Polymerase chain reaction (PCR)

Polymerase chain reaction (PCR) La reazione a catena della polimerasi (PCR) ha di fatto rivoluzionato la genetica molecolare, con la possibilità di analizzare e clonare velocemente il DNA. E un metodo in vitro molto versatile per amplificare determinate sequenze bersaglio presenti in campioni di DNA. Sono necessarie informazioni sulla sequenza del DNA bersaglio, almeno per consentire il disegno della coppia di primers specifica da utilizzare nella reazione di amplificazione. Kary B. Mullis (USA) Nobel Prize in 1993 for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method

Cosa ha reso la PCR così facilmente accessibile? La disponibilità di DNA polimerasi termostabili. Taq DNA polimerasi (estratta da Thermus aquaticus). L ingegnerizzazione di termociclatori capaci gestire velocemente e con elevata precisione i cambi di temperatura che caratterizzano il processo di amplificazione.

Scelta dei primers Il disegno della coppia di primers è molto importante per la buona riuscita della PCR. Sono disponibili supporti bioinformatici che aiutano nella selezione. PRIMER3 www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/ Primer-BLAST www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

Vantaggi e Svantaggi della PCR Velocità e semplicità. Sensibilità Duttilità Necessità di informazioni sulla sequenza bersaglio Dimensioni ridotte del prodotto di PCR Imprecisione della replicazione del DNA

Le potenzialità da alcuni esempi 7

Fibrosi Cistica (CF; mucoviscidosi) Trasmissione autosomica recessiva: gene CFTR Incidenza 1:2000 nati razza caucasica, più rara in altre popolazioni. Frequenza degli eterozigoti circa 1:25 (caucasici) E caratterizzata da tipiche alterazioni fibrotiche a carico di diversi sistemi ghiandolari esocrini, in particolare pancreas, ghiandole bronchiali, ecc. L apparato respiratorio è interessato da accumulo di dense secrezioni viscose con frequenti ostruzioni bronchiali, ricorrenti infezioni polmonari che conducono in genere a morte per insufficienza respiratoria entro i 30 anni. A livello pancreatico-intestinale si hanno gravi disturbi digestivi e malassorbimento. Nel 10% dei neonati si ha ostruzione intestinale a causa del meconio molto denso. E presente infertilità nel maschio (> 95%) con agenesia congenita dei dotti deferenti (CAVD). 8

CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) Il gene CFTR codifica per una proteina canale di 1480 aa. localizzata alla membrana delle cellule epiteliali e coinvolta nel trasporto del cloro. 9

Basi Molecolari Mutazioni nel gene CFTR (27 esoni) a 7q31 Più di 1500 mutazioni identificate (HGMD) Ogni mutazione può determinare differenti effetti (alleli amorfi e/o ipomorfi). 10

Mutazioni nel gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) Mutazioni ricorrenti c.1521_1523delctt p.(phe508del) nel 70 % della popolazione del Nord Europa e nel 50% della popolazione del Sud Europa (gradiente NORD SUD in Italia) Nei pazienti CAVD solo il 20% presenta mutazioni patogene bialleliche, la maggior parte ha una mutazione (eterozigote) o nessuna. Frequente la presenza di varianti alleliche in 2 regioni polimorfiche dell introne 8 (5T, 7T, 9T, 11TG, 12TG, 13TG) 5T (20-30% CAVD) 12TG, 13TG (in cis con 5T) Alterato splicing dell esone 9 11

Mutazioni più comuni in CFTR MUTATION RELATIVE FREQUENCY delf508 66% G542X 2.4% G551D 1.6% N1303K 1.3% W1282X 1.2% R553X 0.7% In Italia l analisi di 30-40 mutazioni consente d identificare circa il 70-80% degli alleli CFTR 621+1G>T 0.7% 1717-1G>A 0.3% R117H 0.3% R1162X 0.3% 12

Dot Blot con sonde ASO (Allele Specific Oligonucleotide)

Amplification Refractory Mutation System (ARMS)

OLA (Oligonucleotide Ligation Assay) 15

Mutation screening mediante PCR

Il sequenziamento del DNA Il metodo oggi comunemente utilizzato è il metodo enzimatico di Sanger. Prevede la reazione di sintesi del DNA utilizzando dntp + ddntp (2,3 dideossinucleotidi trifosfati). L assenza dell OH in 3 impedisce la formazione del legame fosfodiesterico con la base successiva è la sintesi s interrompe Se i ddntp sono opportunamente marcati, dopo separazione elettroforetica, è possibile leggere la corretta successione delle basi.

Neurofibromatosi di tipo 1 (NF1) NF1 NF1 Neurofibromatosi di tipo 1 Eredità autosomica dominante Incidenza di circa 1:3000 Nel 50% dei casi si tratta di forme familiari in cui la mutazione è ereditata da un genitore affetto. Il restante 50% dei casi è il risultato di nuove mutazioni che incorrono spontaneamente.

