Inquadramento clinico e diagnostico delle malattie muscolari

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1 Inquadramento clinico e diagnostico delle malattie muscolari

2 MIOPATIE Le miopatie sono un gruppo di malattie geneticamente determinate che si caratterizzano clinicamente per una debolezza muscolare progressiva che coinvolge i muscoli dei cingoli scapolare e pelvico e spesso il muscolo cardiaco.

3 DIAGNOSI MOLECOLARE nelle MALATTIE MUSCOLARI Limb girdle dystrophies: Dominant 1A: Myotilin; 5q31; Dysarthria 1B: Lamin A/C; 1q21; + Cardiac 1C: Caveolin-3; 3p25; Child onset 1D: 7q Dilated Cardiomyopathy (?1E): 6q23 1F: 7q32 1G: 4p21 Ankle contractures & High CK Bethlem: Collagen VI; 21q22 & 2q37 Central core: Ryanodine receptor (19q13) Cytoplasmic body: 2q24; 2q21 + Other Distal myopathies MPD2: 5q31;? Emery-Dreifuss: Lamin A/C; 1q21 Facioscapulohumeral: 4q35 Myofibrillar (Desmin storage) Desmin: 2q35; AD or AR αb-crystallin: 11q22 Filamin C: 7q32 LGMD 1A: Myotilin; 5q31 Congenital: SEPN1; 1p36 ZASP myopathy: 10q22 Other Myotonic (DM1): DMPK; 19q13 Myotonic (DM2): ZNF9; 3q21 Oculopharyngeal: PABP2; 14q11 Skeletal + Myopathy Bone fragility: 9p21 Paget disease: VCP; 9p13 Limb girdle dystrophies: Recessive 2A: Calpain-3 ;15q15 2B: Dysferlin; 2p13.1 2C: γ-sarcoglycan; 13q12 2D: α-sarcoglycan; 17q21 2E: β-sarcoglycan; 4q12 2F: δ-sarcoglycan; 5q33 2G: Telethonin; 17q H: TRIM32; 9q31-q33 2I: FKRP; 19q13.3 2J: Titin; 2q31 2K: POMT1; 9q34 Merosin (Laminin α2) Absent: 6q2 Reduced: 6q2 Abnormal: LGMD 2I Caveolin-3 mutation (Gly55Ser) Limb girdle dystrophies: X- linked Barth: G4.5 (Tafazzins); Xp28 Becker: Dystrophin; Xp21 Duchenne: Dystrophin; Xp21 Emery-Dreifuss: Emerin; Xq28 Manifesting carriers Dystrophinopathy Myotubularin McLeod Syndrome: XK; Xp21.1; Vacuolar Danon's disease: LAMP-2; Xq24 Excessive Autophagy: Xq28 Mental retardation & Cardiomyopathy Other inherited myopathy syndromes Barnes's myopathy Cardiac + Myopathy Cardiomyopathy-associated myopathy Cardiomyopathy (?LGMD1B) Dilated Cardiomyopathy: 6q23 Congenital Myopathies: Late-onset Muscular dystrophies Cytoplasmic body myopathies Distal myopathies Excessive autophagy: Xq28 Familial myasthenia gravis FSH dystrophy: 4q35 Hereditary IBM syndromes IBM1: Dominant IBM2: GNE; 9p12; Recessive IBM3: MyHC-IIa; 17p13; Dominant IBM + Paget disease: 9p13; Dominant Metabolic myopathies Glycogen Lipid Mitochondrial Myopathy + PEO: 17p13; Recessive Myotonic dystrophy Other dystrophies Respiratory failure Scapuloperoneal syndromes Skeletal + Myopathy Diaphyseal dysplasia: TGFB1; 19q13 Epiphyseal dysplasia: COL9A3; 20q13 Spheroid body (Myotilin) Tubular aggregates Tubular arrays

4 DISTROFIE MUSCOLARI Le distrofie muscolari sono un gruppo di malattie geneticamente determinate che si caraterizzano clinicamente per una debolezza muscolare progressiva che coinvolge i muscoli dei cingoli scapolare e pelvico e spesso il muscolo cardiaco. Il muscolo scheletrico mostra dal punto di vista istopatologico una progressiva sostituzione fibro-adiposa, degenerazione e rigenerazione (DISTROFIA).

