Gli oncogeni Oncogenes Virus tumorali a DNA Famiglia tumori causati dimensioni del del virus nell uomo genoma (kb) Virus tumorali a DNA Virus dell epatite B cancro del fegato 3 Papova v. (SV40 e Polyoma) nessuno (in animali solo) 5 5 Papilloma v. carcinoma cervicale 8 Adenovirus nessuno 35 Epstein Barr Herpes linfoma di Burkitt 100-200 (carcinoma nasofaringeo) sarcoma di kaposi Virus tumorali a RNA Virus oncogeni Retrovirus leucemia T dell adulto 9 1
La attività trasformante di un virus dipende da uno o più geni che appartengono al genoma virale L oncogene causa dei cambiamenti che convertono la cellula normale in una cellula trasformata Virus a DNA (studi sulla trasformazione oncogena...delle cellule, scoperta oncosoppressori) Retrovirus (hanno permesso la scoperta degli...oncogèni) Famiglia tumori causati dimensioni del del virus nell uomo genoma (kb) Virus tumorali a DNA Virus dell epatite B cancro del fegato 3 Papova v. (SV40 e Polyoma) nessuno 5 Papilloma v. carcinoma cervicale 8 Adenovirus nessuno 35 Epstein-Barr (herpesvirus) linfoma di Burkitt 100-200 (carcinoma nasofaringeo) sarcoma di Kaposi Virus tumorali a RNA Virus oncogeni Retrovirus leucemia T dell adulto 9 VIRUS A DNA Come trasforma un virus oncogeno a DNA? 2
Ciclo vitale latente Virus Cellula Integrazione (generalmente) EARLY FUNCTIONS- Virus-specifiche espresse - No virus maturi Variazioni delle proprietà della cellula ospite - TRASFORMAZIONE Le colture cellulari primarie hanno una crescita limitata Senescenza dopo 40 duplicazioni L immortalizzazione di alcune cellule risulta in colture stabilizzate Le cellule immortalizzate possono essere trasformate da ulteriori mutazioni e dall infezione con virus oncogeni 3
Primary Culture= growing cells taken from tissue Cell Line= A primary culture when it is transferred into the next culture vessel (passaging). Cells grow till SENESCENCE. Immortal Cell Line= Most human cancer express telomerase, but either cannot be cultured or undergo senescence. They must be transformed with VIRAL GENES that sequester p53 or RB. Cells will senescence later (CRISIS) Some occasional cells will acquire other mutation/s that make them Immortal Continous cancer cell lines= Only highly aggressive cancers or some metastasis have accumulated genetic changes necessary to immortalize Trasformazione Tra le diverse proprietà alterate della CELLULA TRASFORMATA si ha: perdita del controllo proliferativo (perdita dell inibizione da contatto in cellule in coltura) Invasione della matrice extracellulare Mobilità Ridotta adesione Le cellule trasformate spesso contengono aberrazioni cromosomiche Virus oncogeni a DNA genoma virale a DNA DNA polimerasi DNA-dipendente (Codificata dal Virus o dall ospite) RNA polimerasi codificata dall ospite mrna virale proteine virali 4
PAPOVAVIRUS: specie-specifici PA: papillomavirus PO: polyomavirus VA: vacuolizzanti 2 generi Virus senza pericapside 40-50 nm di diametro 72 capsomeri con 5-7 proteine struttura icosaedrica DNA bicatenario circolare di 5-8 Kb Sede di replicazione: nucleo Sono citocidi 2 generi: PAPILLOMAVIRUS DNA 5 Kb Non crescono in coltura Oncogeni nell ospite naturale POLIOMAVIRUS 6 DNA 3,3.10 Crescono in vitro Potere oncogeno dubbio Papilloma HPV 8Kb Closed CircularDNA causano tumori naturali nell animale causano verruche benigne sono ubiquitari epiteliotropici - la maggior parte dei tumori umani derivano da cellule epiteliari 90% dei Tumori cervice uterina, vulvare, pene 10% of human cancers Papilloma Papilloma Virus Il loro capside è di 55 nm, il peso molecolare 5,2x10 dalton e possiedono 7.900 paia di basi. 51 tipi identificati - i più comuni sono i tipi 6 e 11 (basso rischio) per lo più tumori cervicali (cervice uterina), vulvari e penieni, ASSOCIATI ai tipi 16 e 18 (70% dei tumori penieni),31,33,45 STUDI EPIDEMIOLOGICI : HPV 16 e HPV 18 trasformano i cheratinociti umani 5
