LA NATURA DELLE MUTAZIONI

LA NATURA DELLE MUTAZIONI La Bibbia (Genesi) indicava che la creazione era avvenuta in 6 giorni, circa 6000 anni prima. Presa alla lettera, questa nozione aveva generato la teoria del Fissismo, contrapposto all Evoluzionismo, che proponeva un evento creativo indipendente per ogni specie. Jean Baptiste Lamarck, nel 1809, nella Philosophie zoologique, introduce il concetto di evoluzione della specie. Per Lamarck, fattori dell evoluzione sono: 1. tendenza al perfezionamento, insita e innata; 2. ereditarietà dei caratteri acquisiti. Charles Darwin, nel 1859, pubblica Origin of Species. Per Darwin, fattori dell evoluzione sono: 1. mutazione, casuale (errori della DNA polimerasi, agenti mutageni); 2. selezione naturale; 3. deriva «survival of the fittest» (Huxley). CONCETTI BASE DI STATISTICA Il valore medio Nel caso di una variabile casuale discreta X (ad esempio, la statura), i cui valori possibili sono x 1, x 2,, x n (la statura dei singoli soggetti), il valore medio (μ) di X è definito, quando le probabilità sono tutte uguali, da: μ = (x 1 + x 2 + + x n) / n che viene definito la media aritmetica di X La varianza La varianza è una misura della dispersione dei valori della variabile casuale attorno alla media μ: valori concentrati vicino alla media varianza piccola valori dispersi lontano dalla media varianza grande Nel caso in cui tutte le probabilità siano uguali: La deviazione standard Var(X) = σ 2 = [(x 1 μ) 2 + (x 2 μ) 2 + + (x n μ) 2 ] / n La deviazione standard è la radice quadrata della varianza: σ = Var(X ) Esempio di due distribuzioni aventi la stessa media e diversa varianza (curva gaussiana) 108

In una distribuzione normale: il 68,27% dei dati rientra nella zona μ + σ il 95,45% dei dati rientra nella zona μ + 2σ il 99,73% dei dati rientra nella zona μ + 3σ Il rapporto σ / μ è una misura della fluttuazione attorno alla media. Natura della mutazione genetica: teoria adattativa vs. teoria selettiva Osservazione: seminando 10 8 batteri su piastre contenenti 10 10 batteriofagi T1, si trovano circa 10 colonie batteriche per piastra, che ovviamente derivano da batteri resistenti all infezione (Ton R ). Questa osservazione trova due possibili spiegazioni: 1. teoria adattativa o induttiva (lamarckiana): probabilità di uno su dieci milioni che la mutazione venga indotta dal contatto con l agente antibatterico; 2. teoria preadattativa o selettiva (darwiniana): preesistenza nella popolazione, prima del contatto con l agente antibatterico, di rari mutanti resistenti. Si prevede che le due ipotesi diano risultati diversi per quanto riguarda la distribuzione numerica dei fenotipi Ton R nelle colture batteriche: Ipotesi adattativa a = n / N a: probabilità di conversione da Ton S a Ton R n: numero di batteri Ton R osservati N: numero di batteri piastrati n deve essere una frazione costante di N Ipotesi preadattativa n / N = g * a * 2 g / 2 g = g * a a: tasso di mutazione da Ton S a Ton R g: numero di generazioni trascorse per passare da 1 a N batteri N: 2 g raddoppi, di cui n: g * a * 2 g producono batteri mutanti Ton R n deve aumentare con l aumentare di g Esperimento di Luria (test di fluttuazione) L esperimento prevede di far crescere O/N cellule batteriche in una coltura di grandi dimensioni ed in numerose subcolture molto piccole, inoculando i batteri ad una concentrazione di 5x10 3 cellule/ml. Il giorno dopo, un aliquota di tutte le colture viene esposta al batteriofago T1 e si valuta la presenza di colonie resistenti al fago. Crescita overnight (O/N) a 37 C fino a 5 x 10 8 batteri/ml 109