5 Muscolo normale Muscolo distrofico H&E

6 LA BIOPSIA MUSCOLARE Selezione del muscolo appropriato Procedura bioptica Processamento del campione

7 Criteri di selezione del muscolo da biopsiare Evitare muscoli troppo deboli (i.e. ampiamente sostituiti da tessuto fibro-adiposo) o muscoli completamente normali (i.e. nessuna alterazione patologica) Scegliere un muscolo con debolezza di grado moderato (3+-4 MRC) Il muscolo deve essere esente da recenti traumi (EMG) o da patologia concomitante Tricipite, bicipite all arto superiore; quadricipite all arto inferiore Indicazioni particolari

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9 PREPARAZIONE del CAMPIONE Si preleva un frammento di dimensioni adeguate per: Congelamento Routine istopatologica Immunoistochimica Biochimica RNA Microscopia elettronica Colture cellulari Il campione per il congelamento viene congelato in isopentano raffreddato in azoto liquido e conservato in ultra-freezer a -80 C.

10 ROUTINE ISTOCHIMICA ed ISTOENZIMATICA Ematossilina ed eosina Tricromica di Gomori Enzimi ossidativi NADH-TR SDH COX ATPasi ph 4.3 ph 9.4 PAS ORO Fosfatasi acida Morfologia della fibra muscolare, elementi non contrattili del muscolo, nervi, vasi, tessuto connettivo, adiposo, nuclei, strutture anomale nelle fibre muscolari (p.es. corpi nemalinici) Colorano differenzialmente i diversi tipi di fibra e dimostrano alterazioni nella distribuzione dei mitocondri e delle miofibrille Colorano differenzialmente i diversi tipi di fibra e dimostrano alterazioni della innervazione Colora il glicogeno e gli altri polisaccaridi Colora i lipidi neutri Positiva in fibre necrotiche, o in membrane con trasporto attivo

11 MIOPATIE Le miopatie sono un gruppo di malattie geneticamente determinate che si caratterizzano clinicamente per una debolezza muscolare progressiva che coinvolge i muscoli dei cingoli scapolare e pelvico e spesso il muscolo cardiaco.

12 TRASMISSIONE LEGATA AL CROMOSOMA X

13 DISTROFINOPATIE Distrofia muscolare di Duchenne (DMD) Distrofia muscolare di Becker (BMD) Portatrice di DMD/BMD

14 DISTROFINOPATIE Sono dovute a mutazioni nel gene DMD che mappa sul braccio corto del cromosoma X in p21 e che codifica per una proteina chiamata distrofina

15 TRASMISSIONE DI UNA MALATTIA LEGATA AL CROMOSOMA X gene DMD mutato figlia portatrice (50%) figlio affetto (50%)

16 DISTROFINA Il piu grande gene umano ( bp) 10 volte piu grande di qualsiasi altro gene Espressione: muscolo scheletrico muscolo liscio muscolo cardiaco alcune popolazioni neuronali Prodotto proteico: DISTROFINA (427 kda) Componente del citoscheletro Funzioni: conferisce stabilita alla membrana muscolare durante lo sforzo stabilizza le altre glicoproteine associate alla membrana Quantita : 0.002% delle proteine muscolari 3% delle proteine di membrana

17 Distrofia muscolare di Duchenne Epidemiologia,tasso di mutazione Interessa tutte le popolazioni egulmente, elevato tasso di mutazione spontanea 1/ cellule uovo o spermatozoi hanno mutazioni del gene per la distrofina de novo 1/3.500 maschi nati vivi sono colpiti da DMD

18 Distrofia muscolare di Duchenne caratteristiche cliniche Periodo neonatale nella norma Ritardata l acquisizione delle tappe motorie Esordio della debolezza muscolare prossimale verso i 2-3 anni Debolezza e/o atrofia muscolare progressiva Perdita della deambulazione verso i anni Prognosi basata sulla funzionalita respiratoria e cardiaca

19 Misurazione manuale della forza muscolare M.R.C. (Medical Research Council) Normale Movimento possibile anche contro resistenza, non massimale Movimento possibile solo contro gravita ma non contro resistenza Movimento possibile solo con gravita eliminata Contrazione muscolare senza movimento Nessuna contrazione Si assegna un punteggio da 0 a 5 per ogni muscolo testato

