Sezione di Farmacologia, Dipartimento Farmacobiologico Facoltà di Farmacia, Università degli Studi di Bari Aldo Moro Colture cellulari Prof. Diana Conte Prof. Jean-François DESAPHY
COLTURE CELLULARI Sistemi semplificati per mantenere in vitro (ex-vivo) cellule in vita Cellule procariotiche: batteri Cellule eucariotiche: cellule animali o vegetali
Norme di Sicurezza per l uso delle colture cellulari
Norme di Sicurezza per l uso delle colture cellulari Es. Cellule geneticamente modificate Virus altamente infettivi Cellule tumorali
COLTURE CELLULARI Alcuni applicazioni Studi di fenomeni biologici legati alla crescita, differenziamento, e morta cellulare (cancerogenesi, apoptosi, ) Studi di genetica, della struttura e della funzione dei geni Studio dei meccanismi molecolari/cellulari coinvolti nelle funzioni cellulari Strumenti per la biologia molecolare (amplificazione genica, produzione/estrazione di proteine ) Strumenti per test di tossicità (Test di AMES, ) Strumenti per la terapia (Terapia cellulare, cellule staminali, terapia genica, rigenerazione tessutale, produzione di farmaci biotecnologici)
COLTURE CELLULARI Alcuni vantaggi Aspetto etico: permette di ridurre la sperimentazione animale o umana Standardizzazione facile, elevata riproducibilità dei risultati Semplificazione del sistema: meccanismi cellulari e molecolari Semplicità d uso, costi limitati Alcuni svantaggi Semplificazione del sistema: limiti nell applicazione del risultato in vivo Rischi di contaminazione richiedono attenzioni particolari e controllo qualità con relativi costi
CONDIZIONI DI COLTURA Riprodurre al meglio le condizioni fisico-chimiche di sopravivenza delle cellule: fabbisogno energetico: (nutrienti, minerali, ioni, aminoacidi, glucosio, vitamine ) ph, Temperatura, osmolarità Fattori di crescita per favorire la proliferazione cellulare Ormoni ed altre molecole indispensabili per mantenere funzioni cellulari specifiche Protezione Terreni di coltura Strumenti di incubazione celllule AMBIENTE STERILE e CONTROLLATO
SUPPORTI PER COLTURE CELLULARI Fiasche o piastre di vetro o plastica Piastre con pozzetti Supporti sterili vetro a 150 C/autoclavato plastica monouso sterile Supporti per colture di cellule adese Supporti aderenti trattati chimicamente # Coltura in sospensione Permettono scambi gassosi La scelta dipende dal tipo cellulare e dalla quantità di cellule Fiasche col tappo permettono il trasporto al di fuori dell ambiente sterile Beuta per colture di cellule in sospensione nell incubatore ad agitazione
TERRENI DI COLTURA
TERRENI DI COLTURA combustibile Antibiotici per la protezione Fattori di crescita Osmolarità, normale funzione cellulare Sistema tampone del ph: bicarbonate/co 2 Precursori metabolici, numerosi funzioni cellulari Sintesi proteica, precursori metabolici Indicatore colorato del ph giallo acido rosso a ph 7.4 viola basico
Antibiotici (streptomicina/penicillina) Siero Terreno di coltura Sistema filtrante: diametro dei pori 0.22 µm
INCUBATORI Gli incubatori sono strumenti che permettono di mantenere costanti: la temperatura (spesso 37 C) varia in funzione del tipo cellulare e dell organismo originario la concentrazione in anidra carbonica CO 2 l atmosfera interno all incubatore è composto da 5% CO 2 / 95% aria corrisponde alla pressione parziale di CO 2 nei tessuti di mammiferi permette di mantenere il ph a 7.4 con il bicarbonato tasso di umidità saturo
CAPPA A FLUSSO LAMINARE VERTICALE Tavolo da lavoro per la manipolazione delle cellule, attrezzato da una cappa che mantiene la sterilità dell ambiente: 30% 70% FAN Filtro d estrazione HEPA Lampada UV Accesa tra i periodi di attività Filtro di lavoro HEPA High Efficiency Particulate Air aria sterile Operatore cell aria contaminata 30% camicie guanti mascherina
Colture primarie: TIPI DI COLTURA CELLULARI Cellule isolate dall organismo Conservano le proprietà funzionali delle cellule in vivo Sopravivenza limitata a qualche ore Colture secondarie: derivano da colture primarie per divisione Attività funzionale ridotta, de-differenziamento vita limitata Linee cellulari continue cellule in continua proliferazione cellule de-differenziate proprietà pressoché costanti durata illimitata
COLTURE CELLULARI PRIMARIE Organismo (uomo, animale, pianta, embrione) prelievo tessuto (biopsia) o liquido Isolamento, frammentazione del tessuto Dissezione (ferri) Dissociazione Incubazione, Lieve agitazione Enzimi proteolitici (tripsina, collagenasi ) Chelanti del Ca 2+ rottura della matrice extracellulare distacco delle cellule Selezione centrifugazione, gradienti di densità adesione su uno substrato specifico Cell sorter, microdissezione a laser Coltura primaria