Piastre provenienti dalle 10 colture indipendenti Mutanti Ton R : totale 210; frequenza 2,1 x 10-7 ; μ = 21; σ = 43,9 Piastre provenienti dalle 10 repliche della singola coltura Mutanti Ton R : totale 212; frequenza 2,1 x 10-7 ; μ = 21,2; σ = 6,2 La fluttuazione può essere calcolata come F = σ / μ dove σ è la deviazione standard e μ è la media Colture indipendenti F = 2,09 Repliche F = 0,29 Secondo la teoria adattativa, F dovrebbe essere uguale in entrambi i casi, dal momento che il numero di mutanti dipende solo dall esposizione all agente selettivo. Poiché il fago T1 viene aggiunto a tutte le colture nello stesso momento, ci si aspetta F ind = F repliche e F mutanti = T mutazione. Secondo la teoria preadattativa o selettiva, F dovrebbe essere maggiore nelle colture indipendenti, dal momento che il numero di mutanti che si ottengono dipende dal momento in cui la mutazione è comparsa e dal fatto che le dimensioni dei cloni resistenti saranno tanto maggiori quanto più tempo è passato dalla comparsa della mutazione. Questo può verificarsi in maniera diversa per ciascuna subcoltura. Ci si aspetta quindi che F ind >> F repliche e F mutanti >> T mutazione. 110

L equazione di Poisson permette di risalire al tasso di mutazione (a) conoscendo il numero di colture che non hanno mutanti. P 0 = e -an P 0: numero di piastre senza mutanti diviso per il totale delle piastre N: numero di batteri seminati in ciascuna piastra Luria e Delbruck (1943), secondo la distribuzione di Poisson, ricavano che: a = (-lnp 0) / N a = -ln0,4 / 10 8 = 0,916 / 10 8 = 9,16 x 10-9 Quindi, il tasso di mutazione è 9,16 x 10-9 Secondo la teoria adattativa, la frequenza di mutanti osservati (F), dovrebbe essere pari alla Tm. Invece: F = 2,1 x 10-7 >> 9, 16 x 10-9 Da ogni mutazione, quindi, sono derivati in media 23 mutanti. Pertanto, gli esperimenti di Luria e Delbruck dimostrano che la mutazione è preadattativa. MUTAZIONE DI UN GENE Non tutte le mutazioni causano un alterazione delle proteine e non tutte le mutazioni avvengono nella regione codificante del gene. Rappresentazione di una popolazione in divisione di E. coli selvatico, sensibile al fago T1: alla quarta generazione viene aggiunto il fago T1: a. se la teoria dell adattamento fosse corretta, le cellule muterebbero solo con l aggiunta del fago T1, quindi la frazione di cellule resistenti nelle colture duplicate sarebbe la stessa; b. se fosse corretta la teoria della mutazione casuale, le cellule muterebbero indipendentemente dalla presenza del fago T1 e quindi la frazioni di cellule resistenti sarebbe diversa nelle colture duplicate. A sinistra: se una cellula muta diventando resistente al fago T1 nella terza generazione, 2 cellule su 16 della quarta generazione saranno resistenti al fago. A destra: se una cellula diventa resistente al fago T1 nella prima generazione, 8 cellule su 16 della quarta generazione saranno resistenti a T1. 111

Tipi di mutazione per sostituzione di una coppia di basi La trascrizione del segmento mostrato produce un mrna con sequenza 5 UCUCAAAAAUUUACG 3 che codifica per - Ser Gln Lys Phe Thr - 112

Mutazione nonsenso e sue conseguenze sulla traduzione Meccanismo di azione di un soppressore intergenico di mutazione nonsenso, dovuto a mutazione in un gene per un trna. In questo esempio, un gene per un Tyr.tRNA, mutato in modo che l anticodone del trna è cambiato da 59-GUA-39 a 59-CUA-39, può leggere un codone nonsenso UAG, inserendo tirosina nella posizione corrispondente del polipeptide. 113

Appaiamenti corretti e non corretti delle basi del DNA Appaiamento normale secondo Watson e Crick Appaiamento vacillante pirimidina-purina: appaiamenti non corretti tra T e G e C e A Appaiamento vacillante purina-purina (A e G) e pirimidina-pirimidina (T e G) Produzione di una mutazione causata da un appaiamento errato 114

Origine spontanea di mutazioni per inserzione o delezione in seguito a ripiegamento del DNA durante la replicazione Deaminazione della citosina ad uracile Deaminazione della 5-metil-citosina (5 m C) a timina 115

