Diversità delle proteine Le possibilità teoriche di un polipeptide sono illimitate. Per una proteina di n residui, esistono 20 n sequenze possibili. Ubiquitina Proteina di 76 aa 20 76 =??? DIMENSIONI Minimo: almeno 40 residui (<40 peptide). Tale limite sembra costituire la dimensione minima per ripiegarsi in una forma stabile e specifica, quindi per avere una funzione!!! Massimo: TITINA (269326 residui, 2990 kda). Il limite massimo potrebbe essere imposto dall efficienza del macchinario della sintesi proteica. Più grande è la proteina maggiore è la probabilità di introdurre errori durante la trascrizione e traduzione. COMPOSIZIONE Gli amminoacidi non sono presenti nelle proteine tutti con la stessa frequenza: Abbondanti: Leu, Ala, Gly, Ser, Val, Glu rari: Trp, Cys, Met, His Ogni amminoacido ha specifiche proprietà chimiche e fisiche, quindi la sua presenza in una particolare regione influenza la struttura tridimensionale e le proprietà della proteina. Le caratteristiche di una proteina non dipendono solamente dalla composizione degli amminoacidi, ma in particolare modo dalla loro sequenza.
Studio della concentrazione e funzione delle proteine 1. Estrazione delle proteine. Consiste nel fare uscire la proteina dalla cellula e ottenerla in soluzione. Le cellule devono essere rotte e il contenuto proteico rilasciato in una soluzione chiamata crude extract. Le cellule vengono sottoposte a condizioni stressanti (alte pressioni, cicli di cong/scong, utilizzo di detergenti, sonicazione). 2. Stabilizzazione della proteina. Una volta rimossa dalla cellula, la proteina si ritrova in condizioni non ottimali per la sua stabilità e funzionalità, quindi bisogna intervenire per ridurre le condizioni e/o gli agenti che possono danneggiarla irreversibilmente. 3. Separazione della proteina. Gli estratti cellulari sono poi sottoposti ad una varietà di metodiche per separare la proteina di interesse dal resto della miscela.
Preparazione dei lisati cellulari Le cellule vengono rotte e il contenuto proteico rilasciato in un lisato. Le metodiche variano in base: capacita di adesione delle cellule (aderenti o in sospensione) localizzazione della proteina che si vuole separare (citosolica e/o nucleare) cellule aderenti: lavare le cellule sulla petri o fiasca con ice-cold PBS, eliminare PBS. Aggiungere ice-cold lysis buffer alle cellule (1 ml per 107 cells/100 mm dish/150 cm2 flask; 0.5 ml per 5 x 106 cells/60 mm dish/75 cm2 flask). Le cellule vengono staccate dalla petri o fiasca usando cell scraper. cellule in sospensione: lavare le cellule con PBS centrifugando a 1500 rpm per 5 minuti a 4C per pellettare le cellule. Risospendere il pellet cellulare in ice-cold lysis buffer (1 ml per 107 cells). Trasferire la sospensione cellulare in eppendorf. Agitare la sospensione su ruota o orbital shaker per 10 minuti a 4C per lisare le cellule. Centrifigure il lisato a 12,000 rpm per 15 minuti a 4C. Recuperare il surnatante: estratti cellulari totali.