20 Protocollo di valutazione GSGC (Gait, Stair, Gowers, Chair) 1) MARCIA (GAIT) 1. Normale 2. Lievemente ancheggiante, in iperlordosi e/o sulle punte dei piedi 3. Moderatamente ancheggiante, in iperlordosi e/o sulle punte dei piedi 4. Severamente ancheggiante, in iperlordosi e/o sulle punte dei piedi 5. Cammino possibile solo con assistenza (p.es. stampelle, tutori di posizione, etec.) 6. Mantiene la stazione eretta, ma incapace di camminare 7. Confinato in sedia a rotelle Tempo di percorrenza di 10 metri:...sec. 2) SALIRE le SCALE (STAIRS) 1. Sale senza appoggio 2. Sale con la spinta di una mano sulla coscia 3. Sale con la spinta di entrambe le mani sulle coscie 4. Sale in posizione eretta ma con l aiuto del corrimano 5. Sale con appoggio di entrambe le mani sul corrimano 6. Sale solo pochi gradini 7. Incapace di salire le scale Tempo per salire 4 gradini:..sec. 3) DA SEDUTO AD ERETTO (GOWERS) 1. Normale 2. Solleva il bacino per primo, una mano sul pavimento 3. Solleva il bacino per primo, due mani sul pavimento 4. Si appoggia con una mano sulla coscia 5. Si appoggia con due mani sulle coscie 6. Si solleva solo con l appoggio agli oggetti vicini (tavolo, sedia, etc.) 7. Incapace di alzarsi da terra Tempo per alzarsi da terra: sec. 4) ALZARSI DA UNA SEDIA (CHAIR) 1. Normale 2. Su base allargata e/o difficolta ma senza appoggio 3. Con appoggio di una mano sulla coscia 4. Con appoggio di entrambe le mani sulle coscie 5. Con appoggio sulla sedia o oggetti vicini 6. Incapace di alzarsi Tempo per alzarsi da una sedia:..sec.

21 Distrofia muscolare di Becker caratteristiche cliniche Esordio della debolezza muscolare prossimale tra i 5-15 anni nelle forme precoci, ma anche esordi tardivi nella terza o quarta decade ed oltre Debolezza e/o atrofia muscolare progressiva Perdita della deambulazione dopo i 15 anni Fenotipo clinico estremamente eterogeneo Prognosi basata sulla funzionalita respiratoria e cardiaca

22 Polimorfismo clinico nei pazienti con BMD IperCKemia, mialgie, crampi Mioglobinuria, intolleranza all esercizio Miopatia dei quadricipiti Miopatia ad esordio tardivo Cardiomiopatia dilatativa X-linked

23 Dati ecocardigrafici in pazienti BMD

24 Correlazioni fra LVEDV e LVEF ed eta dei pazienti BMD

25 CASO ISOLATO di DEFICIT di FORZA PROGRESSIVO

26 ALGORITMO DIAGNOSTICO Anamnesi ed esame neurologico Esami generali: CPK EMG: miopatico/neurogeno BIOPSIA MUSCOLARE (immunoistochimica, immunoblotting) Analisi del DNA

27 Nei muscoli dei vertebrati la fosfocreatina costituisce una riserva di gruppi fosfato che possono esere trasferiti all ATP. fosfocreatina+ ADP + H+ ATP + creatina Enzima che catalizza la reazione = creatina chinasi

28 Prelievo di sangue Anamnesi ed esame neurologico Biopsia muscolare DNA PROTEINE DIAGNOSI

29 Analisi proteica distrofinopatie * muscolo normale distrofina normale muscolo DMD distrofina assente muscolo BMD distrofina ridotta fibre revertite (30% dei casi) C C C P C C C distrofina 427 kda miosina

30 DISTROFIA DI DUCHENNE ricerca di mutazioni nel gene per la distrofina P1 P2 C C P1 P2 C P1 deleto esone 51 P2 deleto esoni compresi 52

31 Mutazioni del gene per la distrofina Tipo di mutazione Delezione di uno o piu esoni Duplicazione di uno o piu esoni Mutazioni puntiformi DMD 65% 6-10% 25-30% BMD 85% 6-10% 5-10% 2 hotspots: uno nel dominio rod (esoni 45-55) ed uno alla estremita 5 (esoni 2-19) Lo screening di 19 esoni identifica il 98% delle delezioni

32 GENE per la DISTROFINA DP427 muscolo, neuroni quadro di lettura senza-slittamento DP260 retina DP140 neuroni, rene DP116 cellule di Schwann DP71 45 universale con slittamento

33 Mutazioni frame-shift e in-frame gene DMD sintrofina distrofina nnos α-actinina actina distrobrevina Mutazioni frame-shift Mutazioni in-frame distrofina assente C P P C P C C * * * distrofina di ridotta aaaaaaquantita e/o aaaaapeso aaaaamolecolare Fenotipo severo DMD Fenotipo mite BMD

34 DISTROFIA MUSCOLARE di Miglioramento e mantenimento della forza muscolare e funzione muscolare Prevenzione e gestione delle deformita spinali Gestione delle complicanze respiratorie Prevenzione e trattamento della cardiomiopatia DUCHENNE

35 FOLLOW-UP CLINICO nelle DISTROFINOPATIE Valutazione neurologica EKG, ecocardiogramma e visita cardiologica Spirometria, emogas analisisi e visita pneumologica Visita fisiatrica e cicli di FKT Valutazione nutrizionale

36 TRATTAMENTO delle DISTROFINOPATIE Mantenere la deambulazione (ortesi, fisiatria, interventi chirurgici) Prevenire l insufficienza respiratoria (ventilazione non invasiva) Prevenire l insufficienza cardiaca (profilassi precoce con ACE inibitori) Trattamento farmacologico

