RISOLUZIONE OIV/ENO 345/2009 DOSAGGIO DEL GLUTATIONE NEI MOSTI E NEI VINI TRAMITE ELETTROFORESI CAPILLARE L'ASSEMBLEA GENERALE Visto l'articolo 2 paragrafo 2 iv dell accordo del 3 aprile 2001 che ha portato alla creazione dell Organizzazione internazionale della vite e del vino, Su proposta della Sotto-Commissione «Metodi di analisi», DECIDE di integrare l allegato A Raccolta Internazionale dei metodi di analisi con il seguente metodo di tipo IV: Titolo Dosaggio del glutatione nei mosti e nei vini tramite elettroforesi capillare Tipo del metodo IV 1. Campo d applicazione Questo metodo permette il dosaggio del glutatione nei mosti e nei vini in un intervallo di concentrazione da 0 a 40 mg/l. Viene utilizzata l elettroforesi capillare (CE) con la rivelazione in fluorescenza laser-indotta (LIF). 2. Principio Il metodo utilizzato, che procede per elettroforesi capillare è un adattamento di quello messo a punto da Noctor e Foyer (1998) per dosare i tioli non volatili nelle foglie di pioppo tramite HPLC accoppiato ad una rilevazione fluorimetrica. La separazione dei soluti di una miscela tramite elettroforesi capillare è ottenuta tramite migrazione differenziale in un elettrolita. Il capillare è riempito con questo elettrolita. Il campione da separare è iniettato in una delle estremità del capillare. Sotto l azione del campo elettrico generato dagli elettrodi immersi nell elettrolita, i soluti si separano per differenza di velocità di migrazione e sono rilevati in prossimità dell altra estremità del capillare sotto forma di picchi. In condizioni operative determinate, i tempi di migrazione costituiscono un criterio di identificazione delle specie chimiche e la superficie del picco è proporzionale alla quantità iniettata. 1/6
3. Prodotti e reagenti 3.1 Lista dei prodotti e purezza 3.1.1 glutatione (GSH, > 98 %), 3.1.2 ditiotreitolo (DTT, > 99 %), 3.1.3 fosfato di sodio monobasico anidro (NaH 2 PO 4, > 99 %), 3.1.4 fosfato di sodio dibasico anidro (Na 2 HPO 4, > 99 %), 3.1.5 acido 2-(N-cicloesilammino) etanosolfonico (CHES, > 98 %), 3.1.6 monobromobimano (MBB, 97 %), 3.1.7 sale di sodio d acido d'etilenediaminotetraacetico (EDTA, > 99 %), 3.1.8 idrossido di sodio, 3.1.9 acido cloridrico (35 %), 3.1.10 acetonitrile (99,5 %), 3.1.11 acqua ultrapura con resistività 18 M cm. 3.2 Elenco delle soluzioni Ciascuna soluzione è omogeneizzata prima di ogni utilizzo. 3.2.1 Tampone elettroforetico: tampone fosfato, 50 mm, ph 7 Questo tampone è preparato a partire dalle due soluzioni A e B. 3.2.1.1 Soluzione A: 3 mg di fosfato monobasico anidro (3.1.3) ripresi in 250 ml d acqua ultra pura (3.1.11) 3.2.1.2 Soluzione B: 3,55 mg di fosfato dibasico anidro (3.1.4) ripresi in 250 ml d acqua ultra pura (3.1.11) Il tampone fosfato è ottenuto sommando 40 ml della soluzione A (3.2.1.1) e 210 ml della soluzione B (3.2.1.2), portando al volume di 500 ml con acqua ultra pura (3.1.11). Il ph del tampone è quindi portato a 7 mediante acido cloridrico (3.1.9). 3.2.2 Soluzione di monobromobimano (MBB), 50 mm 25 mg di monobromobimano (MBB) (3.1.6) sono ripresi con 1850 µl di acetonitrile (3.1.10). Conservato a - 20 C al riparo dalla luce, il reagente è stabile per tre mesi. 3.2.3 Tampone CHES: 0,5 M, ph 9,3 2,58 mg d'acido 2-(N-cicloesilammino)etanosolfonico (CHES) (3.1.5) sono disciolti in circa 20mL d acqua ultra pura (3.1.11). Il ph del tampone è portato a 9,3 con aggiunta di idrossido di sodio 5 M (3.2.6) poi il volume è portato a 25 ml con acqua ultra pura (3.1.11). Questo tampone è distribuito in provette da 1,5 ml (tipo Eppendorf) in misura di 1 ml per provetta. La soluzione acquosa di CHES, posta a - 20 C, può essere conservata per diversi mesi. 3.2.4 Soluzione di ditiotreitolo (DTT), 10 mm 15,4 mg di ditiotreitolo (3.1.2) vengono disciolti in 10 ml d acqua ultra pura (3.1.11) poi questa soluzione è ditribuita in provette da 1,5 ml (tipo Eppendorf) in misura di 1 ml per provetta. La soluzione acquosa di DTT, posta a - 20 C, può essere conservata per diversi mesi. 3.2.5 Soluzione di idrossido di sodio 0,1 M. 0,4 g di idrossido di sodio (3.1.8) sono messi in una fiala graduata da 100 ml e ripresi con 100 ml d acqua ultra pura (3.1.11). 2/6