Caratteristiche del capside 72 capsomeri 60 esavalenti - 12 pentavalenti 2 proteine strutturali: - L1 proteina capsidica maggiore peso molecolare di 55 kd rappresenta l 80% delle proteine capsidiche - L2 proteina capsidica minore peso molecolare di 70 kd rappresenta il restante 20% delle proteine capsidiche CANCRO DELLA CERVICE - è il secondo cancro prevalente - è la quinta causa di morte nelle donne - circa 470.000 nuovi casi sono diagnosticati ogni anno con un et età di 52 anni per lo sviluppo del tumore I fattori di rischio per lo sviluppo del tumore sono: Infezioni persistenti con HPV ad alto rischio Un largo contatto con partners infetti Co-infezioni con virus dell immunodeficienza umana (HIV-1) Immunosoppressione Fumo 6
Organizzazione del genoma e proteine virus indotte LCR E7 E6 0 L1 L2 E1 E2 E4 E5 E1 E5 E2 E4 Proteina capsidica maggiore (attacco alle cellule) Proteina capsidica minore L2 7906 Replicazione DNA virale, stato episomico del DNA Replicazione DNA virale, controllo trascrizione Legame citocheratine, assemblaggio Trasformazione cellulare (lega recettori EGF, PDGF) E6 Trasformazione cellulare (lega p53) E7 Trasformazione cellulare (lega prb) L1 CIN cervical intraepithelial neoplasia PROTEINE E1 - Proteina di 65 kda - Attività ATPasica ed elicasica 3-5 reclutata da E2 all origine virale dove riconosce sequenze ricche in AT -Forma complessi con E2 sull origine di replicazione inducendo una distorsione nel DNA virale che facilita il reclutamento di altre molecole E1 e il distacco di E2 - Si assembla in un doppio anello esamerico, aiutato dall associazione con proteine heat shock (es. Hsp40 e Hsp70) - Lega proteine importanti per la replicazione come RPA (Replication Protein A) e la DNA polimerasi alfa-primasi cellulare 7
E2 E2 - Proteina di 50 kda - E una DNA binding protein che riconosce, attraverso il dominio C-ter e sottoforma di dimero, un motivo palindromico (AACCg(N4)cGGTT) nella regione LCR - Lega E1 attraverso il dominio N-ter - Ancora gli episomi virali ai cromosomi mitotici per la corretta segregazione - Può formare un complesso con i fattori trascrizionali C/EBP che regolano diversi promotori associati al differenziamento cellulare - Agisce anche come fattore trascrizionale e regola il promotore precoce: A bassi livelli E2 agisce come attivatore trascrizionale Ad alti livelli E2 reprime il promotore bloccando il legame dei fattori trascrizionali (es. TFIID e SP-1) - Over-produzione di E2 porta ad apoptosi p53 indipendente E4 - Proteina di fusione E4-E5 - L ORF è priva del codone di inizio AUG e quindi usa la sequenza d inizio di E1 formando proteine E1-E4 - La sua rimozione non porta agli eventi tardivi, quindi si pensa sia coinvolta nell uscita del virus E5 - Proteina transmembrana che risiede soprattutto nel RE - Può associarsi alla pompa vacuolare ATPasi e rinvia il processo di acidificazione dell endosoma endosoma riciclo dei recettori per EGF (epidermal growth factor) E5 In presenza della proteina E5, il numero degli EGFR aumenta 8
