Università degli Studi di Torino Corso di Laurea in Biotecnologie Molecolari Interleukin 1 (IL-1) di Vincenzo Dipierro Corso di Immunologia Molecolare Prof. Forni e Prof.ssa Cavallo
Cos'è IL-1? E' la prima citochina individuata come mediatore dell'immunità innata [9] Gene ancestrale (350miloni di anni) Citochina prodotta principalmente da fagociti mononucleati attivati, ma anche da un alto numero di tipi cellulari quali neutrofili, cellule epiteliali (cheratinociti), cellule endoteliali Famiglia di piccole proteine composta di dieci elementi con differenti funzionalità [4 to 9]: IL-1α (2q12-q21) IL-1RI (2q12) IL-1Rap (3q28) IL-1β (2q13-q21) IL-1RII (2q12) IL-1Ra (2q14.2) Induzione: agenti microbici (LPS dei gram -, esotossine dei gram + ) e agenti virali
Fattori non microbici stimolanti IL-1 Figura 1: Dinarello C A. Biologic basis for interleukin-1 in disease. Blood. 1996.
IL-1: funzioni generali Attiva: - sintesi di IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF ed altre citochine - linfociti T helper per la sintesi di IL-2 (processo autocrino) - espressione di molecole di adesione (CAM) nell'endotelio - sintesi di PGE 2 dall' acido arachidonico (monociti, midollare renale, timo) - sintesi di tpa attivatore tissutale del plasminogeno Inattiva: - proliferazione dei fibroblasti in vivo ed in vitro - proliferazione di epatociti in vitro - processi coagulanti
Struttura IL-1 Figura 2: The β trefoil. Alberts. Biologia Molecolare della Cellula. Zanichelli III edizione.
IL-1α Propeptide (31kDa): - sintetisi in associazione ai microtubuli - clivaggio da parte di calpaina (proteinasi Ca ++ -dipendente adesa alla membrana) - accumulo intracitoplasmatico e clivaggio dopo morte cellulare - si comporta come un fattore di crescita autocrino (azione antiossidante nei cheratinociti)[4-6 to 8] Propiece (115 aa) localizza in posizione nucleare e coordina le funzioni differenziative [8] Peptide (17kDa): - agonista IL-1β con proprietà pro-infiammatorie - funzionalità nell'immunità, nei meccanismi riparativi e differenziativi - livelli non rilevanti in circolo e nei fluidi corporei se non in condizioni patologiche severe
IL-1β Regolazione nella sintesi - LPS stabilizza 3' AU-rich region anche a basse quantità - IL-1 protegge poly A dalla deadenilazione [8] Propeptide (33kDa): non ha attività biologica Clivaggio da parte di ICE (caspasi1) solo di ProIL-1β [6-8-16] - sito Cys attivo sulla catena maggiore (20 kda) - taglio tra acido aspartico (116) e alanina (117) - taglio da parte di enzimi presenti nei fluidi infiammatori (tripsina, granzima A (120), elastasi (112), chimotripsina) Propiece: attività chemotattica per i fibroblasti [6-8]
ICE (Caspasi 1) Figura 3: Interleukin-1 Converting Enzyme. www.biochem.szote.u-szeged.hu
IL-1β IL-1β matura (17kDa): - rilasciata nel citosol tramite un complesso canale formato da Pannexin1 e P2X 7 [16] - prevalenza in circolo a 15min dallo stimolo di attivazione In generale Basse quantità di IL-1β - mediazione locale dell'infiammazione - induzione di molecole di adesione per la migrazione dei leucociti e altri tipi cellulari [3 to 8] Alte quantità di IL-1β - ha azione endocrina sull' ipotalamo negli stati febbrili - induce l'attivazione di cellule per l'immunità - genera cachessia
IL-1RI Glicoproteina (80kDa)[4-6 to 8] - espressa in endotelio, muscolo liscio, epatociti, fibroblasti, cellule dendritiche, T linfociti - appartiene alla famiglia degli Ig-like receptors e ha alta omologia con i recettori Toll (porzione citoplasmatica: 45% di omologia) - alto grado di glicosilazione Attività: - Site A: sito di legame per IL-1α, IL-1β, IL-1Ra presente sulla giunzione tra i domini I e II Ig-like Figura 4: IL-1 Receptor. Alberts. Biologia Molecolare della Cellula. Zanichelli III edizione - Site B: sito di legame per IL-1α e IL-1β presente su dominio III Ig-like - i due siti sono connessi da un dominio flessibile (aa 199 208) IL-1Rap: dimerizza con IL-1R1grazie al sito di legame presente sul dominio III Ig-like; tale sito è reso accessibile grazie alla deformazione [6-8-16] prodotta dal legame con IL-1α e IL-1β ma non con IL-1Ra. La dimerizzazione IL-R1/IL-1Rap attiva la cascata di trasduzione del segnale [16-17]
Siti di legame a IL-1R per IL-1α, IL-1β, IL-1Ra Figura5: Ron J. Evans, et Al. Mapping receptor binding sytes in IL-1 receptor antagunist and IL-1β by site-directed mutagenesis. J.of Biol Chem 1995.