3.2.6 Soluzione di idrossido di sodio 5 M. 20 g di idrossido di sodio (3.1.8) sono messi in una fiala graduata da 100 ml e ripresi con 100 ml d acqua ultra pura (3.1.11). 4. Apparecchiatura 4.1 L elettroforesi capillare L elettroforesi capillare dotata di un iniettore di tipo idrostatico con la rivelazione in fluorescenza laser-indotta con una lunghezza d onda di eccitazione prossima alla lunghezza d onda di assorbimento dell addotto MBB-GSH: es.= 390 nm (per esempio, rivelatore Zetalif). 4.2 Il capillare La lunghezza totale del capillare in silicio non inserito è di 120 cm, la lunghezza efficace è di 105 cm, il diametro interno è di 30 µm. 5. Preparazione dei campioni Il metodo di dosaggio utilizzato si avvale della derivazione delle funzioni SH tramite il monobromobimano (MBB) (Radkowsky e Kosower, 1986). I campioni di mosti o di vini secchi sono chiarificati tramite centrifugazione prima di essere analizzati. I vini in bottiglia sono analizzati senza chiarifica preliminare. Preparazione dei campioni: In una provetta da 1,5 ml (tipo Eppendorf) mettere in successione: - 200 µl di campione, - 10 µl della soluzione di DTT (3.2.4); concentrazione finale 0,25 mm. - 145 µl di CHES (3.2.3); concentrazione finale 179 mm. - 50 µl di MBB (3.2.2); concentrazione finale 6,2 mm. Dopo agitazione della miscela reagente, la derivazione delle funzioni tioli tramite il MBB richiede 20 min di incubazione al riparo dalla luce e a temperatura ambiente. In queste condizioni analitiche, i derivati MBB-SR così formati sono poco stabili; il dosaggio tramite CE-LIF deve essere effettuato immediatamente dopo il periodo di incubazione. 6. Modo operativo 6.1 Condizionamento del capillare Prima del suo primo utilizzo e quando i tempi di migrazione aumentano, il capillare (4.2) deve essere condizionato nel seguente modo: 6.1.1. risciacquo con idrossido di sodio 0,1 M (3.2.5) per 3 min, 6.1.2. risciacquo con acqua ultra pura (3.1.12) per 3 min, 6.1.3. risciacquo con tampone fosfato elettroforetico ( 3.2.1) per 3 min. 6.2 Condizioni di migrazione 6.2.1 L iniezione del campione è di tipo idrostatico; 3 s a 5 kpa. È seguita da un iniezione di tampone elettroforetico (3.2.1) 50 mb al fine di migliorare la risoluzione dei picchi. 3/6
6.2.2 Analisi La tensione di + 30 kv, applicata per tutta la durata della separazione, genera una corrente di 47 µa. Queste condizioni sono raggiunte in 20 s. La separazione è effettuata a una temperatura costante di 21 C. 6.2.3 Risciacquo del capillare Il capillare deve essere lavato dopo ogni analisi in successione con: - idrossido di sodio 0,1 M (3.2.5) per 3 min, - acqua ultra pura (3.1.12) per 3 min, - tampone fosfato elettroforetico (3.2.1) per 3 min. 7. Risultati Alla concentrazione finale utilizzata nel campione, la presenza di DTT durante la derivazione permette di stabilizzare le funzioni tioli instabili con ph alcalino e molto facilmente ossidabili dai chinoni, prodotti dall auto-ossidazione dei composti fenolici, ma non rompe i ponti disolfuri. In effetti, in queste condizioni analitiche, il tenore di glutatione ridotto (GSH) rilevato in un vino addizionato o meno con glutatione ossidato (GSSG) nella misura di 10 mg/l è strettamente comparabile (figura 1). Questo metodo permette quindi di dosare il glutatione nella sua sola forma ridotta. testimone testimone GSSG Figura 1: Messa in evidenza della stabilità dei ponti disolfuri nelle condizioni di derivazione descritte. (DTT, 0,25 mm finale). La figura 2 presenta il profilo elettroforetico di un campione di mosto di uva bianca, vitigno Sauvignon, nel quale sono identificate la cisteina, il glutatione, la N-acetil-cisteina e il biossido di zolfo. Il primo picco corrisponde ai reagenti in eccesso (DTT, MBB). La separazione dei tioli non volatili viene effettuata in meno di 20 minuti. Tra tutti i picchi, solo alcuni hanno potuto essere identificati (figura 2A) (Newton et al., 1981). Questi tioli, eccetto il biossido di zolfo, sono generalmente presenti in quantità variabili nelle bacche di uva (Cheynier et al., 1989), nei frutti e nei legumi (Mills et al., 2000). 4/6