Preparazione dei lisati cellulari Le cellule vengono rotte e il contenuto proteico rilasciato in un lisato. Le metodiche variano in base capacita di adesione delle cellule (aderenti o in sospensione) localizzazione della proteina che si vuole separare (citosolica e/o nucleare) Localizzazione della proteina: Variando la composizione dei tamponi utilizzati per lisare le cellule si possono effettuare, oltre ai lisati totali, anche lisati citosolici: contengono solamente le proteine presenti nel citosol, permettono quindi di eliminare quelle nucleari. Sfruttano la presenza di detergenti. lisati nucleari: contengono solamente le proteine presenti nel nucleo, permettono quindi di eliminare quelle citosoliche. Sfruttano concentrazioni saline in grado di aprire i pori nucleari. 1 2 3 nucleolin actin 1. Estratti totali 2. Estratti citosolici 3. Estratti nucleari
Stabilizzazione delle proteine Enzimi digestivi: nel distruggere tessuti e/o cellule, vengono rilasciati anche enzimi digestivi come nucleasi e proteasi. Proteasi: Scindono i legami peptidici delle proteine cocktail inibitori delle proteasi ph: le sostanze organiche sono generalmente stabili in soluzioni tampone intorno alla neutralità. alterato ph Denaturazione (modificazione struttura tridimensionale) Temperatura: la stabilità termica delle proteine è molto variabile SUGGERIMENTO: purificare la proteina alla temperatura di 0-4 C Conservazione: congelare gli estratti cellulari a -20 C o -80 C
Separazione delle proteine Separazione del bene dal male Per lo studio della proteina di interesse è essenziale ottenerne una preparazione pura. Scopo: eliminare tutti gli altri componenti della miscela facendo rimanere solo la proteina di interesse. I metodi per separare le proteine sfruttano le seguenti caratteristiche chimico-fisiche: carica dimensioni solubilità affinità di legame con altre molecole Purezza: viene indicata dimostrando con tutti i metodi analitici disponibili che la sostanza è costituita da un solo componente (gli standard sono continuamente rivisti). Grado di purezza Molto alto >99% Alto 95-99% Moderato <95% utilizzo uso terapeutico, studi in vivo cristallografia, caratterizzazione chimico-fisica antigene per anticorpo, sequenziamento N-terminale
Tecniche di separazione: fractional precipitation Sfrutta la solubilità delle proteine. La solubilità di una proteina dipende da: concentrazione di sali disciolti, polarità del solvente, ph, temperatura. Tutte queste variabili possono essere modificate per precipitare in modo selettivo le proteine di interesse, lasciando le altre in soluzione. Salting out: processo che diminuisce la solubilità delle proteine grazie all aggiunta di determinate concentrazioni di sale. Principio: 1. gli ioni di sale aggiunto competono con gli ioni presenti nella soluzione per le molecole di solvente, facilitando l aggregazione proteica; 2. Proteine diverse precipitano a diverse concentrazioni di sale. Ammonio solfato (NH 4 ) 2 SO 4 : è il reagente comunemente usato per il salting out. ha elevata solubilità in acqua, permettendo di ottenere soluzioni ad alta forza ionica; il ph della soluzione può essere variato, portandolo vicino al pi della proteina da purificare.
Tecniche di separazione: Cromatografia Principi: La cromatografia permette di separare molecole in base ad una proprietà chimica come la massa molecolare, la carica, o la solubilità. Usa una fase stazionaria e una fase mobile, liquida o gassosa. Il campione (miscela complessa di proteine) passa attraverso la fase stazionaria per mezzo del flusso della fase mobile. Molecole con proprietà diverse si ripartiscono in modo diverso tra la fase mobile e quella stazionaria, quindi si separano: Molecole fortemente attratte dalla fase stazionaria vengono ritardate o trattenute rispetto a quelle che non hanno una attrazione forte. Tipi di cromatografia I metodi cromatografici utilizzati nella purificazione delle proteine vengono classificati in base alla natura delle interazioni che si instaurano tra la proteina e la fase stazionaria. Filtrazione su gel. Affinità. Scambio ionico.
Filtrazione su gel Le molecole vengono separate in base alle loro dimensioni e forma. Raggio di Stokes: raggio che possiede una molecola se gira su se stessa in soluzione. A parità di massa molecolare, molecole estese hanno un raggio di Stokes maggiore rispetto a molecole compatte. Fase stazionaria: piccoli granuli con pori di dimensione controllata. Le dimensioni dei pori dipendono dal numero di legami trasversali presenti nel materiale della matrice. Materiali utilizzati: Oligosaccaridi acrilamidi Range: 10 2-10 6 Da Le molecole più grandi, avendo accesso a pochi pori, sono eluite prima di quelle con minor massa molecolare. NB: le proprietà chimiche-fisiche delle due fasi vengono scelte in modo da impedire l interazione tra proteine e granuli dovute a proprietà diverse dalle dimensioni molecolari.