37 Distrofia muscolare di Duchenne perdita della deambulazione Age at loss of ambulation Natural history DMD (n=85) Steroid treated DMD (n=41) 7 5 3

38 PORTATRICI di DISTROFIA MUSCOLARE di DUCHENNE Il 90% delle portatrici di DMD e asintomatico Circa il 10% delle portatrici di DMD presenta segni clinici di miopatia Poche fibre distrofino-negative Molte fibre distrofino-negative

39 INATTIVAZIONE DEL CROMOSOMA X RANDOM cromosoma X con il gene per la distrofina normale attivo in ~ 50% delle cellule dys- dys+ dys- dys- dys- dys+ dys+ dys+ dys+ dys- dys- dys+ dys+ dys- dys- dys+ INATTIVAZIONE DEL CROMOSOMA X SBILANCIATA Cromosoma X con il gene per la distrofina normale in ~ 100% delle cellule dys+ dys+ dys+ dys+ dys+ dys+ dys+ dys+ dys+ dys+ dys+ dys+ dys+ dys- dys- dys- dys- dys- dys ḏysdysdysdys- dys- dysdys- dys- dys- portatrice sintomatica Cromosoma X con il gene per la distrofina mutato in ~ 100% delle cellule

40 sospetto di distrofia muscolare biopsia muscolare IF distrofina assente mosaico ridotta normale DMD DMD carrier immunoblot distrofina ridotta normale BMD LGMD?

41 LGMD Coinvolgono prevalentemente i muscoli prossimali con risparmio dei muscoli faciali, extraoculari e faringei Ampia sovrapposizione tra i vari quadri clinici delle diverse LGMD eterogeneita clinica Mutazioni in numerosi geni causano LGMD eterogeneita genetica

42 Distrofie muscolari dei cingoli autosomiche dominanti (LGMD1) LGMD INHERITANCE LOCUS PROTEIN LGMD1A AD 5q myotilin LGMD1B AD 1q11 lamin A/C LGMD1C AD 3p caveolin LGMD1D AD 6q22 - LGMD1E AD 7q - LGMD1F AD 7q - LGMD1G AD 4p21 -

43 Distrofie muscolari dei cingoli autosomiche recessive (LGMD2) LGMD INHERITANCE LOCUS PROTEIN LGMD2A AR 15q calpain-3 LGMD2B AR 2p dysferlin LGMD2C AR 13q γ-sarcoglycan LGMD2D AR 17q α-sarcoglycan LGMD2E AR 4q β-sarcoglycan LGMD2F AR 5q δ-sarcoglycan LGMD2G AR 17q telethonin LGMD2H AR 9q TRIM32 LGMD2I AR 19q FKRP LGMD2J AR 2q31 titin LGMD2K AR 9q34 POMT1 LGMD2L AR 9q31 FKTN LGMD2M AR 1p34 POMGnT1 LGMD2N AR 14q24 POMT2

44 LGMD2D Chr. 17q12-21 LGMD2C Chr. 13q12 LGMD2E Chr. 4q12 LGMD2F Chr. 5q33-34 DMD/BMD Chr.Xp21 LGMD1C Chr.3p LGMD1B Chr.1q FKRP LGMD2B Chr.2p LGMD2A Chr.15q LGMD2I Chr 19q13.3

45 Calpainopatie (LGMD2A) Esordio clinico usualmente entro le prime decadi Coinvolgimento del cingolo scapolare all esordio (forma di Erb) o del cingolo pelvico con risparmio degli abduttori delle coscie; Ipotrofia muscolare e scapola alata frequenti; Contratture dei tendini di Achille all esordio; Insufficienza respiratoria

46 Disferlinopatie (LGMD2B) LGMD Esordio nell eta giovanile Lentamente progressiva Esordio nei muscoli prossimali del cingolo pelvico Risparmio dei muscoli della loggia anteriore della gamba e dei muscoli distali degli arti Miopatia distale (miopatia di Miyoshi) Esordio nella vita adulta Precoce coinvolgimento del gastrocnemio (impossibilita a camminare sulle punte dei piedi) Ipotrofia distale arti inferiori Frequente progressione ai muscoli prossimali ed al cingolo scapolare

47 Sarcoglicanopatie (LGMD2C-F) Esordio clinico variabile (dall infanzia alla vita adulta) Coinvolgimento del cingolo pelvico maggiore del cingolo scapolare; Ipertrofia dei polpacci comune; Variabile progressione: da molto severa (DMD-like) a molto mite; Coinvolgimento cardiaco (LGMD2E-2F) e respiratorio frequenti