Effetti mutageni dell analogo delle basi 5-bromouracile (5BU) a. Nel suo stato normale, il 5BU si appaia con l adenina. b. Nel suo stato raro, il 5BU (indicato da 5BU evidenziato) si appaia con la guanina. c. I due possibili meccanismi di mutazione. Il 5BU induce mutazioni per transizione quando viene incorporato nel DNA in uno stato e poi passa alla forma alternativa durante il successivo ciclo di replicazione del DNA. 116

Azione di tre agenti modificatori di base a. L acido nitroso (HNO 2) modifica: 1. la guanina nessuna mutazione; 2. la citosina mutazione; 3. l adenina mutazione. b. L idrossilamina (NH 2OH) reagisce solo con la citosina. c. Il metilmetansolfuro (MMS), un agente alchilante, alchila la guanina. 117

Mutazioni per intercalazione Mutazione frameshit per inserzione, causata dall inserimento dell agente intercalante nell elica stampo. Mutazione frameshit per delezione, causata dall inserimento dell agente intercalante nell elica di neosintesi. Test di Ames per verificare la potenziale mutagenicità di composti chimici 118

Riparazione per excisione dei nucleotidi (NER) dei dimeri di pirimidine e altri danni che causano distorsioni nel DNA 119

TUMORI Cause che possono trasformare una cellula normale in una cellula tumorale: La scoperta degli oncogèni 120

Mutazioni in cellule tumorali Due categorie: 1. oncogèni, tipicamente dominanti; 2. geni onco-soppressori mutati, tipicamente recessivi. Associate talvolta ad anomalie cromosomiche, ad es. traslocazioni, che pongono un gene sotto il controllo di un promotore forte di un altro gene. Cellule che perdono la capacità di andare incontro ad apoptosi hanno tempo di accumulare mutazioni che promuovono la crescita tumorale incontrollata. Oncogeni Proto-oncogeni generalmente codificano proteine che regolano la proliferazione normale delle cellule o l apoptosi. Di norma codificano regolatori positivi o negativi. Accumulano mutazioni e diventano oncogeni: mutazioni puntiformi alterano struttura/funzione; perdita di domini in seguito a delezioni; fusione di geni, spesso dovute a traslocazioni; a volte la mutazione determina espressione della proteina in sedi o in tempi sbagliati. Apoptosi Morte cellulare programmata (PCD). Attivata da numerosi segnali. Distruzione sequenziale della cellula: frammentazione dei cromosomi; disgregazione degli organelli; frammentazione della cellula. Causata dall attività delle caspasi: cysteine-containing aspartate-specific proteases; di norma sono inattive (nessun danno cellulare); lo zimogeno viene attivato mediante proteolisi; le caspasi attive determinano la distruzione di altre proteine. 121

Fattori di crescita e loro omologhi alterati Proteine G e loro omologhi alterati 122

Regioni funzionalmente rilevanti di p21ras Regioni coinvolte nel legame a GDP/GTP Regioni attivabili da GAP Regioni importanti per la risposta a GNRP Proteinchinasi e loro omologhi alterati Proteina pp60 src Meccanismo di spegnimento della pp60 src 123

Geni onco-soppressori Possono codificare regolatori negativi del ciclo cellulare o regolatori positivi dell apoptosi. Retino blastoma causato da un gene RB mutato. p53 (proteina di 53 kda): ~50% dei tumori presentano una forma mutata; la p53 normale è un fattore trascrizionale che viene attivato in risposta a danni del DNA: blocca la progressione lungo il ciclo cellulare per permettere il riparo; determina la morte per apoptosi di cellule gravemente danneggiate; la p53 mutata elimina la risposta apoptotica, permette alle cellule danneggiate di sopravvivere, accumulando mutazioni. 124

Anti-oncogeni: la p53 La p53 è l anti-oncogene più importante. La proteina è espressa in tutte le cellule, localizzata nel nucleo e dotata di diversi siti sensibili alla fosforilazione da parte di ciclina/p34. Ha la capacità di formare omotetrameri che attivano la trascrizione. La formazione di tetrametri attivi è inibita dal complesso p34/ciclina per fosforilazione di p53, oppure per interazione con le oncoproteine di SV40 ed HPV. 125

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Alcune malattie ereditarie umane e tumori associati a difetti di riparazione del DNA 130

