NOVA Gel TM SS-A/SS-B T 708455 Per uso diagnostico In Vitro

NOVA Gel TM SS-A/SS-B T 708455 Per uso diagnostico In Vitro Finalità d uso Il NOVA Gel TM SS-A/SS-B è un sistema di analisi a doppia diffusione per la titolazione e la determinazione semi-quantitativa nel siero umano di autoanticorpi contro l SS-A/SS-B, un antigene nucleare estraibile (ENA). La presenza di anticorpi verso l SS-A/SS-B può essere utilizzata, assieme ad altre analisi sierologiche e ai riscontri clinici, come ausilio nella diagnosi di lupus eritematoso sistemico (LES) e di altre patologie a carico del tessuto connettivo, come la Sindrome di Sjogrens. Riassunto e Spiegazione del test La definizione anticorpi antinucleo (ANA) descrive una varietà di autoanticorpi che reagisce con costituenti dei nuclei delle cellule come il DNA, l RNA e diverse proteine e ribonucleoproteine. 1 Questi autoanticorpi si riscontrano con frequenza elevata in pazienti affetti da malattie reumatiche o del tessuto connettivo, soprattutto nel LES. Praticamente tutti i pazienti affetti da LES sono positivi agli ANA. Questa sensibilità diagnostica ha portato ad includere l analisi degli ANA nella revisione del 1982 dei criteri per la classificazione del lupus eritematoso sistemico compilata da un sottocomitato della Arthritis and Rheumatism Association (associazione per patologie artritiche e reumatiche). 2 Malgrado l analisi degli ANA sia un test di screening eccellente per il LES (un risultato negativo esclude praticamente il LES in fase attiva 3 ) non è affatto un test specifico. La tendenza attuale nella diagnosi e nella gestione delle malattie del tessuto connettivo è di abbinare un test iniziale di screening sensibile agli ANA a test di follow-up più specifici come il dsdna e/o gli ENA. I test ENA sono particolarmente importanti perché forniscono sia informazioni diagnostiche che prognostiche. Gli autoanticorpi verso gli SS-A si riscontrano nel 40-50% dei pazienti affetti dalla sindrome di Sjogren e nel 25% dei pazienti affetti da LES ANA positivi. 4,5 Gli anticorpi verso gli SS-B si riscontrano nel 23% dei pazienti affetti dalla sindrome di Sjogren e nel 5-10% dei pazienti affetti da LES. 4,5 Gli anticorpi SS-A ed SS-B sono stati riscontrati in alcuni pazienti con manifestazioni cliniche del LES, fra cui manifestazioni cutanee importanti, ma con negatività agli ANA, specialmente quando sono state utilizzate come substrato sezioni di roditori. 6,7 Gli anticorpi contro gli SS-A e gli SS-B sono fortemente associati al LES neonatale ed al blocco cardiaco congenito. 5,8 Diversi studi suggeriscono di utilizzare gli anticorpi SS-B come marker sierologico per il complesso SS-sicca, dato che gli anticorpi SS-B si riscontrano in circa il 60% di questi pazienti. 9,10 Principio della Metodica Il test a doppia diffusione, descritto da Ouchterlony, 11 consente la diffusione passiva di una soluzione di antigene attraverso una matrice di supporto in forma di gel verso il campione del paziente e/o un controllo contenente l anticorpo. Dei pozzetti di forma speciale perforati nella matrice gelatinosa fungono da serbatoi dai quali le soluzioni di antigene e di anticorpo diffondono l una verso l altra. Nel punto di equivalenza antigene/anticorpo si forma una linea di precipitina visibile nel gel. Lo stato immunologico del paziente può essere quindi determinato osservando i pattern di linee di precipitina adiacenti che si sono formate nel gel e tramite un campione di controllo di specificità conosciuta e del siero del paziente sconosciuto. La tecnica a doppia diffusione può essere utilizzata con una preparazione purificata di SS-A/SS-B, un controllo con quantità conosciuta di autoanticorpi anti-ss-b o SS-A e del siero del paziente che si sospetta contenga autoanticorpi SS-B e/o SS-A per mostrare identità o non identità immunologica. La conferma dell attività autoanticorpale SS-B e/o SS-A nel siero del paziente può essere data se la relativa linea di precipitina si fonde in maniera caratteristica con la linea formata da un campione di controllo conosciuto. In certi casi si desidera una determinazione semi-quantitativa della quantità degli autoanticorpi SS-A e/o SS- B presenti nel siero del paziente. In questi casi la piastra NOVA Gel a T può essere utilizzata per analizzare un campione del siero del paziente diluito in maniera seriale. Il reciproco della diluizione maggiore che forma una linea di precipitina rappresenta il titolo di autoanticorpo SS-A e/o SS-B per quel paziente. La procedura corretta del test a doppia diffusione richiede la prova con vari rapporti di concentrazione antigene-anticorpo per evitare un eccesso di antigene o di anticorpo. Infatti si possono formare delle linee di precipitina scorrette o fuorvianti se esiste un eccesso di antigene o di anticorpo. Per evitare che ciò accada si dovrebbero testare diverse diluizioni del siero del paziente contro la stessa preparazione di antigeni. Ciò si ottiene 1