48 LGMD2I Esordio clinico variabile (dall infanzia alla vita adulta) Coinvolgimento del cingolo pelvico e cingolo scapolare; Ipertrofia dei polpacci e della lingua comune; Variabile progressione nella LGMD2I: da molto severa (DMD-like) a molto mite; Cardiomiopatia dilatativa ed insufficienza respiratoria comuni nella LGMD2I

49 ISTOPATOLOGIA severa moderata mite Pattern distrofico o miopatico di variabile severita Il fenotipo clinico e la patologia muscolare sono aspecifiche CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE

50 Distrofie muscolari dei cingoli autosomiche dominanti (LGMD1) LGMD INHERITANCE CHROMOSOME PROTEIN LGMD1A AD 5q myotilin LGMD1B AD 1q11-21 lamin A/C LGMD1C AD 3p caveolin LGMD1D AD 6q22 - LGMD1E AD 7q - LGMD1F LGMD1G AD AD 7q 4p Distrofie muscolari dei cingoli autosomiche recessive (LGMD2) LGMD INHERITANCE CHROMOSOME PROTEIN LGMD2A AR 15q calpain-3 LGMD2B AR 2p dysferlin LGMD2C AR 13q γ-sarcoglycan LGMD2D AR 17q α-sarcoglycan LGMD2E AR 4q β-sarcoglycan LGMD2F AR 5q δ-sarcoglycan LGMD2G AR 17q telethonin LGMD2H AR 9q TRIM32 LGMD2I AR 19q FKRP LGMD2J AR 2q31 titin LGMD2K AR 9q34 POMT1 LGMD2L AR 9q31 fukutin

51 III-20 control 237 kda Dysferlin -> LGMD2B 94 kda Calpain -> LGMD2A 50 kda α-sarcoglycan -> LGMD2D myosin

52 α-sarcoglycan LGMD2D β-sarcoglycan LGMD2E γ-sarcoglycan LGMD2C telethonin LGMD2G

53 Laminin α2 α-dystroglycan Control III-20 LGMD2I/2K/2L

54 ALGORITMO DIAGNOSTICO Anamnesi ed esame neurologico Esami generali: CPK EMG: miopatico/neurogeno BIOPSIA MUSCOLARE (immunoistochimica, immunoblotting) Analisi del DNA

55 Un approccio pratico alle distrofie muscolari Storia ed esame obiettivo: Esami generali: CPK Distrofia muscolare Biopsia muscolare Distrofia/miopatia Miopatia infiammatoria Atrofia neurogena

56 BIOPSIA MUSCOLARE Analisi immunoistochimica ed immunoblotting delle proteine coinvolte nelle distrofie muscolari Analisi genetica

57 Coinvolgimento dei muscoli mimici DISTROFIA FACIO-SCAPOLO-OMERALE (FSH)

58 Distribution of predominant muscle weakness in different types of dystrophy DMD/BMD FSH LGMD Lancet 2002; 359:

59 FSHD Autosomica Dominante (10% nuove mutazioni, 45% mosaicismo germinale) Prevalenza 1: 20,000 Penetranza incompleta: 83% all eta di 30 anni (piu alta nei maschi (95%) che nelle femmine (69%) Non-penetranza: inferiore al 2% dopo i 50 anni

60 FSHD Esordio: M=16 anni F=20 in media, ma possibile dalla prima alla sesta decade Variabilita intra ed interfamiliare (nei casi familiari fino al 40% delle femmine ed al 20% dei maschi possono essere asintomatici)

61 FSHD Esordio: Debolezza muscolare a carico di: Muscoli facciali (anche asimmetricamente) Muscoli del cingolo scapolare Muscoli estensori dei piedi (piede cadente) Progressione della debolezza muscolare Muscoli addominali Muscoli estensori dei piedi Muscoli del cingolo scapolare (deltoide risparmiato) Muscoli del cingolo pelvico

62 FSHD Sintomi associati: Difetti di conduzione (p.es. blocco di branca) (5%) Scoliosi Contratture infrequenti, tranne che alla tibiotarsica Petto excavatus (5%) Perdita dei toni alti all audiogramma (75%) Vasculopatia retinica (teleangectasie e microaneurismi capillari) (60%) Sindrome di Coat rara (larghi essudati ed emorragie) (1%)

63 Vasculopatia retinica teleangectasie e microaneurismi capillari

64 FORMA INFANTILE Circa il 2-4% di tutti i casi di FSH. Esordio della debolezza facciale prima dei 5 anni (difficoltà a dormire con gli occhi completamente chiusi, difficoltà a sorridere) e della debolezza al cingolo scapolare prima dei 10 anni. Severa e diffusa debolezza che coinvolge anche il cingolo pelvico, raramente asimmetrica % dei casi perdono la deambulazione, di solito prima dei 15 anni Possibile ritardo mentale, epilessia, coinvolgimento cardiaco, sordità, vasculopatia retinica. Frammento D4Z4 di piccole dimensioni (genitori lievemente affetti o mosaici)

