raccolta della luce (antenne). Una clorofilla dell'antenna ed eccitata da un fotone trasferisce

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1 I PIGMETI FTSITETII: analisi cromatografica e spettro di assorbimento; determinazione spettrofotometrica della concentrazione della a, b e totale Scopo dell'esercitazione è l'estrazione dei pigmenti dei cloroplasti di foglie di spinacio (o di altra specie), la loro separazione tramite TL e la determinazione degli spettri di assorbimento nell'intervallo di lunghezze d'onda nm. Inoltre verrà determinata la concentrazione delle clorofille a e b e della totale nelle foglie di spinacio utilizzando la diversa assorbanza nel rosso (massimi di assorbimento a e nm) delle due forme. ITRDUZIE I cloroplasti di tutte le Piante superiori contengono 2 classi principali di pigmenti che assorbono l'energia solare e partecipano direttamente o indirettamente al processo fotosintetico. Questi pigmenti sono le clorofille verdi (a e b) e i carotenoidi (normalmente rossi, arancione o gialli). aratteristica dei pigmenti, da cui deriva il loro nome, è quella di assorbire la radiazione elettromagnetica solare nell'intervallo di , lo stesso percepito dall'occhio umano. L'assorbimento della radiazione visibile è reso possibile dall'esteso sistema di doppi legami coniugati che caratterizza la molecola di tutti i pigmenti in conseguenza del quale si riduce il livello energetico della molecola eccitata. In tal modo anche la radiazione visibile (a alte e perciò ad energia minore), in accordo con la teoria quantistica, riesce ad eccitare la molecola di pigmento e quindi può essere utilizzata per il lavoro fotochimico. Grazie alle caratteristiche di assorbimento dei pigmenti fotosintetici le piante riescono ad utilizzare le radiazioni più abbondanti dello spettro solare convertendole in energia chimica di legame nel processo fotosintetico. La maggior parte dei pigmenti del cloroplasto non effettua lavoro fotochimico ma partecipa alla raccolta della luce (antenne). Una dell'antenna ed eccitata da un fotone trasferisce l'eccitazione ad altre clorofille, secondo un gradiente decrescente di energia di eccitazione (e quindi di crescenti della luce assorbita) ed infine alla a dei centri di reazione (P680 o P700). Le clorofille a e b sono i pigmenti più abbondanti delle piante. Le clorofille hanno una struttura porfirinica formata da 4 anelli pirrolici chelati al centro con un atomo di Mg 2+ ed una catena lineare di 20 atomi di carbonio, il fitolo, esterificato con il gruppo carbossilico di un residuo di acido propionico legato al I anello pirrolico (vedi figura). La differenza tra a e b consiste nella presenza nella prima di un gruppo metilico al posto di un gruppo aldeidico nell'anello II: ciò rende la a leggermente più solubile della b in solventi non polari come l esano. Questa caratteristica può essere utilizzata per separare cromatograficamente le due clorofille. La catena idrocarburica non polare del fitolo ha la funzione di ancorare la molecola di alla porzione idrofobica della membrana del tilacoide. La a ha una colorazione blu-verde e la b giallo-verde: il loro spettro di assorbimento della luce fra nm è infatti leggermente diverso. Entrambe hanno massimi di assorbimento nel blu-violetto (intorno a 450 nm) e nel rosso ( nm) e minimi nel verde e nel giallo ( nm); i picchi della b si trovano all'interno rispetto a quelli della a (nella zona del rosso il massimo di assorbimento della b, in acetone, corrisponde alla a anzichè nm, tipica della a). a notato che la a nella cellula intatta mostra molti picchi di assorbimento a superiori: 670, 680, 685, 690 e tra 695 e 720 nm. Questi picchi non sono dovuti alla presenza di forme molecolari diverse di a ma costituiscono