simultaneamente durante la titolazione del campione del paziente con la piastra NOVA Gel T. Reagenti 1. Piastre in gel per la titolazione Nova Gel a T, 7 pozzetti ciascuna, contenenti stabilizzatori e azoturo di sodio allo 0,09% 2. 0,4 ml antigene SS-A/SS-B (da timo di vitello), liofilizzato in tampone contenente stabilizzatori ed azoturo di sodio allo 0,09% 3. 0,7 ml controllo SS-B, siero umano contenente autoanticorpi verso SS-B in tampone contenente azoturo di sodio allo 0,09% 4. 0,7 ml controllo SS-A, siero umano contenente autoanticorpi verso SS-A in tampone contenente azoturo di sodio allo 0,09% Avvertenze 1. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-hiv, per HbsAg e per anticorpi anti- HCV mediante metodi approvati dall FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Controlli SM ed SS-A devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi. 12 2. La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi. 3. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti. 4. I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica. Precauzioni 1. Questo prodotto è stato messo a punto per l uso diagnostico In Vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili. 3. Si raccomanda di utilizzare acqua sterile distillata o deionizzata per reidratare l antigene. 4. La performance dell analisi è influenzata da una varietà di fattori. Questi includono la temperatura iniziale dei reagenti, l eventuale trabocco dai pozzetti dei reagenti o dei campioni da analizzare e la qualità dell acqua utilizzata per reidratare l antigene. È necessario prestare attenzione alla coerenza per ottenere risultati accurati e riproducibili. 5. Si raccomanda di attenersi strettamente al protocollo. Condizioni di conservazione Conservare tutti i reagenti a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e maneggiati conformemente alle istruzioni. Una volta reidratato, l antigene è stabile per 2 settimane a 2-8 C. Se si desidera si possono preparare aliquote di antigene di 100 μl e conservarle a <- 70 o C. L antigene conservato in questo modo è stabile per almeno un anno. Raccolta dei campioni Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L aggiunta al campione di sodio azide o di altri conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica, trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l uso di sieri fortemente emolizzati o lipemici. Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A2 dell NCCLS raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a temperatura ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in frigorifero a 2-8 C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni, congelare a -20 C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di essere testati. 2

Procedura Materiali forniti 8 piastre per la titolazione NOVA Gel a T 2 0,4 ml antigene SS-A/SS-B, liofilizzato 1 0,7 ml controllo SS-B 1 0,7 ml controllo SS-A Materiali richiesti ma non forniti Micropipette che rilasciano un volume di 15-100 μl Punte per micropipette monouso Salina allo 0,85% Acqua distillata o deionizzata (preferibilmente sterile) Fonte di luce o cassetta per osservare il gel Metodica 1. Reidratare l antigene SS-A/SS-B Aprire con cura una boccetta con l antigene ed aggiungere 0,4 ml di acqua distillata o deionizzata all antigene liofilizzato. Per ottenere risultati ottimali si raccomanda vivamente di utilizzare acqua distillata o deionizzata sterile. Lasciare riposare l antigene reidratato per 5 minuti e poi mescolarlo accuratamente con movimento rotatorio prima di utilizzarlo. 2. Riempire la piastra in gel Preparare una diluizione doppia seriale del campione del paziente in soluzione salina allo 0,85%. Caricare i pozzetti della piastra in gel con l antigene (approssimativamente 80 μl), con il controllo (approssimativamente 80 μl), e con le diluizioni del campione del paziente (approssimativamente 80 μl) come illustrato qui di seguito. Non è necessario che i volumi di riempimento siano assolutamente esatti, mentre è importante NON FARE TRABOCCARE IL LIQUIDO DAI POZZETTI. I controlli possono essere applicati direttamente con la bottiglia in plastica a spruzzo o con la micropipetta. Se si utilizzano bottiglie a spruzzo, posizionare la punta del dispensatore nel pozzetto e spremere delicatamente fino a riempire il pozzetto quasi fino al bordo. Coprire la piastra immediatamente dopo aver riempito i pozzetti. 3. Incubazione Lasciare incubare la piastra o le piastre coperte a temperatura ambiente per 24 ore, su una superficie stabile e piatta. Esaminare le piastre e rilevare l eventuale presenza di linee di precipitina che si sono formate fra il campione del paziente e l antigene. Esaminare la relazione fra questa linea e le linee di precipitina dei controlli. Riesaminare le piastre dopo 48 ore per verificare se si sono formate altre linee prima di interpretare definitivamente i risultati. Controllo di qualità Per essere sicuri che tutti i reagenti abbiano agito in maniera adeguata e di aver seguito in maniera corretta tutte le procedure, per ogni analisi si dovrebbero effettuare anche le prove con i controlli SS-B e/o SS-A. Si può preparare dell ulteriore siero di controllo formando ed aliquotando un pool di siero umano e conservandolo a < -70 o C. I risultati possono essere considerati validi solo se risulta visibile una linea di precipitina fra i pozzetti dei controlli SS-B e/o SS-A e quelli degli antigeni SS-A/SS-B. 3