Fluorescent cell sorter Microdissezione con laser
COLTURE CELLULARI SECONDARIE La maggior parte delle cellule primarie possono dividersi fino a raggiungimento della confluenza (molte cellule tumorali e staminali vanno oltre) Subcolture (passaggi) Incubazione con tripsina-edta per qualche minuti Agitazione meccanica Ri-sospensione in medium di coltura Semina Colture secondarie
ESPRESSIONE DELLA TELOMERASI Enzima che mantiene e stabilizza i telomeri, strutture che terminano i cromosomi proteggendogli dalla degradazione progressiva che si verifica dopo ogni divisione cellulare. Dopo vari cicli di divisione, i telomeri di una cellula normale si consumano fino ad impedire la replicazione del DNA. La cellula diventa senescente, perde la capacita di dividersi. Nelle cellule germinali, staminali, ed in numerosi cellule maligne, la sovraespressione della telomerasi mantiene i telomeri, permettendo la continua divisione cellulare. 2008 J.F. DESAPHY
IMMORTALIZZAZIONE
LINEE CELLULARI CONTINUE
CONGELAMENTO / SCONGELAMENTO Le sub-colture di linee cellulari favoriscono l insorgenza di mutagenesi spontanea ed aberrazioni cromosomiche Il mantenimento di cellule in coltura costa e non serve durante periodi di inattività Il congelamento è necessario per - risparmiare spazio e costi - limitare l invecchiamento delle cellule Incubazione con tripsin-edta Scongelamento rapido nel cryovial (acqua calda del rubinetto) Ri-sospensione in un terreno specifico (terreno di crescita, 30% siero, 1% DMSO) Aggiunta di terreno di coltura Trasferimento in cryovials Centrifuga (1000 rpm, 5 min) Congelamento a -20 C Eliminazione sovranatante Ri-sospensione del pellet in terreno Conservazione a -180-190 C (azoto liquido o freezer) Semina
Colture primarie Colture cellulari utilizzate nella Sezione di Farmacologia Facoltà di Farmacia, Bari Cellule muscolari scheletriche: Cellule beta pancreatiche: test di tossicità patch-clamp citofluorescenza patch-clamp test di tossicità Linee cellulari continue HEK293 (human embryonic kidney cells) SH-SY5Y (cellule di neuroblastoma umano) C2C12 (cellule satelliti muscolari murine) espressione eterologa di proteine patch-clamp test di tossicità test di tossicità patch-clamp test di tossicità patch-clamp
ESPRESSIONE ETEROLOGA DI PROTEINE Permette di fare esprimere ad una linea cellulare la proteina che si vuole studiare attraverso il trasferimento del gene codificante la proteina (trasfezione genica). Cellule al 70% di confluenza Incubazione per qualche ore Plasmide contenente il cdna codificante la proteina Gene di resistenza ad un antibiotico Trasfezione transitoria Il gene penetra in cellula ma non si integra nel genoma Dopo 24 ore, le cellule esprimono la proteina. Dopo 3-4 giorni, l espressione cessa. Selezione clonale Incubazione con antibiotico Solo le cellule esprimenti il gene di resistenza sopravvivono Trasfezione permanente Il gene si è integrato nel genoma della cellula Il clone deriva da una cellula unica. Sono tutte uguali alla cellula madre, Esprimono tutte la proteina Isolamento di un clone
ESPRESSIONE ETEROLOGA DI PROTEINE Alcuni metodi di trasfezione Trasfezione mediante DEAE-destrano Trasfezione mediante calcio-fosfato (il DNA penetra nel citoplasma per endocitosi e viene trasferito al nucleo) Elettroporazione (impulsi elettrici ad alto voltaggio portano alla formazione di pori in nm nella membrana plasmatica che permettono l ingresso del DNA) Trasfezione mediante liposomi (DNA ed RNA incapsulato in liposomi entrano nella membrana cellulare in seguito a fusione delle d membrane) Microiniezione (trasferimento diretto in vitro), bombardamento con particelle metalliche microscopiche rivestite di DNA (in vivo) Trasduzione impaccamento del DNA all interno dei virus animali
gene del canale ESPRESSIONE ETEROLOGA DI CANALI IONICI Canali ionici PLASMIDE SINTESI PROTEICA recettore di membrana proteina fluorescente gene reporter nucleo Permette di individuare facilmente sotto microscopio le cellule trasfettate La linea cellulare non deve esprimere canali ionici endogeni simili al canale trasfettato Permette di studiare canali ionici umani o animali, senza ricorrere a biopsie Permette di studiare canali mutati (fabbricati in vitro mediante mutagenesi): mutazioni naturali, responsabili di malattia nell uomo: cosa determina la mutazione? (relazione genotipo/fenotipo) la mutazione modifica l azione dei farmaci? (farmacogenetica) mutazioni non naturali : come funziona il canale? (biofisica molecolare) come viene modulata? (fisiologia) dove si lega il farmaco? (farmacologia molecolare)
FINE