Cromatografia a scambio ionico Sfrutta le interazione elettrostatiche tra i gruppi carichi della proteina e le molecole con cariche opposte sulla matrice della fase stazionaria. E limitata alla purificazione di molecole ionizzabili Fase stazionaria: contiene gruppi ionizzabili accoppiati ad una matrice inerte. Le resine a base di cellulosa o di agarosio sono tra le più usate come matrici. Questi gruppi sono associati con controioni della soluzione. Le molecole da purificare competono con i controioni per il legame ai gruppi carichi della fase stazionaria, e vengono quindi ritardate in base alla loro carica. Scambio anionico: fase stazionaria con carica positiva (gruppo dietilamminoetilico, DEAE) Scambio cationico: fase stazionaria con carica negativa (gruppo carbossimetilico, CM)
Le molecole vengono ritardate in base alla carica netta che possiedono al ph della soluzione. Eluizione: L eluizione avviene aumentando la concentrazione del controione, o variando il ph. Na, H: controioni usati per lo scambio cationico. Cl-, OH-: controioni usati per lo scambio anionico
Cromatografia per affinità Sfrutta le interazione altamente specifiche di una proteina con altre proteine o con piccoli substrati. Coinvolge diverse interazioni, come legami idrogeno e interazioni idrofobiche. Fase stazionaria: un ligando, molecola che si lega con alta specificità alla proteina di interesse, viene legato covalentemente alla matrice inerte (agarosio, destrano, poliacrilamide). Braccio spaziatore: facilita le interazioni tra il ligando e la proteina bersaglio. Ligando: affinità elevata per catturare la proteina di interesse, ma non così alta da impedire il suo distacco senza denaturazione. Eluizione: la proteina viene recuperata favorendo il suo distacco dal ligando: soluzione ad alta concentrazione di ligando libero soluzione con ph o forza ionica diversi. La selettività della cromatografia di affinità è potenzialmente la più alta delle altre forme di cromatografia
Immunoprecipitazione Sfrutta l alta affinità del legame tra l anticorpo e la proteina contro cui è stato prodotto. La specificita e l affinita degli anticorpi per i loro antigeni dipendono da una straordinaria complementarita strutturale tra le due molecole. L associazione tra anticorpo ed antigene coinvolge diverse interazioni: Van der Waals Idrofobiche Legami idrogeno E costituita dalle seguenti fasi: preparazione lisati cellulari; pre-clear; formazione del complesso antigene di interesse/anticorpo; cattura del complesso antigene/anticorpo tramite prot A o prot G; recupero della proteina di interesse.
1. preparazione dei lisati cellulari L immunoprecipitazione può essere eseguita su lisati cellulari preparati in due condizioni: Condizioni denaturanti. Lavare le cellule con 1X PBS (1300 rpm 8 min 4 C); Lisare le cellule con 1 ml boiling lysis buffer (1% SDS, 2 mm sodium ortho-vanadate, 10mM Tris ph 7.4). Spipettare bene in ghiaccio, poi bollire per 5 min. Filtrare diverse volte con ago da 22. Centrifugare 12,000 rpm 10 min 4 C. Il surnatante è il " denatured total cell lysate". Condizioni native. Lavare le cellule con 1X PBS (1300 rpm 8 min 4 C); Lisare le cellule con 1 ml cold RIPA buffer. Mantere in costante agitazione per 10 minuti at 4 C. Centrifugare 12,000 rpm 10 min 4 C. Il surnatante è il " native total cell lysate". RIPA buffer, miscelazione in ghiaccio PBS 1x, 1300 rpm, 8 min, 4 C 10 min, 4 C su ruota, 12000 rpm, 10 min, 4 C