Ligandi EGF-like di poxvirus V-Cbl ( senza RING domain) T654 phosphorylation E5 papilloma inibisce ATPasi dell endosoma E6 E6 -Ruolo di proteina anti-apoptotica in quanto lega p53 e ne media la degradazione in sinergia con E6-associated protein E6AP -Compromette la risposta cellulare al danno al DNA permettendo l accumulo di mutazioni secondarie -Media la proliferazione cellulare e contribuisce allo sviluppo di metastasi tumorali, provocando la distruzione della normale adesione cellulare - Attiva l espressione l della subunità catalitica della telomerasi E7 - La presenza di E7 porta ad una caratteristica ritenzione dei nuclei in tutti gli strati epiteliali infettati - Si associa alla prb (retinoblastoma) impedendone l associazione col fattore trascrizionale E2F, il quale va a transattivare proteine cellulari richieste per la replicazione virale - Si associa anche ad altre proteine come: Deacetilasi istoniche E7 Inibitori della chinasi ciclina dipendente p21 e p27, guidando le cellule alla mitosi 9
vaccino Cervical-intraepithelial neoplasia Virus Polyoma DNA 6kb Papilloma DNA 8kb Adeno DNA 37kb Oncogene T antigen early E6, E7 early E1A, E1B, early Le oncoproteine di Papilloma:E6, E7 10
E6 +E6 Hect Per superare l attività pro-apoptotica di p53, E6 lega p53 in un complesso ternario con la Hect ubiquitin ligasi E6-AP (E6-Associated Protein) Questo porta all ubiquitinazione di p53 e alla sua degradazione da parte del proteasoma 26S La vita media di p53 risulta ridotta da molte ore a meno di 20 nei cheratinociti Ub AMP ATP Attivazione E2 E1 E1 E2 p53 Proteasome complex p53 E3 p53 E6 E6 AP E3 E6 AP E6 p53 E6 E6 AP P21 WAF1 inibitore delle kinasi ciclina dipendenti---- Cdk2/Cyclin E Cdk4/cyclinD ; controllo G1 E2F growth-promoting transcription factor----> INK4/ARF ( che protegge p53) The Human ARF Cell Cycle Regulatory Gene Promoter Is a CpG Island Which Can Be Silenced by DNA Methylation and Down-Regulated by Wild-Type p53 11
ARF MDM2 P53 Le oncoproteine di Papilloma:E6, E7 Il Retinoblastoma legato al peptide virale che lo blocca E7 di papilloma E7 12
CONVERGENT EVOLUTION E 7 DI PAPILLOMA E1A DI ADENO 5 LARGE T ANTIGEN DI SV40 SONO ONCOPROTEINE VIRALI CAPACI DI SEQUESTRARE O INATTIVARE prb Lo legano solo se ipo-fosforilato UBIQUITINA 76 RESIDUICONSERVATA da lievito a uomo C-TERMINAL GLYCIN linked to Epsilon-side chain of lysin proteasome 3-25 aa 530 human genes for E3 Ub-ligase 110 human genes for deubiquitylating enzymes 13
Polyoma 5Kb Polyoma virus trasforma cellule quando il genoma è incompleto Sono necessarie funzioni precoci Simian virus 40 - sarcomi nel criceto neonato, trasformazione Polioma - leucemia murina, trasformazione in vitro Polioma umani (JC and BK) - sarcoma della scimmia, trasformazione LEUCOENCEFALOPATIA MULTIFOCALE PROGRESSIVA La poliomelite : da virus a RNA Picornavirus tipo Brunhilde 1,2,3 Il virus per I vaccini è stato passato su una quarantina di colture di rene di scimmia e di African Green monkey skin Vaccino di Jonas Salk: virus ucciso in formalina =IPV inattivato da iniettare Vaccino Albert Sabin: Ceppi di poliovirus attenuati= OPV orale 1960:SV40 è stato il quarantesimo virus trovato nelle cellule renali di scimmia utilizzate per crescere I vaccini. Se iniettato in hamster causa tumori Il problema dell SV40 poliomavirus dei macachi Causa tumori cerebrali negli animali da laboratorio Trasforma le cellule in coltura L agt lega p53 e la inattiva 1955-1962: presente nel vaccino antipolio iniettato a 10 milioni di bambini in Europa e America 1960-1961: presente nel vaccino anti adenovirus: vaccinato tutto l esercito americano Sequenze di SV40 trovate in tessuti tumorali umani 3-4% della popolazione umana ha anticorpi anti SV40 Trovato nello sperma di uomini non vaccinati in quel periodo (!?) 14