Interpretazione dei risultati Per osservare in maniera ottimale le linee di precipitazione, si raccomanda di seguire la seguente procedura: 1. Rimuovere il coperchio della piastra. 2. Mantenere la piastra in una posizione che renda minima la riflessione della superficie del gel. 3. Illuminare la piastra in maniera che la luce arrivi parallela alla superficie del gel. Nota: assicurarsi che la fonte di luce sia coperta da vista diretta. 4. Le linee di precipitina si scorgono in maniera migliore se osservate contro uno sfondo scuro e mantenendo un angolo. 5. Una lente di ingrandimento può essere di aiuto nella osservazione di linee deboli o per distinguere campioni che non presentano identità. Reazione negativa. Un campione viene considerato negativo se dopo 48 ore non si formano linee di precipitina visibili fra i pozzetti del paziente e quello dell antigene. Interpretazione della specificità. Nella doppia diffusione la specificità è determinata notando la relazione fra le linee di precipitina del campione e quelle dei controlli conosciuti. Si possono verificare le seguenti possibilità con il test NOVA Gel TM SS-A/SS-B: Fig. 1: Non-Identità Fig. 2: Identità SS-A Fig. 3: Identità SS-B e SS-A La linea di precipitina del paziente attraversa o mostra non-identità sia con il controllo SS-B che con l SS-A. Ciò sta ad indicare che il paziente reagisce con un antigene ENA diverso dall SS- B o dall SS-A. La linea di precipitina del paziente si fonde o mostra identità con la linea di controllo SS-A. Il paziente ha due linee di precipitina. Una delle linee mostra identità con il controllo SS-B e l altra con il controllo SS-A. Questo paziente presenta autoanticorpi verso entrambi gli antigeni SS-B e SS-A. Limitazioni del test 1. Malgrado in questo tipo di analisi sia una cosa poco probabile per via della diluizione del campione, il fenomeno della prozona è una possibilità. Il fenomeno della prozona si ha quando la quantità di autoanticorpo del paziente è notevolmente in eccesso rispetto alla quantità dell antigene. Ciò fa si che la linea di precipitina si formi sulla facciata del pozzetto dell antigene. Per via di questo fenomeno, per evitare una erronea interpretazione del test come falso negativo, si raccomanda di ripetere l analisi dei campioni che si sospetta siano positivi a diluizioni più alte con soluzione salina 2. Se per la reidratazione dell antigene si utilizza acqua non sterile o contaminata, l antigene potrebbe subire una degradazione immediata o progressiva. In questo caso si potrebbe non formare una linea di precipitina o potrebbe formarsi una linea molto debole. 3. Il controllo SS-B non è monospecifico e potrebbe contenere dell SS-A. 4. I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del paziente e del risultato degli altri test sierologici. 5. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero. 4

Valori attesi Il test a doppia diffusione NOVA Gel TM SS-A/SS-B è stato utilizzato per valutare vari pazienti affetti da malattie del tessuto connettivo nonché 200 donatori di sangue scelti in maniera casuale. I risultati sono riassunti qui di sotto: Gruppo di pazienti Numero Numero di positivi al NOVA Gel ENA Test Positivi SS-B Positivi SS-A LES 105 14 14 Lupus indotto da droghe 24 0 0 Artrite reumatoide 40 0 0 Sclerodermia 24 1 2 Dermatomiosite 14 0 0 Sindrome di Sjogren 14 3 8 Normali 200 0 0 Bibliografía 1. Tan E. Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33:167-239, 1982. 2. Tan E, et. al. The 1982 Revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25:1271-1277, 1982. 3. Casalo SP, Friou GJ, Myers LL. Significance of antibody to DNA in systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7:379-390, 1964. 4. Alexander, EL et al. Ro(SS-A) and La(SS-B) antibodies in the clinical spectrum of Sjogren's Syndrome, J Rheumatol 9:239-246, 1982. 5. Kephart DC et al. Neonatal Lupus Erythematosus: New Serologic Findings, J Invest Derm 77:331-333, 1981. 6. Provost TT et al. Antibodies to cytoplasmic antigens in lupus erythematosus-serologic disease. Arth and Rheum 20:1457-1463, 1977. 7. Maddison PJ, Provost TT, Reichlin M. Serological findings in patients with "ANA negative" systemic lupus erythematosus. Medicine 60:87-93, 1981. 8. Franco HL et al. Autoantibodies directed against sicca syndrome antigens in the neonatal lupus syndrome. J. Am Acad Dermatol 4:67-72, 1981. 9. Alspaugh MA, Tan EM. Serum antibody in rheumatoid arthritis reactive with a cell associated antigen, Arth and Rheum 19:711-719, 1976. 10. Scopelitis E, Biundo JJ and Alspaugh MA. Anti-SS-A antibody and other anti-nuclear antibodies in systemic lupus erythematosus, Arth and Rheum 23:287-293, 1980. 11. Ouchterlony O: Diffusion-in-gel methods for immunological analysis. Prog Allergy 5:1, 1958. 12. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 1999 Fourth Edition (HHS Pub. # (CDC) 93-8395). 5

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