65 DISTROFIA FACIO-SCAPOLO-OMERALE (FSH) basi molecolari Linkage sulla regione subtelomerica del cromosoma 4 (4q35) Nella regione telomerica del cromosoma 4 e 10 è localizzata una sequenza polimorfica di DNA detta D4Z4, costituita da unità ripetute in tandem della dimensione ciascuna di 3.3 kb Il numero di repeats varia da 11 a 150 nei controlli, rendendo le dimensioni del frammento variabili da 35 a 300 kb (11 o piu D4Z4 repeats). Patologico: meno di 35 kb, meno di 11 D4Z4 repeats cen (D4Z4) n tel ( D4Z4 D4Z4 D4Z4 D4Z4 D4Z4 D4Z4 D4Z4 D4Z4 ) n cromosoma 4q35

66 DISTROFIA FACIO-SCAPOLO- OMERALE (FSH) (D4Z4) n = range normale oltre a 11 sequenze ripetute (frammenti superiori alle 50 Kb) MUTAZIONE: sequenze D4z4 inferiori a 11 (frammenti inferiori alle 38 Kb) ANTICIPAZIONE non su base genetica (frammento stabilmente trasmesso) Goto et al; Neuromusc Disord 2006; 16:

67 CORRELAZIONI GENOTIPO-FENOTIPO C è una correlazione tra l ampiezza del frammento D4Z4 e l età di esordio e di perdita di deambulazione. Solitamente, tanto più piccolo è il frammento, tanto peggiore è il fenotipo. da 1-3 repeats (<10 kb): forma severa da 4 a 7 repeats (10-23 kb): forma classica da 8 a 10 repeats (23-35 kb): forma lieve o asintomatica

68 MECCANISMI PATOGENETICI Compromissione della struttura del gene FSH localizzato nelle sequenze D4Z4 (zona ricca di CG -> homodomain gene DUX) Controllo trascrizionale di geni vicini alle sequenze D4Z4 (effetto posizionale) (FRG1, ANT1, PDLIM3) Delezione di un silenziatore trascrizionale localizzato in D4Z4 che comporta la sovraespressione nel muscolo di pazienti affetti da FSH di geni localizzati centromericamente alle sequenze D4Z4 in 4q35 (un interruttore genetico che non funziona lascia acceso un gene che normalmente dovrebbe restare spento).

69 MIOTONIE

70 MIOTONIA: ALTERATO RILASCIAMENTO MUSCOLARE DOPO CONTRAZIONE MUSCOLARE PROTRATTA

71 Electromyography Myotonia A WT Mutant B 1 mv 0.5 s Courtesy of Lawrence J. Hayward 1 mv 0.1 s

72 Myotonic Signs Eyelid myotonia after squinting Lid lag myotonia after sustained upgaze Percussion myotonia

73 Classificazione delle miotonie Miotonina protein kinasi (DM1) Distrofia miotonica tipo 1 (AD) Zinc finger protein 9 (DM2) Distrofia miotonica tipo 2 (DM2) (AD) Canale del cloro Miotonia congenita di Thomsen (AD) Miotonia congenita di Becker (AR) Canale del sodio Paramiotonia congenita Miotonia aggravata dal potassio

74 MIOTONIA Distrofia miotonica (DM1) Distrofia miotonica (DM2) Miotonia Congenita Miotonia di Becker Miotonia aggravata dal Potassio Paramiotonia Congenita DMPK ZNF9 Canale del Cl - (CLCN1) Canale del Cl - (CLCN1) Canale del Na + (SCN4A) Canale del Na + (SCN4A)

75 EPIDEMIOLOGIA delle DM DM1 Incidenza: 13 : 100,000 Prevalenza: 2-5 / 100,000

76 DISTROFIA MIOTONICA tipo 1 o Distrofia miotonica di Steinert Pleiotropismo coinivolgimento di piu organi

77 DISTROFIA MIOTONICA (DM1) Miotonia (alterato rilasciamento muscolare) Debolezza muscolare e atrofia Muscoli mimici, temporali, muscoli distali dell avambraccio, muscoli dorsiflessori del piede Cataratta Calvizie precoci Cardiomiopatia (difetti di conduzione, iniziali; cardiomiopatia dilatativa tardiva) Atrofia gonadica, altri disturbi endocrinologici Deficit cognitivo fino alla demenza

78 DISTROFIA MIOTONICA di TIPO 1 Christmas tree cataract

79 PROFILO NEUROCOGNITIVO La popolazione DM1 è estremamente eterogenea. Nel complesso non si evidenzia un significativo deficit cognitivo, con QI medio ancora nella norma. I singoli test documentano: deficit di funzione frontale; deficit di abilità visuo-spaziali.