La struttura del capside del virus SV40 ( determinata mediante diffrazione dei raggi-x) Il virus SV40 SV40 Ciclo produttivo (litico) in cellule permissive Trasformazione di cellule non permissive Le cellule trasformate da polyoma o adenovirus Contengono geni virali EARLY integrati a caso nel Genoma cellulare Virus Polyoma DNA 6kb Papilloma DNA 8kb Oncoproteine di polyoma Oncogene T antigen Jdomain Tantigen ATPase domain E6, E7 early Adeno E1A, E1B, early DNA 37kb Gene cellulare Retinoblastoma p53 P53 e Rb rispettivamente Rb e p53, rispettivamente 15
SV40 Lega p53 T antigen ( in rosso) blocca la proteina del retinoblastoma ( soppressore di tumori, in blu e verde) interagendo in una tasca di legame, 2001 SV40 T antigen usa J domain e LxCxE motif per legare RB J Domain 16
Large T antigen usa un meccanismo da chaperon per staccare E2f da Retinoblastoma HEAT SHOCK 70 RB synopsis SV40 SV40 infection leads to telomerase activity, overexpression of Notch-1 which promotes cell cycle progression and upregulation of insulin-like growth factor (IGF) Small t antigen of SV40 comprises 174 amino acids. The region between residues 97-103 interacts with the PP2A phosphatase. This interaction reduces the ability of PP2A to inactivate ERK1 and MEK1 protein kinases, resulting in stimulation of proliferation of cells SV40 large tumor antigen (Tag) blocks RASSF1A causing accumulation of D cyclins. Large T ATPase domain Binds p53 DNA-binding domain 17
ADENOVIRUS 35Kb Elevato potere oncogeno negli animali:adenocarcinoma Il genoma virale viene integrato parzialmente Sempre la stessa porzione Funzioni precoci regione E1A : 2 antigeni T regione E1B : 1 antigene T E1A e E1B = Oncogeni Virus Oncoproteine di adeno Oncogene Gene cellulare Polyoma DNA 6kb Papilloma DNA 8kb Adeno DNA 37kb Large T antigen Small T antigen E6, E7 E1A, E1B-55K E1B-19K inattiva Retinoblastoma e p53 PP2A phosphatase P53 e Rb rispettivamente Rb e p53, rispettivamente BAK e BAX Virus oncogeni Famiglia tumori causati dimensioni del del virus nell uomo genoma (kb) Virus tumorali a DNA Virus dell epatite B cancro del fegato 3 Papova v. (SV40 e Polyoma) nessuno 5 Papilloma v. carcinoma cervicale 8 Adenovirus nessuno 35 Epstein-Barr (herpesvirus) linfoma di Burkitt 100-200 (carcinoma nasofaringeo) sarcoma di Kaposi Virus tumorali a RNA Retrovirus leucemia T dell adulto 9 18
HERPES 200Kb Evidenze notevoli di un ruolo nei tumori umani Alcuni con elevato potere tumorigeno nell animale Il DNA virale è ritrovato in una piccola percentuale delle cellule tumorali: meccanismo hit and run HHV-8 Sarcoma di Kaposi Virus di Epstein-Barr Linfoma di Burkitt Tumore Nasofaringeo Linfomi delle cellule B in immunodepressi Mononucleosi Infettiva Trasforma linfociti B umani in vitro Sarcoma di Kaposi ( dr Moritz Kaposi 1872) Herpes Virus Umano 8, HHV-8 Sarcoma di Kaposi: il DNA virale è ritrovato con frequenza elevata in tutte le forme epidemiologiche del sarcoma. L analisi del genoma ha rivelato la presenza di un gene omologo di Interleuchina-6 (vil-6, growth factor) E di viral homologue of D-type cyclins. Disfunzioni dei meccanismi di regolazione dell espressione di questa citochina sono state correlate con la patogenesi di linfomi delle cellule B oltre che del sarcoma di Kaposi A genetic switch Gene expression profiling to answer the question What cells it arises from OLD: Kaposi sarcoma affects cells of skin, express Lymphatic-endothelial genes. NEW: Kaposi infects vascular endothelial cells and transcriptionally reprogram the cells to became lymphatic vessel cells inducing also blood vessel endothelial cell genes 19
