IGM CNR ICH HUMANITAS SUPERPIG. LE CELLULE ips

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1 IGM CNR ICH HUMANITAS SUPERPIG LE CELLULE ips

2 Sottoprogetto 3: Medicina Rigenerativa Questo sottoprogetto si propone di sviluppare approcci innovativi che, partendo da cellule dell organismo adulto, consentano la produzione di cellule differenziate pertinenti a tessuti specifici quali quelli ematopoietici e cardiaci. Queste cellule, ottenute mediante tecnologie di riprogrammazione (cellule ips) con successiva differenziazione, oppure differenziate da specifiche popolazioni staminali già presenti nell organismo adulto (es. emangioblasta), possono fornire alla comunità scientifica una base fondamentale per lo sviluppo di tecnologie di medicina rigenerativa nel modello suino che è in grado di riprodurre in maniera più realistica aspetti di fisiologia umana che il modello murino non è in grado di assicurare. Tale ricerca si avvarrà anche della collaborazione con un unità di ricerca che ha sviluppato tecnologie specifiche per l identificazione in vivo di cellule fluorescenti.

3 Sottoprogetto 3: Medicina Rigenerativa Sotto-Obiettivi: utilizzazione di vettori virali eliminabili per riprogrammare fibroblasti di maiale e ottenere ips (P2) differenziamento delle ips verso le cellule del sistema ematopoietico (P2) differenziamento di cellule staminali ematopoietiche suine verso cellule della linea eritroide ed endoteliale (P6) generazione di cardiomiociti derivati da ips: definizione di metodi di differenziamento e analisi funzionale in vivo in modelli insufficienza cardiaca cronica (P6) biopsia ottica per saggiare la presenza (engrafting) delle cellule trapiantate (P7)

4 S.O. 3.1 Utilizzazione di vettori virali eliminabili per riprogrammare fibroblasti di maiale e ottenere ips (Mese 1-24) Nel nostro laboratorio abbiamo messo a punto la produzione di cellule ips di topo, mediante l uso di un unico vettore virale che può essere eliminato successivamente grazie alla tecnologia crelox. Le cellule ips di suino verranno prodotte sfruttando le conoscenze acquisite in quest ambito. In particolare, pur essendo disponibili nel topo varie metodiche, comprese quelle che riescono ad evitare l uso di vettori virali, noi utilizzeremo per il lavoro sul suino la strategia basata sull utilizzo di un unico vettore virale che esprime tre geni contemporaneamente. Infatti, è stata messa a punto l infezione con unico vettore lentivirale che esprime Oct4, Sox2 e Klf4, seguita, una volta che si sono ottenute le ips, dall eliminazione del vettore con il sistema cre-lox. La stessa procedura verrà utilizzata per la produzione di ips partendo da fibroblasti di maiale. Contemporaneamente le cellule verranno analizzate per l espressione di Oct4 (e altri geni) endogeno, per la capacità di differenziarsi in vari tipi tissutali in vitro e per la formazione di teratomi nel topo nudo.

5 Introduzione alle cellule ips Le cellule ips sono cellule riprogrammate. Durante lo sviluppo embrionale le cellule perdono via via la loro capacità di differenziarsi in tutti i tessuti (pluripotenza) per acquisire le caratteristiche specifiche delle cellule dei singoli tessuti. Si riteneva che questo fosse un processo irreversibile, ma gli esperimenti di clonazione hanno dimostrato che in condizioni molto particolari il recupero dell originale pluripotenza può essere ottenuto. La procedura di clonazione è difficile, inefficiente e solleva obiezioni etiche. La recente tecnologia delle ips messa a punto da ricercatori giapponesi e poi diffusasi in tutta la comunità scientifica tende a superare queste difficoltà, pur non essendo essa stessa scevra di problematiche. Il razionale delle ips è illustrato nella figura seguente: le cellule dell adulto riprogrammate vengono poi indirizzate verso il tessuto di interesse.

6 Schema per la produzione di cellule pluripotenti indotte (ipsc) Riprogrammazione MESODERMA Cardiomiociti Cellule β pancreatiche Cellule neurali Test di tossicità e screening di farmaci Terapia genica e trapianto autologo ENDODERMA ECTODERMA Figure adapted from Amabile & Meissner 29 and from Han & Yoon 211

7 Generazione delle cellule ips Le cellule dell adulto vengono riprogrammate in vario modo. La modalità più diffusa prevede l utilizzo di 3 o 4 fattori di trascrizione che vengonon introdotti nelle cellule somatiche dell adulto mediante vettori retrovirali. Tuttavia sono state utilizzate altre procedure basate sull utilizzo di mrna, mirna, proteine, transposoni, plasmidi, sostanze chimiche. Una volta riprogrammate, le cellule vengono controllate per l acquisizione di pluripotenza e per la stabilità genomica. Nel caso siano stati usati vettori virali, si può procedere alla loro eliminazione mediante l uso di recombinasi (CRE). Se le cellule derivano da pazienti affetti da malattie genetiche, il difetto può essere corretto. Successivamente le cellule vengono forzate a differenziarsi verso I tessuti desiderati.