80 DISTROFIA MIOTONICA CONGENITA Trasmissione per via materna (la madre ha spesso un fenotipo mite o subclinico -> anticipazione) Assenza di miotonia nelle forme congenite (puo comparire dopo i 2-3 anni) Caratteristiche cliniche pre-, post-natali Idrope fetale Ipotonia Distress respiratorio Debolezza muscoli facciali Difficolta nella deglutizione Piede torto e/o contratture multiple Caratteristiche cliniche durante l infanzia Dismorfia facciale Ritardo tappe psico-motorie Ritardo nell acquisizione del linguaggio Ritardo mentale

81 DISTROFIA MIOTONICA: 19q13.3 Gene responsabile: DMPK Proteina: DMPK (serin-treonin kinasi) (autosomica dominante) ATG TAG (CTG) n 5 UTR 3 UTR 14 kb gene; 2.3 kb mrna

82 DISTROFIA MIOTONICA (DM1) (CTG) n = range normale 3-37; Eterozigosita : 0.75% MUTAZIONE > 50 (CTG)n instabilita meiotica e mitotica normale DM1 ANTICIPAZIONE Classe E1 = (CTG) n Classe E2 = 200-1,000 (CTG) n mosaico somatico Classe E3 = > 1,000 (CTG) n * ** * * * * * * Bonifazi, E. et al. Clin Chem 2006;52: ,300(CTG) n 80 (CTG) n Diagn Mol Pathol : Am J Med Genet 1996; 65:

83 DISTROFIA MIOTONICA di TIPO 1 (DM1) Fenomeno dell anticipazione

84 DM1: IPOTESI PATOGENETICHE Effetto dominante negativo dell RNA: i trascritti che contengono la sequenza ripetuta CUG si accumulano come inclusioni ribonucleiche nel nucleo (foci di RNA) Alterazione dell attivita di numerose proteine che legano l RNA (RNA binding protein) Splicing alternativo e funzione anomala di numerosi geni target L effetto tossico è proporzionale all entità dell espansione: più mrna-cug più tossicità

85 Iter diagnostico EMG: miopatia e miotonia ECG: difetti di conduzione Biopsia muscolare: ipotrofia di fibre di tipo I con nuclei centrali e masse sarcoplasmatiche o aggregati tubulari Genetica: malattia autosomica dominante con variabilita clinica

86 ISTOPATOLOGIA DM1 H&E: Nuclei centrali e polidimensionalismo fibrale. SDH: Ipotrofia delle fibre di tipo I (scure).

87 ISTOPATOLOGIA DM1 H&E H&E Polidimensionalismo fibrale Nuclei centrali Fissurazioni citoplasmatiche Aggregati tubulari NADH

88 DISTROFIA MIOTONICA tipo 2 o PROMM Pleiotropismo coinivolgimento di piu organi

89 DISTROFIA MIOTONICA di TIPO 2 DM2 mappa su 3q21; causata da una espansione di una (CCTG)n nel primo introne della proteina zinc finger 9 (ZNF9)

90 DISTROFIA MIOTONICA (DM2) Miotonia (alterato rilasciamento muscolare) Debolezza muscolare prossimo>distale e ipertrofia dei polpacci Ipotrofia associata a miotonia Cataratta Cardiomiopatia (difetti di conduzione, aritmie; cardiomiopatia dilatativa) Atrofia gonadica, altri disturbi endocrinologici Ridotta tendenza all anticipazione Elevata eterogeneita somatica ATG TAG (CCTG) n 5 UTR 3 UTR 11.3 kb gene; 1.5 kb mrna Gene ZNF9; cromosoma 3q21.3

91 DISTROFIA MIOTONICA (DM2) (TG) n (TGTG) n (CCTG) n = range normale fino a 26 MUTAZIONE (CCTG)n : da 75 a 11,000 (CCTG)n (in media circa 5,000) instabilita somatica e intergenerazionale Eterogeneita somatica Eterogeneita in gemelli Eterogeneita nel tempo DM2 controllo DM1 C. L. Liquori et al., Science 293, (2001) C. L. Liquori et al., Science 293, (2001)

92 ISTOPATOLOGIA DM2 H&E: Polidimensionalismo fibrale e rari nuclei centrali ATPasi 9.4: Atrofia prevalente delle fibre di tipo II SDH: Agglomerati di nuclei picnotici