Il gene NF1 E un tumor suppressor gene e si estende su ~ 285.000 basi del cromosoma 17 ed è costituito da 58 esoni. Il trascritto principale è lungo 8959 bp codifica per una proteina, la neurofibromina, costituita da 2839 aa (p.m. ~ 320kDa) che agisce come regolatore negativo del Ras/MAPK pathway.

Mutazioni del gene NF1 X NF1 ATGGCCGCGCACAGGCCGGTGGAA TGGGTCCAGGCCGTGGTCAGCCGC TTCGACGAGCAGCTTCCAATAAAA T ACAGGACAGCAGAACACACATACC AAAGTCAGTACTGAGCACAACAAG GAATGTCTAATCAATATTTCCAAA TACAAG...

Criteri della Diagnosi Clinica Sei o più macchie caffelatte. Due o più neurofibromi cutanei o un neurofibroma plessiforme. Freckling ascellare o inguinale. Glioma ottico Due o più noduli iridei di Lisch. Specifiche lesioni ossee. Parentela di primo grado con un soggetto affetto da NF1. La presenza di due di questi segni consente di porre la diagnosi di NF1

RASopathies Sono causate da mutazioni in geni che codificano per proteine che regolano l attivazione del Ras/MAPK pathway. Presentano caratteristiche fenotipiche uniche ma con molti segni in comune quali caratteristiche faciali, difetti cardiaci, anomalie cutanee, ritardo neurocognitivo e predisposizione a sviluppare tumori.

Sindrome di Legius (NF1-like) Si caratterizza per la presenza di macchie caffelatte ed assenza di neurofibromi ed altre manifestazioni tumorali tipiche della NF1. Altre manifestazioni cliniche descritte includono freckling ascellare o inguinale, lipomi, macrocefalia e difficoltà di apprendimento / ritardi nello sviluppo. Il gene SPRED1 include 7 esoni e mappa a 15q14. Il trascritto principale è lungo 7255 bp e codifica per una proteina di ~50.5 kda (Sprouty-related, EVH1 domain containing protein 1) che ugualmente agisce come regolatore negativo del Ras/MAPK pathway.

Genes Dev. 2012 26(13):1421-6 Spred1 lega la neurofibromina e la recluta alla membrana cellulare dove può funzionare da regolatore negativo del Ras/MAPK pathway. Hum Mutat. 2012 33(11):1538-46

Leiden Open Variation Database (LOVD) NF1 (www.lovd.nl/nf1) Aprile 2014 SPRED1 (www.lovd.nl/spred1)

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Diagnostica molecolare nel nostro laboratorio AUG NF1 (8457 bp) Stop A B C D E F G H I L M N O P Q R S T U V SPRED1 (1335 bp) A AUG B Stop Estrazione RNA Amplificazione mediante RT-PCR dei 21 frammenti Sequenziamento bidirezionale dei frammenti Identificazione della mutazione e conferma su DNA genomico

Diagnostica molecolare nel nostro laboratorio Per i campioni in cui la mutazione non è stata identificata Estrazione DNA Ricerca di delezioni/duplicazioni del gene NF1 per MLPA Elettroforesi capillare Analisi dei risultati

1260_1261insCTGACTACAT TGGACTTGGCACTGCT (42bp) Exon 11(09) 0.92 0.96...ttgtctacaaCTGACTACAT...TGGCACTGCTgtaagtggct... g Exon 12 (10a) 1604bp 3113bp g a t a t t t t t g t c t a c a a c t g a c t a c a t a g a g c a c

Human Genome Variation Society (www.hgvs.org) NM_000267.3:c.4515-2A>G p.(arg1505serfs*53) 33

Nomenclatura HGVS (www.hgvs.org) Evitare confusione (descrizione univoca) DNA: A, G, C, T [g.957a>t, c.63-3t>c] RNA: a, g, c, u [r.957a>u, r.(?), r.spl?] Proteina: codice a 3 lettere (preferibile) * = Stop codon [p.(his78gln)] "c." coding DNA "g." genomic sequence "m." mitochondrial sequence "n." non-coding RNA "r." RNA sequence "p." protein sequence Numerazione: 1 da ATG della coding RefSeq 1 arbitrario per sequenza genomica (1 a base della RefSeq genomica) NM_000267.3:c.4515-2A>G p.(arg1505serfs*53) 34

Nomenclatura HGVS (www.hgvs.org) Cambiamenti specifici: > indica una sostituzione a livello di DNA (c.76a>t) _ indica un range di residui coinvolti, (c.76_78delact) del indica una delezione (c.76dela) dup indica una duplicazione (c.76dupa) ins indica un inserzione ( c.76_77insg) Per proteina fs indica il frame-shift p.(arg1505serfs*53) 35