IL-1Ra ProIL-1Ra: (dopo lo stimolo LPS batterico, nei monociti) - sil-1ra: a 4-6h dallo stimolo localizzata nel Golgi e secreta dopo maturazione; azione antagonista di IL-1 - icil-1ra: a 24h dallo stimolo è il trascritto primario; nei cheratinociti impedisce il legame di IL-1α al DNA Il legame di IL-1Ra a IL-1RI non ha effetto sull'attivazione della trasduzione del segnale perchè è coinvolto solo il Site A [16-17] Tale legame blocca l'accesso al Site B e la trasduzione del segnale Figura 6: Ron J. Evans, et Al. Mapping receptor binding sytes in IL-1 receptor antagunist and IL-1β by site-directed mutagenesis. J.of Biol Chem 1995.
Differenze nel legame IL-1RI / IL-1β e IL-1RI / IL-1Ra IL-1β IL-1Ra IL-1RI Figura 7: Vigers G, et Al. X-ray Crystal Structure of a Small Antagonist Peptide Bound to Interleukin-1 Receptor Type 1.J.of Biol Chem 2000.
IL-1RII Recettore solubile di 29aa: - presente in circolo e nelle urine di soggetti sani ma anche nel sangue di soggetti con sepsi, o nel liquido sinoviale di pazienti affetti da artrite reumatoide [4-6 to 8] Sintesi: - taglio enzimatico della porzione citoplasmatica C-terminale e di quella trans-membrana - rilascio nel citosol della porzione extracellulare - affinità [6]: IL-1β > IL-1α > IL-1Ra Attività: - agisce come recettore decoy ovvero privo di attività biologica - impedisce il legame IL-1/IL-1RI - se fuso alla porzione citoplasmatica di IL-1RI acquista attività biologica dopo il legame a IL-1 [12] Figura 8: Heguy A, et Al. A chimeric type II/type I interleukin-1 receptor can mediate interleukin-1 induction of gene expression in T cells. J Biol Chem. 1993.
Azione di IL-1 Figura 9: IL-1 signal transduction pathway www.biocarta.com
IL-1 nell' Artite Reumatoide Disordine infiammatorio sistemico cronico indotto da Ag microbico artritogeno Le ossa sono il bersaglio principale: sinovite proliferativa con graduale distruzione della cartilagine articolare e anchilosi Ruolo centrale di IL-1 nell'induzione e nel mantenimento dello stato infiammatorio autoimmune Figura 10: IL-1 pro-inflammatory role in RA. www.hopkins-arthritis.som.jhmi.edu Morfologia: - aumentata vascolarizzazione con abbondante infiltrato flogistico - accunulo di granulociti neutrofili - erosioni iuxta-articolari ad opera degli osteoclasti, con osteoporosi e riassorbimento osseo - formazione del panno: massa fibro-cellulare di sinovia con accumuli di cellule infiammatorie e ammassi di fibrina
Possibili cure per RA Anakinra: - rhuil-1ra è un forma ricombinante non glicosilata di IL-1Ra: aggiunta di una metionina N-terminale [13] - esperimenti in dopio cieco hanno dato un significativo livello di efficacia (20ACR-response American College of Reumathology) - nonostante tutto la sola azione di Anakinra sembra insoddisfacente [1] (iniezione giornaliera, corta emivita, pochi benefici riscontrabili) sil-1ri sil-1rii: - somministrazione della forma solubile di IL-1RI dimostra scarsi effetti solo ad alte dosi di farmaco [10]; basse dosi inducono aumento nei sintomi - somministrazione di sil-1rii mostra effetti significativi [2] nel coniglio per la regressione del danno alle giunzioni Gene therapy: - introduzione del cdna codificante per IL-1Ra in MPC (cellule metacarpo-falangee) e successivamente in pazienti [11] - buon livello di espressione del gene - risultati apprezzabili nella regressione dell'artrite