93 DM1 DM2 Distribuzione ipostenia facciale, extraoculare ++ + distale agli arti ++ + prossimale agli arti + ++ atrofia muscolare ++ + Dolore muscolare - + sistema nervoso centrale ritardo mentale + - ipersonnia ++ - atrofia cerebrale + - lesioni della sostanza bianca +? malattie congenite + - anticipazione genetica ++ -

94 MIOTONIA CONGENITA

95 MIOTONIA Distrofia miotonica (DM1) Distrofia miotonica (DM2) Miotonia Congenita Miotonia di Becker Miotonia aggravata dal Potassio Paramiotonia Congenita DMPK ZNF9 Canale del Cl - (CLCN1) Canale del Cl - (CLCN1) Canale del Na + (SCN4A) Canale del Na + (SCN4A)

96 Canale del cloro muscolo scheletrico voltaggio-dipendente CLCN1

97 Canale del cloro (CLCN1) Ridotta conduttanza al cloro nelle cellule muscolari ipereccitabilita della membrana (alterata ripolarizzazione) Il canale del cloro e un omodimero. Ciascuna subunita forma un poro. Le mutazioni recessive agiscono con un meccanismo di loss of function, mentre le mutazioni dominanti agiscono con effetto dominant-negative

98 MIOTONIE CONGENITE Caratterizzate da senso di rigidita muscolare prevalente a carico degli arti inferiori Miotonia piu evidente quando il movimento massimale avviene dopo il riposo Fenomeno del warming-up (rigidita muscolare che migliora dopo un esercizio ripetuto) Ipertrofia muscolare Nelle forme recessive (miotonia di Becker) l esordio e piu tardivo, la miotonia e piu grave e si possono associare a miopatia tardiva

99 Clinical Diagnosis of The Skeletal Muscle Chloride Ion Channelopathies Thomsen s Disease Becker s Myotonia Inheritance autosomal dominant (AD) autosomal recessive (AR) Genetic defect loss-of-function and dominant-negative mutations in the skeletal muscle voltage-gated chloride channel gene (CLCN1 Chr 7q35) Age of onset infancy to early childhood late childhood to early teens Areas affected legs and hands most muscles including facial muscles Muscle hypertrophy legs and trunk legs Lid lag yes yes Grip myotonia yes yes Percussion myotonia yes yes EMG myotonia yes yes Muscle weakness no yes Severity minimal to mildly affected moderate to severely affected Provocative stimuli prolonged rest, initiation of movement, or maintenance of the same posture Warm-up phenomenon yes yes Therapy mexiletine, quinine, procainamide, phenytoin

100 Canale del sodio voltaggiodipendente muscolo scheletrico SCN4A

101 Membrane Topology of Voltage-Gated Sodium Channels The sodium channel Nav1.4 is made up of a principal pore forming and voltage sensitive subunit (α subunit) associated with an accessory β1 subunit. Mutations in sodium channel diseases are in the α subunit of Nav 1.4 encoded by the gene SCN4A located on chromosome 17q23-25 P-loop Inactivation gate Frances M. Ashcroft. Ion Channels and Disease. Academic Press. 2000: 70

102 Gating Properties of Voltage-Sensitive Sodium Channel Louis Ptacek. Am J Med 104:62, 1998 SCN4A mutations cause a disruption of fast inactivation (gain of function mutations) Channel re-openings and Na+ accumulation Depolarization of muscle cells and generation of repetitive action potentials Mild depolarization long lasting hyperexcitability MYOTONIA Strong depolarization general opening of the the Na+ channel PARALYSIS

103 Paramiotonia Congenita Von Eulenburg A (1886) Über eine familiare, durch 6 generationen verfolgbare form congenitaler paramyotonie. Neurologisches Centralblatt 12: Autosomica dominante con elevata penetranza Esordio infantile Miotonia paradossa Stifness muscolare indotta dal freddo seguita da debolezza muscolare/paralisi

104 Clinical Diagnosis of The Skeletal Muscle Sodium Ion Channelopathies Paramyotonia Congenita (PC, PMC) Potassium-Aggravated Myotonia (PAM) Inheritance autosomal dominant (AD) autosomal dominant (AD) Genetic defect missense mutations in the skeletal muscle voltage-gated sodium channel a-subunit gene (SCN4A Chr 17q23-25) Age of onset infancy to early childhood early childhood to second decade Areas affected facial, pharyngeal, distal facial muscles, limbs upper extremity muscles Attack duration variable variable Paralysis severity usually mild never Myotonia severity mild to moderate mild to severe Myopathy very rare rare Provocative stimuli cold, exercise, oral potassium oral potassium oral potassium, rest after exercise Therapy acetazolamide, mexiletine, acetazolamide, mexiletine tocainide, hydrochlorothiazide Animal model N/A N/A Note myotonia fluctuans myotonia permanens acetazolamide-responsive myotonia painful myotonia