HH8 Human Herpesvirus8-Kaposi Proteine virali che influenzano proteine cellulari: HHV-8 LANA-1 represses the pro-apoptosis transcriptional activity of p53 HHV-8 Anti-apoptotic vflip prevents the activation of the Fas death receptor pathway Proteine virali che mimano proteine cellulari: HHV-8 cyclin D overrides host cell-cycle growth arrest, VEGFR3, vil-6 angiopoietin2, podoplanin CD206, LYMPHATIC ENDOTHELIAL ASSOCIATED genes Espressione cellulare modificata dal virus: Overespressione omeobox gene PROX1= espressione di geni per il differenziamento dell endotelio vascolare del derma in endotelio linfatico Kaposi Sarcoma: Tumore angioproliferativo a forte componente infiammatoria Tumore in individui immunodepressi, il virus infetta cellule endoteliali vascolari e le riprogramma in linfatiche le cellule esprimono marcatori endoteliali In gene-expression analysis si caratterizzano geni LEC =lymphatic endothelial o BEC = blood vessel endothelial cells 20
Herpes virus Epstein-Barr EBV 172 kb: EBV Burkitt Lymphoma Infetta linfociti B quiescenti o cellule epiteliali (scarsamente litico) Attivazione di cellule B quiescenti che vengono indotte a proliferare (Ricombinazione Ag dipendente?) Traslocazione bilanciata reciproca braccio lungo cromosoma 8 (Myc) e 14 (IgH) produzione EBNA-4 gene latente ANTIAPOPTOTICO Linfoma di Burkitt africano Tumore mascella o orbita Starry sky cielo stellato: piccole cellule B non aderenti Uno dei tumori a crescita più rapiada EBV Epstein Barr 1961 Denis Burkitt presenta in Inghilterra un tumore dei bambini africani. 8 bimbi su 100.000. Influenza del clima e zona malarica 1964 Epstein, Barr, Achong individuano il virus in tessuto neoplastico 1968 EBV viene riconosciuto agente eziologico della mononucleosi 2004 EBV ha specificità per cellule epiteliali e B ed induce una proliferazione incontrollata (immortalizzazione e trasformazione). EBN4 aumenta Bcl2 (antiapoptosi), Antigene attivazione B (CD40) e diminuisce geni della differenziazione 21
Famiglia tumori causati dimensioni del del virus nell uomo genoma (kb) Virus tumorali a DNA Virus dell epatite B cancro del fegato 3 Papova v. (SV40 e Polyoma) nessuno 5 Papilloma v. carcinoma cervicale 8 Adenovirus nessuno 35 Epstein-Barr (herpesvirus) linfoma di Burkitt 100-200 (carcinoma nasofaringeo) sarcoma di Kaposi Virus tumorali a RNA Virus oncogeni Retrovirus leucemia T dell adulto 9 EPATITE HBV portatori cronici di HBV (positivi al test di HBsAg nel siero) hanno un rischio di sviluppare un tumore del fegato da 5 a 100 volte maggiore dei non portatori; ed è stato stimato che la cronicità dell infezione è responsabile del 60% dei casi di tumore primitivo del fegato nel mondo, con punte del 67% dei casi nei Paesi in via di sviluppo HCV è la causa più frequente di malattia cronica del fegato nel mondo occidentale; EPATITE B pararetrovirus Virus dell Epatite B Genoma a DNA RNA polimerasi II Provirus a RNA Trascrittasi Inversa Enzima dell ospite hepatitis B surface antigen, or HBsAg hepatitis B e antigen (HBeAg), X protein Viral polymerase Core proteins Genoma a DNA Enzima virale 22
EPATITE B Epidemiologia: Forte correlazione fra HBV ( 3.2 Kb, 4 ORF) e il carcinoma epatocellulare Cina: 500.000-1 milione di nuovi casi di carcinoma epatocellulare all anno Taiwan: il rischio relativo di contrarre HCC è 217 x rispetto ai non portatori Problema sanitario importante il 10% della popolazione nei Paesi in via di sviluppo è portatore cronico Lungo periodo di latenza (<30 anni) MICROINFIAMMAZIONI CRONICHE cause long term damage to tissues resulting in large scale cell regeneration which increases the chances of natural mutation in proto-oncogenes