2 2 spostamenti di spettro dovuti alle interazioni con proteine o ad aggregazioni. Il rapporto tra le due clorofille nelle piante superiori e nelle alghe verdi è spesso di 2-3 clorofille a per una b, ma varia in relazione alle condizioni ambientali. I carotenoidi sono composti lipidici a 40 atomi di presenti in quantità diversa in quasi tutte le piante superiori. Benchè in una singola specie siano presenti carotenoidi di struttura diversa, essi possono essere classificati in 2 tipi principali: i caroteni e i caroteni ossigenati o xantofille (vedi figura). I caroteni sono idrocarburi non ossigenati, ad esempio il carotene (il carotene più abbondante nelle piante superiori) ha formula empirica 40 H 56. Le xantofille (due volte più abbondanti dei caroteni nelle foglie) contengono invece ossigeno negli anelli terminali ed hanno, in genere, formula empirica 40 H La funzione dei carotenoidi nel cloroplasto è duplice: ampliano lo spettro delle radiazioni utilizzate nel processo fotosintetico ed evitano la distruzione fotoossidativa della. Piante senza carotenoidi non sopravvivono alla luce. La maggior parte dei carotenoidi è di colore giallo, arancio, rosso e molti dei vivaci colori dei petali fiorali e la colorazione autunnale delle foglie sono dovuti alla loro presenza. MTERILI - Foglie di spinacio o altra specie (o di rum italicum), 0.5 g - cetone, 80 ml - Imbuto Buchner, filtro di carta hatman oppure centrifuga - mogeneizzatore (oppure mortaio e pestello) - 1 cilindro da 100 ml - solfato di magnesio anidro; sabbia silicea - Microsiringhe, pipette Pasteur, beute e tubi in vetro. PREDUR ESTRZIE E SEPRZIE DEI PIGMETI TRMITE TL - on un bisturi tagliare la lamina fogliare scartando le nervature più grosse. Pesare 0.5 g di questo materiale, aggiungere 0.5 g di solfato di magnesio anidro e 1 g di sabbia silicea. Macerare il materiale fino ad ottenere una polvere verde. Trasferire in un tubo di vetro, aggiungere 2 ml di acetone, agitare e lasciare in estrazione per 10 min. - entrifugare a 4000g per 5 minuti (in tubi orex). Separare l estratto liquido dal residuo solido e misurare il volume finale dell estratto. - Diluire l estratto 1:60 (100 µl in 6 ml di cetone) e conservarlo in tubo di vetro avvolto da carta stagnola (soluz. ). errà utilizzato per la determinazione spettrofotometrica della concentrazione della. - Lastra TL: con un righello fare un segno sulla silice a 3 cm dalla base (origine). Tracciare una linea sulla silice a 15 cm dall origine. pplicare, con l'ausilio di una microsiringa, un aliquota adeguata dell'estratto dei pigmenti sulla lastra per TL. - Sviluppare per 15 cm nell'apposita vasca con miscela di solventi: Esano-Etere dietilico- cetone = l termine lasciare asciugare la lastra e localizzare cromaticamente la posizione dei diversi pigmenti sulla lastra. Benchè sia difficile definire esattamente i valori di Rf dei diversi pigmenti, che variano con le condizioni sperimentali, tuttavia l'ordine di separazione e quindi la sequenza dei pigmenti sulla lastra è costante. - 1 lastra per TL, 5 x 20 cm, spessore 0.25 mm, preparata con silica gel G - Spettrofotometro

3 3 Di seguito si riporta la localizzazione cromatica sulla lastra dei principali pigmenti. Fronte del solvente giallo caroteni grigio blu-verde giallo-verde feofitina a b. giallo xantofille rigine verde chiaro clorofillide a La feofitina ha la struttura della senza l'atomo di Mg, mentre la clorofillide è senza il fitolo. - Se rimane tempo raschiare dalla lastra la silice corrispondente ai diversi pigmenti, trasferirla in tubi di vetro ed eluirla con 2 ml di acetone. - entrifugare a 1000 x g per 10 minuti, decantare e ripetere l'operazione di eluizione. Determinare allo spettrofotometro lo spettro di assorbimento dei pigmenti principali nell'intervallo di : In alternativa gli studenti potranno determinare lo spettro dei pigmenti eluiti da una lastra preparata il giorno precedente DETERMIZIE DELL ETRZIE DI LRFILL, B E TTLE - Misurare allo spettrofotometro l'assorbanza a 663.6, 652 e nm della soluzione ricordando di azzerare lo strumento con acetone ad ogni lunghezza d onda. - Ricordando che il massimo di assorbimento in acetone è per la b e per la a, mentre alla lunghezza d'onda di 652 entrambi i pigmenti hanno lo stesso assorbimento, calcolare, utilizzando la legge di Lambert-Beer, la concentrazione delle due clorofille e della totale (applicare le formule nei riquadri alla pagina seguente). = L = coefficiente di estinzione molare L = percorso della luce nella cuvetta = concentrazione della molecola assorbente = ( a x l xa ) + ( b x l x b ) (1) = ( a x l x a ) + ( b x l xb ) (2) a = coefficiente di estinzione della a a nm = ml cm -1-1 b = coefficiente di estinzione della b a nm = ml cm -1-1 a = coefficiente di estinzione della a a nm = ml cm -1-1 b = coefficiente di estinzione della b a nm = ml cm -1-1 a b 652 = coefficiente di estinzione della a b a 652 nm = 34.5 ml cm -1-1 l = 1 cm a = concentrazione della a ( ml -1 ) b = concentrazione della b ( x ml -1 ) Risolvendo per a nell'equazione 1 e sostituendo nell'equazione 2 si ricava il valore di b. Sostituendo il valore di b nell'equazione 1 si ottiene il valore di a. b / g di tessuto a / g di tessuto

4 = volume finale dell'estratto in acetone (in ml) = peso fresco del tessuto estratto (in g ) totale / g di tessuto totale / g di tessuto H 2 H R R = ( a) H ( b) Mg H H 2 H H H H 2 ß - carotene H H violaxantina

5 In alto: spettro di assorbimento delle clorofille a, b e dei carotenoidi. In basso: spettro di azione della fotosintesi. 5

6 6 DMDE 1) Perchè durante l estrazione dei pigmenti sono stati aggiunti solfato di magnesio anidro e sabbia? 2) In relazione alle equazioni usate per il calcolo della quantità di quale è l utilità dei coefficienti di assorbimento usati e perchè le letture della densità ottica sono state effettuate a 663.6, e 652 nm? 3) Perché nell analisi spettrofotometrica della non è necessario sottrarre dall assorbanza della quella dei carotenoidi che pure sono presenti nell estratto? 4) Quale differenza vi è tra spettro di assorbimento e spettro di azione e quale è la loro utilità? 5) Perché la soluzione di cambia colore da verde a rosso, quando è colpita da un raggio luminoso al buio? 6) ome si spiega la separazione dei pigmenti tramite TL? 7) Quali lunghezze d onda e quali colori assorbono maggiormente i diversi pigmenti fotosintetici?