LPS ed infezione cerebrale nel ratto: inibizione dei meccanismi pro-infiammatori di IL-1 Infezioni cerebrali causate da LPS [14]: - LPS attiva le cellule della microglia (sintesi di NO e IL-1) - attivazione dei fattori di trascrizione NFkB e AP1 - cambiamenti morfologici dell'infiammo - LPS induce l'espressione di ANP e ANP-R Somministrazione del Peptide Natriuretico Atriale: - dopo 4 6h dalla somministrazione calano i livelli di espressione di NFkB ed AP-1 Figura 11: Moriyama N, et Al. ANP inhibits LPS-induced stimulation of rat microglial cells by suppressing NF-kappaB and AP-1 activations. Biochem Biophys Res Commun. 2006
References 1 Burger D, et Al. Is IL-1 a good therapeutic target in the treatment of arthritis? Best Pract Res Clin Rheumatol. 2006; 20:879-896. 2 Dawson J, et Al. Effects of soluble interleukin-1 type II receptor on rabbit antigen-induced arthritis: clinical, biochemical, and histological assessment. Rheumatology 1999 38:401-406, 3 Dinarello C A. Interleukin 1 and interleukin 18 as mediators of inflammation and the aging process. Am J Clin Nutr. 2006; 83:447-455. 4 Dinarello C A. The IL-1 family and inflammatory diseases. Clin Exp Rheumatol. 2002; 20:S1-13. 5 Dinarello C A. Pro-inflamatory Cytokines. Chest 2000; 118;503-508. 6 Dinarello C A. Interleukin-1, interleukin-1 receptors and interleukin-1 receptor antagonist. Int Rev Immunol. 1998; 16:457-99. 7 Dinarello C A. Interleukin-1. Cytokine Growth Factor Rev. 1997; 8(4):253-265. 8 Dinarello C A. Biologic basis for interleukin-1 in disease. Blood. 1996; 87:2095-2147. 9 Dinarello C A. The interleukin-1 family: 10 years of discovery. FASEB J. 1994; 8:1314-1325.
10 Drevlow B, et al. Recombinant human interleukin-1 receptor type I in the treatment of patients with active RA. Arthritis Rheum 1996; 39:257-265. 11 Evans CH, et al. Gene transfer to human joints: progress toward a gene therapy of arthritis. Proc Natl Acad Sci. 2005; 102:8698-8703. 12 Heguy A, et Al. A chimeric type II/type I interleukin-1 receptor can mediate interleukin-1 induction of gene expression in T cells. J Biol Chem. 1993; 268:10490-4. 13 Jiang Y, et Al. Double Blind, Dose-Ranging, Randomized, Placebo-Controlled Study of Recombinant Human Interleukin-1Receptor Antagonist In Patients with Rheumatoid Arthritis. Arthritis Rheum. 2000; 43:1001-1009. 14 Moriyama N, et Al. ANP inhibits LPS-induced stimulation of rat microglial cells by suppressing NF-kappaB and AP-1 activations. Biochem Biophys Res Commun. 2006; 350:322-8. 15 Pelegrin P, Surprenant A. Pannexin-1 mediates large pore formation and interleukin-1 beta release by the ATP-gated P2X(7)receptor. EMBO J. 2006. 16 Ron J. Evans, et Al. Mapping receptor binding sytes in IL-1 receptor antagunist and IL-1β by site-directed mutagenesis. J.of Biol Chem 1995; 270 11477-11483. 17 Vigers G, et Al. X-ray Crystal Structure of a Small Antagonist Peptide Bound to Interleukin-1 Receptor Type 1. J.of Biol Chem 2000; 275:36927 36933. Books: - Abbas, Lichtman, Pober. Immunologia cellulare e molecolare. Piccin. IV edizione - Paoletti, Nicosia, Clementi, Fumagalli. Farmacologia generale e molecolare. Utet III edizione - Robbins. Le basi delle malattie. Piccin VI edizione - Alberts, Bray, Lewis, Raff, Roberts, Watson. Biologia Molecolare della Cellula. Zanichelli III edizione