RETROVIRUS ONCOGENI Il dogma centrale prima di Peyton Rous: Peyton Rous, nel 1929, isola il primo virus oncogeno. Prima i virus erano definiti solo come agenti filtrabili. * (non della sintesi di RNA RNA-diretta) 131

Dopo aver scoperto che è richiesta una neo-sintesi di DNA (sensibilità agli inibitori FUDR e CAra) e che l RNA del virus è prodotto da una sintesi di RNA DNA-diretta (sensibilità all inibitore Actinomicina D), Temin propose l ipotesi del provirus a DNA. vrna vdna vrna L effetto degli inibitori della sintesi di DNA sulla trasformazione indicano che all entrata del virus nella cellula deve avvenire una sintesi di DNA indipendente dalla sintesi del DNA cellulare (che è comunque bloccata in assenza di siero). L esposizione alla luce non danneggia le cellule, ma blocca la sintesi di virus: quindi il virus ha un intermediario a DNA che viene sintetizzato all entrata nella cellula e in totale indipendenza dalla sintesi di DNA cellulare. 132

L infezione è resistente agli inibitori della sintesi proteica, quindi l enzima che sintetizza il DNA virale non ha bisogno di essere sintetizzato ex novo. Temin (e Baltimore) ipotizzarono che fosse contenuto nei virioni e associato all RNA virale. L enzima, purificato da Baltimore da virioni di MLV (murine leukemia virus), fu chiamato trascrittasi inversa. La trascrittasi inversa possiede tre attività enzimatiche: 1. DNA polimerasi RNA-diretta; 2. RNasi H (attiva sull ibrido RNA-DNA); 3. DNA polimerasi DNA-diretta. Trascrittasi inversa di HIV-1 modello space-filling da dati cristallografici Dopo la scoperta della trascrittasi inversa, il dogma centrale diventa: Il gene che conferisce il potere oncogeno a RSV è il gene v-src, che codifica per una tirosina chinasi. V-src deriva da c-src, un gene normale del genoma del pollo, e contiene mutazioni che lo rendono non regolabile dai normali meccanismi di controllo. 133

Ibridazione tra v-src (nero) e c-src (rosso): v-src corrisponde al cdna di c-src. Un mutante ts di v-src permette di dimostrare che la trasformazione è reversibile e dovuta solo a v-src. HIV Il genoma dell HIV è composto da circa 9300 nucleotidi. 134

Ciclo vitale di un retrovirus (HIV) 135

Se i recettori usati dal virus non sono presenti il soggetto è immune (10% della popolazione europea). Riducendo il colesterolo della membrana si ostacola il processo di fusione. 136

La latenza del virus permette un infezione cronica, e può essere causata da: integrazione del virus nell eterocromatina; mancanza della proteina Tat (antiterminatrice), necessaria per una trascrizione ad alta efficienza. 137

Le 9300 basi dell RNA di HIV codificano otto geni. La trascrizione di HIV è regolata da fattori cellulari che agiscono sull enhancer e sul promoter del provirus. 138

All inizio del ciclo vitale del virus, la trascrizione è poco efficiente e viene quasi sempre terminata dopo circa 90 basi. Il trascritto viene tutto double-spliced e si traducono solo le proteine tat, rev e nef. Due proteine virali intervengono nella regolazione della trascrizione: 1. la proteina Tat è un anti-terminatore, che legandosi all RNA stimola il proseguimento della trascrizione (x 2000); 2. la proteina Rev blocca lo splicing e fa esportare l RNA nel citoplasma. 139

Dopo l integrazione nei cromosomi dell ospite, HIV entra a far parte di una struttura cromatinica che reprime la trascrizione. Il promotore è relativamente libero, ma si formano treni di nucleosomi sia a monte che a valle. La coda CTD della RNApolII può essere forsforilata controllando il tasso di trascrizione. Tat si associa a TAR reclutando Cyclin T1 e la corrispondente chinasi CDK9, che fosforila CTD. Viene reclutata anche p300 (acetyl-transferasi) che acetila gli istoni e sblocca la struttura cromatinica che rallentava il progresso della polimerasi. Nuclear Speckles è un comparto nucleare ricco di fattori per lo splicing. Nuclear Body è un altro comparto che coordina la presenza di p300, Cyclin T1 e PML. La FRET (fluorescence resonance energy transfer) permette di rivelare quali proteine entrino fisicamente in contatto, come Tat & Cyc T1 e Cyc T1 & PML. 140

