Cromatografia liquida ad alta performance (HPLC)

Cromatografia liquida ad alta performance (HPLC) La cromatografia in fase liquida viene utilizzata per la separazione di miscele complesse di molecole e/o biomolecole. Riducendo il diametro delle particelle della fase stazionaria, l efficienza della separazione aumenta notevolmente. Dei vari tipi di cromatografia, quella a fase inversa (utilizzando fase stazionaria C 18 ) è di gran lunga la più utilizzata in LC-MS. Nella cromatografia a fase inversa, l analita si lega alla fase stazionaria mediante interazione tra le sue porzioni apolari e le catene C 18. L eluizione avviene con un gradiente di solvente organico (in genere acetonitrile o metanolo) Bio-MS lezione 3 1

Cromatografia liquida ad alta performance (HPLC) Cromatografia a scambio ionico (IEX) Porzioni cariche della molecola interagiscono con la fase stazionaria carica di segno opposto Cromatografia a fase inversa (RP) Porzioni apolari della molecola interagiscono con la fase stazionaria apolare Bio-MS lezione 3 2

HPLC-ESI-MS Miscele di analiti molto complesse non possono essere analizzate direttamente mediante spettrometria di massa. Tali miscele sono analizzate in maniera piu efficace tramite cromatografia liquida HPLC interfacciata alla spettrometria di massa (LC-MS). L interfaccia tra LC e MS è una sorgente di ionizzazione soft, molto spesso ESI (la più utilizzata) o APCI. Bio-MS lezione 3 3

HPLC-ESI-MS Fase mobile Campione Colonna HPLC ESI Spettrometro di massa Bio-MS lezione 3 4

LC-MS Dogma in LC- MS Mai usare additivi non volatili nelle fasi mobili (ad esempio, Sali di sodio, tamponi fosfato, SDS, etc.) Se necessario, utilizzare tamponi volatili alla concentrazione più bassa possibile (esempio, acetato di ammonio a concentrazione inferiore a 10 mm). Bio-MS lezione 3 5

Strategie in LC-MS: ionizzazione Per sviluppare un metodo LC-MS appropriato per un determinato analita, è fondamentale individuare sia le fasi mobili ottimali per la separazione cromatografica, sia la modalità di ionizzazione più sensibile (ESI+, ESI-, APCI+, APCI-) Fasi mobili Come solventi vengono in genere utilizzati: Acqua Acetonitrile Metanolo Isopropanolo Ed in misura minore: Diclorometano THF Tamponi/additivi Tamponi e additivi devono essere volatili e a bassa concentrazione (minore di 10-20 mm). I più utilizzati sono: Acetato di ammonio Formiato di ammonio Acido acetico, acido formico Bio-MS lezione 3 Trietilammina. 6

Strategie in LC-MS: ESI o APCI? ESI: Copre una gamma più vasta di molecole. Per questa ragione viene utilizzato più frequentemente (e a volte anche abusato). Per la ionizzazione positiva è preferibile aggiungere un acido diluito alla fase mobile (acido formico o acetico in concentrazione 0.1%). E adatto per analiti termolabili e polari. APCI: E adatto a molecole mediamente polari (contenenti ad esempio sia porzioni apolari che gruppi funzionali polari). In caso di performance simili a ESI in termini di ionizzazione, è da preferirsi in quanto è un interfaccia più robusta. Bio-MS lezione 3 7

Strategie in LC-MS: esempi ESI+ ESI- APCI+ APCI- Progesterone (Mw 314) Colina (Mw 104) ATP (Mw 507) Tetraciclina (Mw 444) Clenbuterolo (Mw 276) Bio-MS lezione 3 8

Strategie in LC-MS: ESI o APCI? Le varie modalità di ionizzazione vengono testate mediante infusione diretta di una soluzione diluita del campione (10 ug/ml) Siringa ESI Fasi mobili Spettrometro di massa Ionizzazione positiva: 50% MeOH, 0.1% HCOOH Ionizzazione negativa: 50% MeOH 10 mm acetato di ammonio Bio-MS lezione 3 9

Strategie in LC-MS: progesterone Nessun segnale in ionizzazione negativa. Meglio APCI+ [M+H] + [M+H] + ESI+ APCI+ Bio-MS lezione 3 10

Strategie in LC-MS: colina Nessun segnale in ionizzazione negativa e APCI+. Unica possibilità: ESI+ [M] + ESI+ Bio-MS lezione 3 11

Strategie in LC-MS: ATP Nessun segnale in ionizzazione positiva e APCI-. Unica possibilità: ESI- ESI- [M-H] - Bio-MS lezione 3 12

Strategie in LC-MS: tetraciclina [M+H] + [M-H] - [M+H] + [M-H] - ESI+ ESI- APCI+ APCI- Ionizzazione efficace in tutte le modalità. APCI+ sembra essere la migliore, sia per la presenza del solo picco molecolare, sia per intensità del segnale e rapporto segnale/rumore (S/N) Bio-MS lezione 3 13

Strategie in LC-MS: clenbuterolo [M+H] + [M+H] + ESI+ APCI+ Nessun segnale in ionizzazione negativa. Meglio APCI+ Bio-MS lezione 3 14

Strategie in LC-MS: esempi ESI+ ESI- APCI+ APCI- Progesterone + ++ Colina ++ ATP + Tetraciclina + + ++ ++ Clenbuterolo ++ ++ Bio-MS lezione 3 15

LC-MS/MS: product ion scan 140 380 Esempio: product of m/z 504 Intensità 200 504 Total ion chromatogram (TIC) Tempo (cromatografico) Bio-MS lezione 3 16 m/z Analisi strutturale LC-MS di un composto incognito a m/ z 504

Scansioni in TQ: selective reaction monitoring (SRM) Q1 Q2 Q3 Selezione Frammentazione Scansione In SRM; Q3 è dedicato a monitorare solo pochi ioni ad un preciso m/z (2 o 3 frammenti del precursore, in genere). E la modalità più sensibile con la quale utilizzare un TQ. Viene spesso utilizzata per analisi di componenti in tracce e per bioanalisi. La modalità SRM è molto sensibile perché causa un notevole aumento del rapporto segnale/rumore (aumento della sensibilità fino a 100 volte) Bio-MS lezione 3 17

LC-MS/MS: SRM Esempio: analita a m/z 504 monitorato mediante SRM (504à140, 504à380) Intensità 140 200 380 504 Total ion chromatogram (TIC) m/z Il valore dell ascissa, in questo caso, è solo dato dalla somma delle intensità degli ioni a 140 e 380 Tempo (cromatografico) Bio-MS lezione 3 18

LC-MS/MS: SRM Q1 Q2 Q3 504 140, 380 SIM 504 SRM 504 à 380, 504à 140 Nel cromatogramma superiore, è riportato il segnale registrato dallo spettrometro in modalità SIM (m/z 504) Nel cromatogramma inferiore, lo stesso campione è analizzato in modalità SRM. L analisi è più selettiva (viene rilevato solo il picco di interesse), ed aumenta notevolmente il rapporto segnale/rumore, pur diminuendo l intensità assoluta del segnale. Bio-MS lezione 3 19