8 Schema riassuntivo della generazione di ipsc Vettore lentivirale wt oc/oc giorno fibroblasti trasduzione Terreno ES + LIF Recupero delle colonie ips MEF trattati con mitomicina VCN + Analisi del cariotipo Trasfezione con Plasmidi portatori di Cre recombinase VCN + Caratterizzazione

9 Controllo della pluripotenza Le colonie di ips ottenute vengono valutate per la loro pluripotenza, secondo quattro tipi di criteri: 1) Espressione di marker di pluripotenza (per Real Time PCR o immunoistochimica) 2) Capacità di differenziarsi in vitro nei derivati dei 3 foglietti embrionali 3) Formazione di teratomi in vivo 4) Iniezione in blastocisti (applicabile nel suino in linea teorica) Le due diapo successive mostrano un esempio di questa analisi (criterio 1 e 3)

10 Relative expression level Saggio della Fosfatasi alcalina Controllo della Pluripotenza Espressione di geni pluripotenti ES cells wt ipsc # wt ipsc # oc/oc ipsc #16.6 Feeder layer 1,1 Oct4 Sox2 Klf4 Nanog c-myc Utf1 Gdf3 Zfp42 Lin28 Oct4 Sox2 Klf4 Nanog c-myc Utf1 Gdf3 Zfp42 Lin28 Nanog Nanog Immunocitochimica per marker di staminalità Oct4 4X ingrandimento Sox2 SSEA-1 SSEA-1 Merge with DAPI FITC Merge DIC DIC 6X ingrandimento

11 Generazione di teratomi in topi nudi dopo inoculo di ipsc 5X ingrandimento Ectoderma Mesoderma Mesoderm B Endoderma Endoderm 4X ingrandimento

12 Analisi del cariotipo di cellule ipsc 82.6% % wt ipsc # wt ipsc # wt ipsc # oc/oc ipsc # % cromosomi chromosomes 4 4 cromosomi chromosomes 3.7% 11.1% 3.7% 3.7% 77.8% 38 cromosomi 39 cromosomi 4 cromosomi 41 cromosomi 43 cromosomi 6.7% 6.7% 8% 6.7% 38 cromosomi 39 cromosomi 4 cromosomi 41 cromosomi X Y

13 S.O 3.2 Differenziamento delle ips verso le cellule del sistema ematopoietico (Mese 1-24) ( ) Tuttavia, poichè sono già disponibili presso il nostro laboratorio linee ips di topo, già nei primi mesi del progetto verranno testati su di esse protocolli che consentano la differenziazione verso cellule del sistema ematopoietico e che verranno trasferiti alle linee ips di suino appena esse saranno disponibili. Come noto, le cellule ips, per poter essere utilizzate in medicina rigenerativa non possono essere introdotte come tali, ma devono essere forzate a differenziare verso specifiche linee tissutali in relazione alla cellula difettosa nella singola malattia. Nel nostro caso, siamo particolarmente interessati a ottenere cellule differenziate in due particolari tessuti: quello ematopoietico e quello cardiaco.

14 Il sistema ematopoietico murino Cellule ematopoietiche primitive c-kit+ CD41+ P Sacco vitellino Liver Placenta Cordone ombelicale regione AGM D Cellule ematopoietiche definitive c-kit+ CD45low Figure adapted from Seita and Weissman, 21 Figure adapted from Medvinsky et al, 211

15 c-kit CD11b c-kit <PE-A>: ckit <Alexa Fluor 488-A>: CD11b <PE-A>: ckit %CD45+ <PE-A> <Alexa Fluor 488-A> %CD41+ <PE-A> % CD41+ Cellule ipsc si differenziano in cellule ematopoietiche Day 12 - Unstained , c-kit+ CD11b+ c-kit- CD11b- c-kit- 2 1, ,5 d8 d9 d1 d11 d12 d <PE-Cy7-A>: CD <PE-Cy7-A>: CD45.98 d8 d9 d1 d11 d12 d8 d9 d1 d11 d <APC-A > Day LKS CD45low CD11b- CD45low CD11b CD <PE-Cy7-A>: CD45 CD <PE-Cy7-A>: CD45 Sca <APC-A >: Sca1 * * * Presenza di cellule CD45+ ematopoietiche Presenza di cellule mieloidicd11b Presenza di progenitori immaturi CD45low c-kit+

16 #CFC/2 plated c-kit+ CD45+ # CFCs/2 plated ckit+ CD45+ Le cellule ipsc danno origine a colonie ematopoietiche 7 6 Dalla frazione c-kit GEMM Immature CFU-E BFU-E CFU-Myelo d8 d9 d1 d11 d12 4X ingrandimento 1X ingrandimento 1X ingrandimento 4X ingrandimento Colonia Monocitica Colonia Granulocitamonocita Colonia immatura May-Grunwald-Giemsa staining 1X ingrandimento 4X inmgrandimento 4X ingrandimento 4X ingrandimento Colonia eritroide May-Grunwald-Giemsa Colonia GEMM staining Granulocita-Eritrocita Monocita-Megacariocita May-Grunwald-Giemsa staining

17 Conclusioni Il nostro lavoro nell ambito del progetto Superpig ha dimostrato che è possibile: 1) Ottenere cellule ips pluripotenti, senza sequenze esogene, con cariotipo normale 2) Queste cellule possono essere, almeno in parte, indirizzate verso un destino ematopoietico, a giudicare dai marker di membrana e dalla capacità di formare colonie ematopoietiche

18 Ringraziamenti