Il trascritto primario di HIV: frame di lettura e segnali sull RNA. Oltre al trascritto primario, lo splicing genera altri 5 mrna: gli mrna I, IV e VI sono bi-cistronici; il V e VI subiscono un doppio splice. Le poliproteine gag e gag-pol, miristilate, si ancorano alla membrana. La proteasi si auto-attiva ( ), e taglia le poliproteine nelle proteine mature. La p24 si auto-polimerizza con simmetrie esagonali a formare un capside tubulare. Alcune interazioni a simmetria pentagonale richiudono il capside a forma di pera. Vista laterale Vista dal basso 141

Motivi per cui non si riesce a trovare una cura per l AIDS 1. La trascrittasi inversa è un enzima molto infedele e introduce molti errori. In ogni particella, ad ogni ciclo, vengono introdotti 2 o 3 errori, quindi in ogni paziente ci sono centinaia di varianti del virus. Ad esempio, se si utilizza l AZT (desossinucleotide che contiene un gruppo ammidico al posto dell ossidrile) per interrompere la sintesi di DNA, dopo poco tempo viene selezionato un virus resistente e l AZT non funziona più. 2. Nel caso dell AIDS, al contrario di tutte le altre infezioni virali, la vaccinazione non è efficace. Le proteine del virus somigliano ad alcune proteine umane, quindi la reazione dei linfociti killer è poco efficace. 3. Mentre solitamente la presenza di anticorpi su una particella ne determina la distruzione tramite una reazione di complemento, questa reazione non avviene con l HIV perché la gp120 lega un inibitore del sistema di complemento. PCR (reazione a catena della polimerasi) La PCR (Polimerase Chain Reaction), è tecnica che permette di amplificare una specifica sequenza di DNA milioni di volte in poche ore: si possono eseguire fino a 35 cicli, ad ognuno dei quali la quantità di DNA raddoppia. In tre ore si compiono 30 cicli. La tecnica è stata inventata da Kary Mullis nel 1983, e viene applicata a scopo diagnostico, ad esempio per diagnosticare l infezione da HIV o da un altro virus. Nel caso dell HIV si usano come primer delle sequenze di HIV. In una cellula in divisione, la replicazione del DNA comporta una serie di reazioni mediate da enzimi, il cui risultato è una copia fedele dell intero genoma. Gli enzimi prima denaturano la doppia elica di DNA in eliche singole. Quindi, l RNA polimerasi sintetizza una breve sequenza di RNA complementare ad una delle eliche di DNA all inizio del sito di replicazione. Ad essa si lega la DNA polimerasi, che produce la sequenza di DNA complementare. Durante la PCR, l alta temperatura viene usata per separare il DNA in eliche singole, e una sequenza sintetica di DNA a singola elica (20-30 nucleotidi) viene usata come primer. Due differenti sequenze primer sono usate per delimitare la regione che deve essere amplificata. Un primer è complementare ad una sequenza di DNA all inizio della regione bersaglio; l altro primer è complementare all altra sequenza di DNA alla fine della regione bersaglio. Per eseguire una reazione PCR, una piccola quantità del DNA bersaglio è aggiunta è aggiunta ad una soluzione contenente: DNA polimerasi termostabile, isolata dal batterio Thermus aquaticus, che vive ad alte temperature. Questo enzima, chiamato Taq DNA polimerasi, rimane attivo nonostante ripetuti riscaldamenti duranti molti cicli di amplificazione; brevi primer di oligonucleotidi; i quattro blocchi dei desossinucleotidi di costruzione del DNA; il cofattore MgCl 2. La soluzione PCR è fatta passare attraverso cicli di replicazione che consistono in: diversi minuti a 94-96 C, durante i quali il DNA è denaturato in eliche singole; diversi minuti a 50-65 C, durante i quali i primer ibridano o si fissano (tramite legami idrogeno) alle loro sequenze complementari su entrambe le eliche della sequenza bersaglio; diversi minuti a 72 C, durante i quali la DNA polimerasi si lega e produce una sequenza complementare a partire da ciascun primer. Man mano che l amplificazione procede, la sequenza di DNA tra i primer si duplica ad ogni ciclo. In trenta di questi cicli, si ha un fattore di amplificazione teorico di un miliardo. 142