Figura 2: Esempio di separazione dei tioli non volatili identificati in una soluzione HCl/EDTA (A) e in un mosto d uva (B) 1: DTT; 2: omocisteina; 3 : cisteina; 4: Cys-Gly; 5: GSH; 6: g Glu-Cys;,7: NAC; 8: SO 2. In queste condizioni analitiche, i tempi di ritenzione degli addotti MBB-RS sono i seguenti: MBBomocisteina 10,40 min; MBB-cisteina 10,65 min, MBB-GSH 14,14 min; MBB-NAC 15,41min; MBB-SO 2 18,58min. 8. Caratteristiche del metodo Sono stati determinati alcuni elementi interni di validazione, ma non si tratta di una validazione formale secondo il protocollo per la pianificazione, la conduzione e l interpretazione di studi di validazione interlaboratorio (OIV 6/2000) Il vino è utilizzato come matrice per realizzare le curve di calibrazione i test di ripetibilità di ogni composto. Ogni concentrazione è calcolata a partire dalla media di tre determinazioni ottenute utilizzando la retta di regressione della curva di calibrazione. I risultati sono espressi in mg/l. Le regressioni lineari e i coefficienti di correlazione sono calcolati secondo il metodo dei minimi quadrati. Le soluzioni madri dei differenti tioli sono realizzate a partire da una soluzione di HCl/EDTA che permette di conservarli senza perdite per diversi giorni a +6 C. Diluzioni successive di queste soluzioni permettono di stimare il limite di rilevazione (LOD) nel vino, per un rapporto segnale/rumore superiore o uguale a tre. L'intervallo di linearità è vario per ciascun tiolo (Tabella 1). 5/6
Tabella 1: intervallo di linearità, parametri delle regressioni lineari proprie di ciascun tiolo in soluzioni preparate in modo identico a quella del glutatione. Intervallo di linearità Regressione lineare Coefficiente di correlazione Omocisteina 0-15 mg/l Y= 0.459X 0.231 0,9987 Cisteina 0-15 mg/l Y = 0.374X 0.131 0,9979 Glutatione 0-40 mg/l Y = 0.583X 0.948 0,9966 N-acetil-cisteina 0-10 mg/l Y = 0.256X 0.085 0,9982 Le condizioni di analisi permettono di eliminare le interferenze provocate dai prodotti d idrolisi del MBB, contrariamente a quanto segnalato in altri lavori (Ivanov et al., 2000). La ripetibilità del metodo è calcolata a partire da dieci analisi di uno stesso campione di vino. Per una concentrazione in tioli di 10 mg/l, il coefficiente di variazione è del 6,0 % per il glutatione; esso è d altronde del 3,2 % per l omocisteina, 4,8 % per la cisteina, e 6,4 % per la N-acetilcisteina. Il limite di rilevazione (LOD) del glutationeè di 20 µg/l, il limite di quantificazione (LOQ) è di 60 µg/l. 9. BIBLIOGRAFIA Noctor, G. e C. Foyer, 1998. Simultaneous measurement of foliar glutathione, gammaglutamylcysteine, and amino acids by high-performance liquid chromatography: comparison with two other assay methods for glutathione, Analytical Biochemistry, 264, 98-110. Kosower, N.S., Kosower E. M., Newton G. L.,e Ranney H. M., 1979. Bimane fluorescent labels: Labeling of normal human red cells under physiological conditions. Proc. Natl. Acad. Sci., 76 (7), 3382-3386. Newton, G.L., R. Dorian, e R.C. Fahey, Analysis of biological thiols: derivatisation with monobromobimane and separation by reverse-phase high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem., 1981. 114: p. 383-387. Cheynier, V., J.M. Souquet, e M. Moutounet, 1989. Glutathione content and glutathione to hydroxycinnamique acid ration in Vitis vinifera grapes and musts. Am. J. Enol. Vitic,. 40 (4), 320-324. Mills, B.J., Stinson C. T., Liu M. C. e Lang C. A., 1997. Glutathione and cyst(e)ine profiles of vegetables using high performance liquid chromatography with dual electrochemical detection. Journal of food composition and analysis, 10, 90-101. Ivanov, A.R., I.V. Nazimov, e L. Baratova, 2000. Determination of biologically active low molecular mass thiols in human blood. Journal of Chromatogr. A,. 895, 167-171. 6/6