enzyme able to inactivate, by acetylation, antimicrobials of two different classes, aminoglycosides and fluoroquinolones. However, ciprofloxacin and norfloxacin, but not levofloxacin, are susceptible to this enzyme action. Finally, the presence of another resistance mechanism has been reported, an efflux-pump plasmid-mediated, codified by the gepa gene, which acts by a selective mechanism. nly idrophilic fluoroquinolones, i.e. norfloxacin and ciprofloxacin, but not all the other ones, i.e. levofloxacin, moxifloxacin, etc., are affected by this mechanism. In the light of these new information, it is clear that, in terms of bacterial resistance, it is not any more possible to assimilate one fluoroquinolones to another, since different molecules can be diversely active, due to the specific resistance mechanism. BIBLIGRAFIA [1] Mascaretti.A. Inhibitors of DA gyrase and topoisomerase IV: quinolones. In: Bacteria versus antibacterial agents: an integrated approach, , 23, ASM press, Washington, DC. [2] Tumbarello M., Sanguinetti M., Montuori E. et al. Predictors of mortality in patients with bloodstream infections caused by extended-spectrum β-lactamaseproducing Enterobacteriaceae: importance of inadequate initial antimicrobial treatment. Antimicrob. Agents Chemother. 51,, , 27. [3] Robicsek A., Jacoby G.A., Hooper D.C. The worldwide emergence of plasmid-mediated quinolone resistance. Lancet Infect. Dis.,, 29-4, 2. [4] Jacoby G.A. Beta-lactamase nomenclature. Antimicrob. Agents Chemother. 5, 4, , 2. [5] Cattoir V., Poirel L., ordmann P. Plasmid-medi-

7 ated quinolone resistance determinant qnrb4 in France from an Enterobacter cloacae clinical isolate co-expressing a qnrs1 determinant. Antimicrob. Agents Chemother., 2, , 27. [] Jacoby G.A. Mechanisms of resistance to quinolones. Clin. Infect. Dis. suppl. 2, 15, 41, S12-S12, 25. [7] Rodrìguez-Martìnez J.M., Velasco C., Garcìa I., Cano M.E. Mutant Prevention Concentrations of fluoroquinolones for Enterobacteriaceae expressing the plasmid-carried quinolone resistance determinant qnra1. Antimicrob. Agents Chemother. 51, , 27. [] Robicsek A., Jacoby G.A., Hooper D.C. The worldwide emergence of plasmid-mediated quinolone resistance. Lancet Infect. Dis., 29-4, 2. [9] Robicsek A., Strahilevitz J., Jacoby G.A. et al. Fluoroquinolone-modifying enzyme: a new adaptation of a common aminoglycoside acetyltransferase. ature Medicine 12, 1, 3-, 2. [] Park C.H., Robicsek A., Jacoby G.A., Sahm D., Hooper D.C. Prevalence in the United States of aac( )-Ib-cr encoding a ciprofloxacin-modifying enzyme. Antimicrob. Agents Chemother. 5, , 2. [11] Pèrichon B., Courvalin P., Galimand M. Transferable resistance to aminoglycosides by methylation of G145 in 1S rra and to hydrophilic fluoroquinolones by QepA-mediated efflux in Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemother. 51, 7, ,