2. pre-clear Aggiungendo proteina A di Staphilococcus (o proteina G di Streptococcus) immobilizzata su un supporto solido (agarosio), è possibile rimuovere dal campione proteine che si legano in modo non specifico, quindi ridurre il background. Possono essere proteine con elevata affinità sia per l agarosio che per la proteina A. 2. Pre-clear Il total cell lysate è incubato con 20 ul di proteina A-agarose beads per 30 min a 4 C in costante agitazione, poi centrifugato a 2500 rpm per 30 sec a 4 C. Il surnatante viene raccolto, diluito 1:10 con dh 2 O ed utilizzato per determinare la concentrazione proteica tramite dosaggio Bradford. Prot A Surnatante + proteina A-agarose beads, 30 min, 4 C 2500 rpm, 30 sec, 4 C
3. formazione del complesso antigene/anticorpo aggiungere l anticorpo specifico per la proteina che si vuole immunoprecipitare. La concentrazione ottimale deve essere determinata empiricamente per ogni modello cellulare e per ogni diversa proteina. agitare 2h - o/n 4 C anti-stat1 rabbit polyclonal
4. cattura dell immuno-complesso aggiungere 20 ul di proteina A-coniugata all agaroso incubare 2h - o/n 4 C Prot A STAT1 Immunoclomplessi + proteina A-agarose beads, 2 h, 4 C 2500 rpm, 30 sec, 4 C
5. Recupero della proteina di interesse l immuno-complesso viene recuperato grazie a pulse centrifugation, e lavato 2-3 volte con RIPA o PBS il pellet è risospeso in 50 ul SB 2x, bollito 3-5 minuti per dissociare l immunocomplesso dalle biglie. Eseguire SDS-PAGE e WB, oppure conservare a -20 C. PBS 1x, 2500 rpm, 30 sec, 4 C Pellet in SB 2x, bollito per 3-5 min
Immunoprecipitazione: prot A o prot G? Le proteine A e G si legano al frammento Fc delle catene H delle immunoglobuline, ma non di tutte le classi di anticorpi. Binding Characteristics of Some Immunoglobulins Immunoglobulin Protein A Protein G Mouse IgG1 + ++ IgG2a +++ +++ IgG2b ++ ++ IgG3 + +++ IgM - - IgA - - IgE - - Rat IgG1 + + IgG2a - +++ IgG2b - ++ IgG2c + ++ Human IgG1 +++ +++ IgG2 +++ +++ IgG3 - +++ IgG4 +++ +++
TAMPONI NECESSARI Radioimmunoprecipitation (RIPA) buffer: 50 mm Tris-HCl, ph 7.4 (buffer, previene denaturazione delle proteine) 150 mm NaCl (previene l aggregazione proteica non specifica) 1% NP-40 (detergente non ionico per estrarre le proteine; 10% stock solution in H 2 O) Inibitori delle proteasi: 2 mm EDTA (chelante del calcio, 100 mm stock solution in H 2 O, ph 7.4) 2 mm PMSF (200 mm stock solution in isopropanolo, conservare a RT) 5 ug/ml leupeptin (conservare -20 in aliquote, 5 mg/ml in H 2 O) 5 ug/ml pepstatin (conservare -20 in aliquote, 5 mg/ml in etanolo) Inibitori delle fosfatasi: 2 mm Na 3 VO 4 ; 2 mm NaF PBS 1X: 0.9% NaCl (9 g/l) 5 mm tampone fosfato ph 7.4 SB 2X (100 ml): 1.51 g Tris, ph 6.8 4 g SDS 19.82 ml glicerolo (25 gr glicerina) Aggiungere 20 ul MSH/ml SB prima dell uso 1-2 mg Bromophenol Blue
STAT1 Numerose citochine, ormoni e fattori di crescita utilizzano la via di segnalazione JAK-STAT per controllare una grande varietà di risposte biologiche (sviluppo, differenziamento, proliferazione cellulare). Questa via di segnalazione intracellulare è stata scoperta in studi sugli effetti degli interferoni (IFN). STAT: Signal Transducer and Activator of Transcription. JAK: Janus Kinase.
Assemblamento del recettore di IFN-γ JAK-STAT STAT1 STAT2 STAT3 STAT4 Citochine IFN-α/β, IFN-γ IFN-α/β IL-6, IL-10 IL-12 Attivazione di JAK STAT5a Prolattina STAT5b Ormone crescita della STAT5a e STAT5b IL-2, IL-7, IL-9 Legame di Stat1 e fosforilazione di residui di tirosina STAT6 IL-4 Dimerizzazione di Stat1 JAK1 IFN-α/β, IFN-γ, Completa attivazione di Stat1 tramite fosforilazione di rsidui di serina JAK2 IL-2, IL-4, IL-6 Epo, IL-3, IFN-γ JAK3 IL-7, IL-2, IL-4 Tyk2 IFN-α/β, IFN-γ Specifica trascrizione genica IL-10
STAT1 PATHWAY