Hepatitis BVirus does not contain a known oncogene. HBV DNA is integrated into host DNA in the great majority of hepatocellular carcinomas in HBV carriers, and chromosomal translocations associated with integrated HBV sequences have been reported. IPOTESI tumorigenesi del virus EPATITE 1. Tumori da inserzione del virus nel DNA cellulare 2. Produzione di proteine oncogene : proteina X 3. Infiammazione cronica che induce rigenerazione X induce vascolarizzazione (angiopoietina), reprime apoptosi (interagisce con survivin) In infezioni con HBV c è metilazione dei promotori delle MHC classeii e scarsa presentazione antigeni da linfociti B, monociti e neutrofili 23
modello Modello della trasformazione causata da virus a DNA La espressione costitutiva di oncogeni trasforma la cellula eliminando I normali controlli del ciclo cellulare Virus Oncoproteine Oncogene Gene cellulare Polyoma DNA 6kb Papilloma DNA 8kb Adeno DNA 37kb T antigen Small T E6, E7 early E1A, E1B, early Retinoblastoma e p53 Phosphatase PP2A P53 e Rb rispettivamente Rb e p53, rispettivamente Herpes 150 Kb citochine, growth factor, Myc, riprogrammazione Epatite 3 Kb growth factor, antiapoptosis, ------------------- ------angiogenesis, immune system 24
Epo= eritropoietina Gp55 spleen focus-forming virus Eritroleukemia Immortalizing or Trasforming? E molto difficile stabilire linee cellulari stabili da tumori primari Per studiare I tumori (ricerca di base) Per definire un vaccino contro un tumori (gene therapy) Perchè cellule trasformate non crescono per sempre in vitro? Perchè cellule immortalizzate non causano tumori? Hanno bisogno di specifici fattori di crescita? 25
I geni dell immortalità: telomerasi Immortal cells will not cause tumors in immunocompromised animals. Furthermore, they will generally only grow as a single layer of cells in a dish, exhibiting what is known as contact inhibition Geni della trasformazione: Transformation is essentially loss of contact inhibition, the ability to sometimes grow in the absence of survival factors and the ability to divide without being specifically instructed to do so from outside the cell 1) Geni che inattivano soppressori cellulari 2) Oncogeni 3) Telomerasi 1) Anti tumor-suppressor SV40 Large Tantigen lega Rb, lega p53 Human papilloma E6 che lega p53, E7 che lega Rb Adenovirus E1A che lega Rb ed E1B che lega p53 Polyoma large T antigen che lega Rb Mutanti di p53 Immortalizing and trasforming genes 2) Oncogenes/Proliferation stimulating genes: Myc, Bmi-1, ras, Raf, se overespressi 3) Telomerasi, per impedire l accorciamento dovuto ad incompleta replicazione del 5 (anti-senescenza) 26
HeLa P53 LOW HCT 116 RAS mutations LoVO 27
Stress e tumori tumore definisce un complesso di patologie derivate dalla crescita incontrollata di cellule, in qualche modo alterate in modo multifattoriale, sono necessarie almeno quattro alterazioni geniche perché una cellula umana normale diventi neoplastica (Hahn 1999). 1- l'attivazione della telomerasi che porta la cellula all'immortalità 2- l'inibizione di geni oncosoppressori (p53, RB, BRCA1-2, FHIT, 3- l'attivazione di oncogeni (ras, myc, apc, DCC, HER2, EGFR), 4- l'inibizione dell apoptosi o morte cellulare programmata (bcl-2, bax) 5- l'attivazione dell angiogenesi (VEGF, PDGF). stress, definito da sindrome generale da adattamento,con aumento di catecolamine, cortisolemia, neurotrasmettitori, ormoni, sembra influenzare principalmente il sistema immunitario (Riley 1981, Page 1994, Ben Eliyau 1991), i meccanismi di riparazione del DNA o di induzione dell apoptosi (Kiecolt-Glaser 1999) 28